CN109055304B - 一种非柱状上皮干细胞培养基及培养方法 - Google Patents

一种非柱状上皮干细胞培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非柱状上皮干细胞培养基，包含以下组分：cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂。本发明还公开了利用所述培养基进行非柱状上皮干细胞培养的方法。本发明所述非柱状上皮干细胞培养基突破现有技术瓶颈，使得长时间单克隆培养成为可能，能够支持层状/假层状/移型上皮等多种非柱状上皮干细胞在体外分离后以细胞池或单细胞形式高效地、稳定地扩增，是实现干细胞病理缺陷鉴定及进行后续功能修复的技术前提，可服务于细胞精准医疗产品的开发和制备。

Description

一种非柱状上皮干细胞培养基及培养方法
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种非柱状上皮干细胞培养基及培养方法。
背景技术
干细胞研究是再生医学发展的重要基础和核心推动力。胚胎干细胞、诱导性干细胞和组织成体干细胞是干细胞研究领域的三大分支。凭借细胞安全性高、易于获取的显著优势，组织成体干细胞越来越多的受到干细胞医学行业的关注。组织成体干细胞进一步下分为间充质干细胞与上皮组织干细胞两大类。其中来源于骨髓、脂肪、脐带等组织的间充质干细胞由于分离培养相对简单，被广泛用于治疗移植抗宿主病、神经系统疾病及关节炎症等方面研究。然而，实质器官疾病的发生与组织修复与其上皮组织干细胞戚戚相关，治疗手段直接依赖于对相应上皮组织干细胞的认知和利用。不同上皮类型的组织干细胞，例如层状/假层状、移型、柱状上皮干细胞等，具有很高的组织忠实度，即专能分化能力，能在体外自觉定向分化为与来源组织细胞组成类型相一致的各类细胞。然而，不同上皮类型的组织干细胞在体外克隆、增殖阶段对培养微环境有不同的喜好与需求。如何营造最契合的体外微环境以支持稳定、高效、便捷的组织干细胞扩增是急需深入探索有待开发的关键技术领域。自此类干细胞1975年被首次发现至今，受限于培养技术条件，行内对上皮组织干细胞的研究和利用仍十分有限，取得关键突破的团队相对集中。
至今已报道的培养技术有以下几种：(1)基于肠道柱状细胞建立的“细胞类器官”organoid culture培养法(Clevers,Cell,2016)；(2)本发明人参与开发的基于肠道干细胞的单克隆培养分化平台(Wang,et al.,Nature,2015)；(3)基于皮肤上皮细胞建立的滋养层细胞培养法(Rheinwald and Green,Cell,1975；Barrandon and Green,PNAS,1987)。其中，细胞类器官培养法是对组织干细胞、中间态细胞、终端分化细胞进行的一种混合培养方式，其优势在于能够由培养系统自发生成干细胞生长所需的大部分分泌蛋白及信号调控因子，模拟体内微环境，适合对不熟悉的组织干细胞进行短期的体外维系。但是，此培养系统无法进行单细胞层面的研究，对了解干细胞的分化潜能、谱系、病理基因缺陷，以及细胞治疗领域的编辑应用等方面操作是很大的制约；利用Dr Green培养法，层状上皮干细胞，以皮肤上皮干细胞与角膜上皮干细胞为代表，能够通过体外扩增完成制备，并分别于1981年和2008年成功用于临床再生。但是对于更多的非柱状上皮干细胞(如呼吸道上皮、泌尿道上皮等)，尤其是其单细胞克隆的体外长期稳定培养仍是瓶颈。
现有培养体系无法对层状/假层状上皮干细胞的体外扩增提供足够长时间的稳定支撑。干细胞克隆在一定次数传代后呈渐减式生长、出现“老化”现象。现有条件难以实现层状/假层状上皮干细胞单细胞克隆及后续有效扩增。此技术平台的空白制约了对不同上皮组织干细胞的持续发掘以及更多新型干细胞治疗产品的开发。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种非柱状上皮干细胞培养基，其使得长时间单克隆培养成为可能，能够支持层状/假层状/移型上皮等多种非柱状上皮干细胞在体外分离后以细胞池或单细胞形式高效地、稳定地扩增。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种非柱状上皮干细胞培养基，包含以下组分：cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂。
所述cFAD培养液包含以下组分：Ham’s F(25％，v/v)、含胎牛血清(10％，v/v)的DMEM(75％，v/v)、IGF(1-10μg/ml)、triiodothyronine(1-10μg/ml)、hydrocortisone(0.1-1μg/ml)和EGF(1-10ng/ml)。
优选地，所述TGFβ通路抑制剂包含以下浓度的组分：1-10μM TGFβ1-4抑制剂和1-10μM ALK抑制剂。
本发明对TGFβ1-4抑制剂的种类并不限制，所有能抑制TGFβ通路的TGFβ1-4抑制剂均在本发明保护范围内，例如LY2157299、SB525334、LY2109761，但不限于此。
本发明对ALK抑制剂的种类并不限制，所有能抑制ALK通路的ALK抑制剂均在本发明保护范围内，例如DMH1、LDN-214117、LDN-193189，但不限于此。
优选地，所述ROCK抑制剂浓度为0.01-5μM。
所述ROCK为Rho相关的卷曲蛋白激酶。
本发明对ROCK抑制剂的种类并不限制，所有能抑制Rho相关的卷曲蛋白激酶的抑制剂均在本发明保护范围内，例如Thiazovivin、GSK429286A、GSK269962A，但不限于此。
本申请发明人发现，包含cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂的非柱状上皮干细胞培养基能显著提高非柱状上皮干细胞的增殖速率、抑制非目的性分化，实现非柱状上皮干细胞的扩增及单细胞克隆培养。
优选地，所述非柱状上皮干细胞培养基还包含以下组分：Wnt通路激活剂和FGF蛋白。
优选地，所述Wnt通路激活剂包含Wnt激活蛋白和/或GSK-3抑制剂；所述Wnt激活剂浓度为0.05-2μg/ml，所述GSK-3抑制剂浓度为0.1-1μg/ml。
所述GSK-3为糖原合成酶激酶-3。
本发明对Wnt激活剂的种类并不限制，所有能激活Wnt通路的Wnt激活剂均在本发明保护范围内，例如Cristin3、RSPO2、Wnt Agonist 1，但不限于此。
本发明对GSK-3抑制剂的种类并不限制，所有能抑制糖原合成酶激酶-3的抑制剂均在本发明保护范围内，例如CHIR-99021、CHIR-98014、LY2090314，但不限于此。
所述FGF为成纤维细胞因子。
优选地，所述FGF蛋白浓度为0.05-2μg/ml。
本申请发明人经过大量的研究和统计分析发现，在cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂基础上增加Wnt通路激活剂和FGF蛋白的非柱状上皮干细胞培养基在用于培养非柱状上皮干细胞时，具有协同增效的作用，干细胞克隆形态、成克隆率、增殖速率经过连续传代后仍然维持良好，无明显细胞老化，培养效果比只含cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂的培养基效果更好，能够更稳定支持非柱状上皮干细胞单细胞克隆的长期体外扩增并且保持干细胞分化潜能。
优选地，所述非柱状上皮干细胞培养基还包含BMP抑制剂。
所述BMP为骨形态发生蛋白。
本发明对BMP抑制剂的种类并不限制，所有能抑制骨形态发生蛋白的抑制剂均在本发明保护范围内。
优选地，所述BMP抑制剂包含头蛋白，所述头蛋白浓度为0.05-2μg/ml。
本发明还提供了一种非柱状上皮干细胞培养方法，包括以下步骤：
(1)采集上皮组织样本，切细后消化、清洗，得到含干细胞的上皮细胞悬浮液；
(2)将步骤(1)获得的上皮细胞悬浮液种植于Swiss 3T3鼠成纤维细胞滋养层上，用cFAD培养液进行原代培养，待细胞贴壁生长后，每周换液2-3次；
(3)原代培养5-15天后，利用所述的非柱状上皮干细胞培养基进行后续扩增及单细胞克隆培养。
优选地，所述步骤(1)中采集上皮组织样本的方式可以为以下任一种：无创液体样本、组织活检钳取、活检刷取、手术切取。
优选地，所述步骤(1)中采集上皮组织样本后存放于组织采集液中；所述组织采集液包含以下组分：含体积比为5％牛血清的DMEM培养基、Penicillin(100units/ml)-Streptomycin(100μg/ml)、两性霉素(Amphotericin B，0.25-1ug/ml)及HEPES 15mM。
优选地，所述步骤(1)中上皮组织样本切细后于蛋白酶中消化30-120分钟。
优选地，所述步骤(1)中上皮组织样本切细消化后使用所述组织采集液进行清洗。
优选地，所述步骤(2)中将上皮细胞悬浮液以10000-20000cells/cm2种植于Swiss3T3鼠成纤维细胞滋养层上。
将上皮细胞悬浮液种植于Swiss 3T3鼠成纤维细胞滋养层上做正向干细胞筛选，选择性地对干细胞进行扩增。
现有技术中非柱状上皮干细胞培养平台的缺失在科学研究与应用转化两个层面上阻碍了干细胞基因编辑技术的实施，是干细胞功能研究及临床治疗产品开发的巨大障碍。本发明提供了一种使得长时间单克隆培养成为可能，能够支持层状/假层状/移型上皮等多种非柱状上皮干细胞在体外分离后以细胞池或单细胞形式高效地、稳定地扩增的培养基及培养方法，能稳定支持Crispr-Cas9基因编辑后的单细胞克隆扩增。通过本发明培养方法进行高通量非柱状上皮干细胞单细胞筛选能够根本解决成体干细胞转染效率低、宿主细胞对病毒嵌入敏感、转染后细胞生长分化能力受限等难题，为Crispr-Cas9编辑技术在成体干细胞领域成功运用奠定了理想平台。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明突破现有技术瓶颈，使得长时间单克隆培养成为可能，能够支持层状/假层状/移型上皮等多种非柱状上皮干细胞在体外分离后以细胞池或单细胞形式高效地、稳定地扩增，是实现干细胞病理缺陷鉴定及进行后续功能修复的技术前提，服务于细胞精准医疗产品的开发和制备；(2)利用本发明培养方法进行高通量非柱状上皮干细胞单细胞筛选能够根本解决成体干细胞转染效率低、宿主细胞对病毒嵌入敏感、转染后细胞生长分化能力受限等难题，为Crispr-Cas9编辑技术在成体干细胞领域成功运用奠定了理想平台；(3)本发明为深入研究个体化细胞功能、鉴别病理缺陷、评估个性化细胞移植疗效等多个方面提供可行性支持，满足目前细胞精准治疗领域的热点需求。
附图说明
图1为本发明非柱状上皮干细胞培养基与cFAD培养液对非柱状上皮干细胞的培养实验结果图，其中，A为cFAD培养液培养结果图；B为本发明实施例1所述非柱状上皮干细胞培养基培养结果图。
图2为在PSM01配方的基础上，增加相关信号通路调控因子的培养条件对非柱状上皮干细胞的培养实验结果图。
图3为非柱状上皮干细胞在优选的培养条件下继续传代培养2代的实验结果图。
图4为非柱状上皮干细胞在优选的培养条件下继续传代培养3代的实验结果图。
图5为在PSM02条件下连续传代扩增的细胞进行分化功能鉴定结果图，其中，纤毛细胞/杯状细胞染色结果图中，白色代表纤毛细胞，灰色代表杯状细胞。
图6为非柱状上皮干细胞在PSM02-B、PSM02-T和PSM02-B-T条件下培养结果图。
图7为非柱状上皮干细胞在PSM02-B、PSM02-T和PSM02-B-T条件下培养的扩增细胞功能鉴定结果图，其中，白色代表纤毛细胞，灰色代表杯状细胞。
图8为PSM03培养基对病毒转染后非柱状上皮干细胞单细胞克隆培养结果图。
图9为PSM03培养基对哮喘患者来源非柱状上皮干细胞单细胞克隆培养结果图。
图10为PSM03培养基对哮喘患者来源非柱状上皮干细胞单细胞克隆分化功能鉴定结果图，其中，白色代表纤毛细胞，灰色代表杯状细胞。
图11为PSM03培养基对Crispr-Cas9基因编辑后非柱状上皮干细胞进行单细胞克隆培养结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明非柱状上皮干细胞培养基的一种实施例，包含以下组分：cFAD培养液、6μMTGFβ1-4抑制剂LY2157299、3.5μM ALK抑制剂DMH1和5μM ROCK抑制剂Thiazovivin。
所述cFAD培养液包含以下组分：Ham’s F(25％，v/v)、含胎牛血清(10％，v/v)的DMEM(75％，v/v)、IGF(1-10μg/ml)、triiodothyronine(1-10μg/ml)、hydrocortisone(0.1-1μg/ml)和EGF(1-10ng/ml)。
实施例2
本发明非柱状上皮干细胞培养基的一种实施例，包含以下组分：cFAD培养液、10μMTGFβ1-4抑制剂SB525334、5μM ALK抑制剂LDN-214117、1.5μMROCK抑制剂GSK429286A和0.05μg/ml头蛋白。
所述cFAD培养液包含以下组分：Ham’s F(25％，v/v)、含胎牛血清(10％，v/v)的DMEM(75％，v/v)、IGF(1-10μg/ml)、triiodothyronine(1-10μg/ml)、hydrocortisone(0.1-1μg/ml)和EGF(1-10ng/ml)。
实施例3
本发明非柱状上皮干细胞培养基的一种实施例，包含以下组分：cFAD培养液、3.5μM TGFβ1-4抑制剂LY2109761、7μM ALK抑制剂LDN-193189、0.08μMROCK抑制剂GSK269962A和2μg/ml头蛋白。
所述cFAD培养液包含以下组分：Ham’s F(25％，v/v)、含胎牛血清(10％，v/v)的DMEM(75％，v/v)、IGF(1-10μg/ml)、triiodothyronine(1-10μg/ml)、hydrocortisone(0.1-1μg/ml)和EGF(1-10ng/ml)。
实施例4
本发明非柱状上皮干细胞培养基的一种实施例，包含以下组分：cFAD培养液、1μMTGFβ1-4抑制剂SB525334和10μM ALK抑制剂LDN-193189、0.01μMROCK抑制剂GSK269962A、1μg/ml Wnt激活剂Cristin3、0.6μg/ml GSK-3抑制剂CHIR-99021和0.05μg/ml FGF蛋白。
所述cFAD培养液包含以下组分：Ham’s F(25％，v/v)、含胎牛血清(10％，v/v)的DMEM(75％，v/v)、IGF(1-10μg/ml)、triiodothyronine(1-10μg/ml)、hydrocortisone(0.1-1μg/ml)和EGF(1-10ng/ml)。
实施例5
本发明非柱状上皮干细胞培养基的一种实施例，包含以下组分：cFAD培养液、1.8μM TGFβ1-4抑制剂SB525334和9μM ALK抑制剂LDN-193189、3.5μMROCK抑制剂Thiazovivin、0.05μg/ml Wnt激活剂RSPO2、1μg/ml GSK-3抑制剂CHIR-98014和0.3μg/ml FGF蛋白。
所述cFAD培养液包含以下组分：Ham’s F(25％，v/v)、含胎牛血清(10％，v/v)的DMEM(75％，v/v)、IGF(1-10μg/ml)、triiodothyronine(1-10μg/ml)、hydrocortisone(0.1-1μg/ml)和EGF(1-10ng/ml)。
实施例6
本发明非柱状上皮干细胞培养基的一种实施例，包含以下组分：cFAD培养液、8.5μM TGFβ1-4抑制剂LY2109761和1μM ALK抑制剂LDN-214117、2.5μMROCK抑制剂Thiazovivin、2μg/ml Wnt激活剂Wnt Agonist 1、0.1μg/ml GSK-3抑制剂LY2090314、2μg/ml FGF蛋白和0.5μg/ml头蛋白。
所述cFAD培养液包含以下组分：Ham’s F(25％，v/v)、含胎牛血清(10％，v/v)的DMEM(75％，v/v)、IGF(1-10μg/ml)、triiodothyronine(1-10μg/ml)、hydrocortisone(0.1-1μg/ml)和EGF(1-10ng/ml)。
实施例7
本发明非柱状上皮干细胞培养方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)上皮组织样本以活检钳取形式采集后存放于组织采集液中，组织样本切细后于蛋白酶中消化100分钟，用所述采集液清洗数次，得到含干细胞的上皮细胞悬浮液；
(2)将步骤(1)获得的上皮细胞悬浮液以13000cells/cm2种植于已预先铺好的且已做生长抑制处理的Swiss 3T3鼠成纤维细胞滋养层上，用cFAD培养液进行原代培养，待细胞贴壁生长后，每周换液2-3次；
(3)原代培养5-15天后，利用实施例1所述的非柱状上皮干细胞培养基进行后续扩增及单细胞克隆培养。
所述采集液包含以下组分：含体积比为5％牛血清的DMEM培养基、双抗、两性霉素及15mM缓冲液。
实施例8
本发明非柱状上皮干细胞培养方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)呼吸道上皮组织样本以手术切取形式采集后存放于组织采集液中，组织样本切细后于蛋白酶中消化50分钟，用所述采集液清洗数次，得到含干细胞的上皮细胞悬浮液；
(2)将步骤(1)获得的上皮细胞悬浮液以16000cells/cm2种植于已预先铺好的且已做生长抑制处理的Swiss 3T3鼠成纤维细胞滋养层上，用cFAD培养液进行原代培养，待细胞贴壁生长后，每周换液2-3次；
(3)原代培养5-15天后，利用实施例2所述的非柱状上皮干细胞培养基进行后续扩增及单细胞克隆培养。
所述采集液包含以下组分：含体积比为5％牛血清的DMEM培养基、双抗、两性霉素及15mM缓冲液。
实施例9
本发明非柱状上皮干细胞培养方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)呼吸道上皮组织样本以活检刷取形式采集后存放于组织采集液中，组织样本切细后于蛋白酶中消化120分钟，用所述采集液清洗数次，得到含干细胞的上皮细胞悬浮液；
(2)将步骤(1)获得的上皮细胞悬浮液以10000cells/cm2种植于已预先铺好的且已做生长抑制处理的Swiss 3T3鼠成纤维细胞滋养层上，用cFAD培养液进行原代培养，待细胞贴壁生长后，每周换液2-3次；
(3)原代培养5-15天后，利用实施例4所述的非柱状上皮干细胞培养基进行后续扩增及单细胞克隆培养。
所述采集液包含以下组分：含体积比为5％牛血清的DMEM培养基、双抗、两性霉素及15mM缓冲液。
实施例10
本发明非柱状上皮干细胞培养方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)呼吸道上皮组织样本以无创液体形式采集后存放于组织采集液中，组织样本切细后于蛋白酶中消化30分钟，用所述采集液清洗数次，得到含干细胞的上皮细胞悬浮液；
(2)将步骤(1)获得的上皮细胞悬浮液以20000cells/cm2种植于已预先铺好的且已做生长抑制处理的Swiss 3T3鼠成纤维细胞滋养层上，用cFAD培养液进行原代培养，待细胞贴壁生长后，每周换液2-3次；
(3)原代培养5-15天后，利用实施例6所述的非柱状上皮干细胞培养基进行后续扩增及单细胞克隆培养。
所述采集液包含以下组分：含体积比为5％牛血清的DMEM培养基、双抗、两性霉素及15mM缓冲液。
实施例11
本实施例以实施例1中培养基为例，研究本发明非柱状上皮干细胞培养基与cFAD培养液对非柱状上皮干细胞的培养效果。
(一)实验方法
设置实验组1和对照组1，其中，实验组1利用实施例7所述方法进行非柱状上皮干细胞培养，对照组1除了步骤(3)中原代培养后，继续利用cFAD培养液进行后续扩增及单细胞克隆培养外，其他培养步骤同实验组1。
(2)实验结果
实验结果如表1和图1所示，根据细胞形态、生长速度、成克隆效率等指标做出近两代的评分。
表1各组培养条件培养5代的实验结果汇总
Figure BDA0001767806980000111
由表1和图1可知，本发明培养基(实验组1)能显著提高呼吸道上皮干细胞增殖速率、抑制非目的性分化，实现非柱状上皮干细胞的扩增及单细胞克隆培养；而呼吸道上皮干细胞在cFAD培养液(对照组1)中难以稳定快速增殖，干细胞特征容易丧失。
本申请发明人经过大量的实验发现，在cFAD培养液的基础上增加TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂的非柱状上皮干细胞培养基能显著提高非柱状上皮干细胞的增殖速率、抑制非目的性分化，实现非柱状上皮干细胞的扩增及单细胞克隆培养。
实施例12
本申请发明人经过大量的研究和分析发现，在cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂基础上增加信号通路的调控因子，可以产生协同、增效作用，产生更好的非柱状上皮干细胞单克隆培养效果。
(一)实验方法
本实施例中将含cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂的培养基命名为PSM01，在PSM01配方的基础上，增加以下信号通路的调控因子：0.05-2μg/ml BMP抑制剂头蛋白(B)、0.1-1μM Notch激活剂JAG(J)、Wnt通路激活剂0.05-2μg/ml Wnt激活蛋白和0.1-1μg/ml GSK-3抑制剂(R)、0.1-1μg/mlWnt亚型通路激活剂(W3a)、0.05-2μg/ml FGF蛋白(F)、1-10μM Hedgehog激动剂SAG(S)、1-10μM Hedgehog抑制剂Cyclopamine(C)、0.1-1μg/mlWnt亚型通路激活剂Wnt4(W4)、1-10mM Sirt1抑制剂NAM(N)。设计如表2所示实验组：
表2实验组别设计
Figure BDA0001767806980000121
Figure BDA0001767806980000131
各实验组除了步骤(3)中原代培养后，继续利用表2中相应培养条件的培养基进行后续扩增及单细胞克隆培养外，其他培养步骤同实施例10。
(二)实验结果
实验结果表3和图2所示，其中，近两代的评分标准同实施例11。
表3各组培养条件下培养5代的实验结果汇总
Figure BDA0001767806980000132
表中，na表示未对细胞进行计数。
根据以上结果，添加有成分N的培养条件不参与后续测试，因为此类培养条件容易引起细胞老化，克隆出现“戴帽”生长，细胞增殖减缓。综合评分，实验组2～7的培养条件继续传代，进入下轮测试，继续传代培养2代。
实验组2～7的培养条件继续传代培养2代的结果如表4和图3所示，其中，近两代的评分标准同实施例11。
表4各组培养条件下继续培养2代的实验结果
Figure BDA0001767806980000141
根据以上结果，添加有成分J的测试条件不参与后续测试，因为此培养条件容易引起细胞老化，克隆出现“戴帽”生长，并且对滋养层细胞状态有影响；添加有成分S或C的测试条件不参与后续测试，因为S和C作为同一信号通路的激动剂和拮抗剂，在细胞培养中未体现明显对立效果，说明此信号通路对细胞增殖无显著调控作用。综合以上，实验组3～5的培养条件继续传代，进入下轮测试，同时增加条件PSM01+R+F+B(实验组12)和PSM01+W3a+F+B(实验组13)进入下轮测试，继续传代培养3代。
实验组3～5和实验组12～13的培养条件继续传代培养3代的结果如表5和图4所示，其中，近两代的评分标准同实施例11。
表5各组培养条件下继续培养3代的实验结果
Figure BDA0001767806980000151
综合以上系列筛选，PSM01+R+F+B培养条件(实验组12)，即含有cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂、ROCK抑制剂、BMP抑制剂、Wnt通路激活剂和FGF蛋白的非柱状上皮干细胞培养基最能满足单细胞克隆长期稳定扩增的培养需求，将此条件命名为PSM02。
为鉴定培养环境是否能够很好维持干细胞分化潜能，对PSM02条件下连续传代扩增的细胞进行分化功能鉴定，结果如图5所示，结果显示扩增的细胞具有良好分化潜能，体现出理想的组织忠实度。
为了对PSM02配方所包含的成分进行必要性验证，设计实验组16～18，具体如表6所示，其中T为TGFβ通路抑制剂：
表6实验组别设计
Figure BDA0001767806980000152
Figure BDA0001767806980000161
利用表6中的培养条件对非柱状上皮干细胞进行培养，结果如图6所示。结果表明，PSM02培养条件下，细胞大小均一、排列紧密、增殖稳定；PSM02-B培养条件下，细胞大小均一、排列紧密、增殖稳定；PSM02-T培养条件下，细胞大小不均、局部排列疏松、增殖速率不等；PSM02-B-T培养条件下，细胞大小不均、局部排列疏松、增殖速率不等。说明通路调控因子B(BMP抑制剂)的添加必要性不充分，去除后细胞增殖速率、克隆形态等未见明显影响；但成分T对细胞增殖速率、克隆形等有明显影响，不能去除。对各对比条件下扩增的细胞做功能鉴定，通路调控因子B去除后细胞分化效率与PSM02所培养细胞一致(图7)。因此，确定PSM02-B培养条件(实验组16)，即含有cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂、ROCK抑制剂、Wnt通路激活剂和FGF蛋白的非柱状上皮干细胞培养基是呼吸道非柱状上皮干细胞单克隆培养的最佳条件，将其命名为PSM03。
综上所述，本申请发明人经过大量的研究和统计分析发现，在cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂基础上增加Wnt通路激活剂和FGF蛋白的非柱状上皮干细胞培养基在用于培养非柱状上皮干细胞时，具有协同增效的作用，干细胞克隆形态、成克隆率、增殖速率经过连续传代后仍然维持良好，无明显细胞老化，培养效果比只含cFAD培养液、TGFβ通路抑制剂和ROCK抑制剂的培养基效果更好，能够更稳定支持非柱状上皮干细胞单细胞克隆的长期体外扩增并且保持干细胞分化潜能。
实施例13
本实施例研究PSM03培养基在对病毒转染后非柱状上皮干细胞、患者来源非柱状上皮干细胞以及Crispr-Cas9基因编辑后非柱状上皮干细胞进行单细胞克隆过程中的支持作用。
病毒感染呼吸道上皮细胞，流式分选出GFP标记的病毒转染后单细胞，培养于96孔或384孔细胞培养板中。非柱状上皮干细胞单克隆于分选后10天内出现，在PSM03培养条件下，经过多次传代，干细胞单克隆仍显示强健的扩增能力，干性维持良好，无老化现象(图8)。
哮喘患者呼吸道钳取微量组织，经原代培养形成细胞池后，使用流式细胞分选仪分选单细胞，培养于96孔或384孔细胞培养板中。如图9所示，在PSM03培养条件下，非柱状上皮干细胞单克隆于分选后10天内出现，显示强健的扩增能力，干性维持良好，无老化现象。单细胞克隆与分化功能鉴定结果如图10所示，哮喘患者非柱状上皮干细胞以单细胞克隆形式在PSM03条件下稳定扩增，能够用于体外微器官构建等功能鉴定研究。本发明培养基和培养方法为深入研究个体化细胞功能、鉴别病理缺陷、评估个性化细胞移植疗效等多个方面提供可行性支持，满足目前细胞精准治疗领域的热点需求。
Crispr-Cas9基因编辑后非柱状上皮干细胞在PSM03培养条件下培养结果如图11所示，结果表明，PSM03培养条件亦能稳定支持Crispr-Cas9基因编辑后非柱状上皮干细胞单细胞克隆扩增。通过本发明培养基和培养方法进行高通量单细胞筛选能够根本解决成体干细胞转染效率低、宿主细胞对病毒嵌入敏感、转染后细胞生长分化能力受限等难题，为Crispr-Cas9编辑技术在成体干细胞领域成功运用奠定了理想平台。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，由以下组分组成：cFAD培养液、6μM TGFβ1-4抑制剂LY2157299、3.5μM ALK抑制剂DMH1和5μM ROCK抑制剂Thiazovivin；
所述cFAD培养液由以下组分组成：25% (v/v) Ham’s F-12、75%(v/v) 含10%(v/v)的胎牛血清的DMEM、浓度为1-10μg/ml IGF、浓度为1-10μg/ml triiodothyronine、浓度为0.1-1μg/ml hydrocortisone和浓度为1-10ng/ml EGF。
2.一种非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，由以下组分组成：cFAD培养液、6μM TGFβ1-4抑制剂LY2157299、3.5μM ALK抑制剂DMH1、5μM ROCK抑制剂Thiazovivin、Wnt通路激活剂和FGF蛋白；
所述cFAD培养液由以下组分组成：25%(v/v) Ham’s F-12、75%(v/v) 含10% (v/v)的胎牛血清的DMEM、浓度为1-10μg/ml IGF、浓度为1-10μg/ml triiodothyronine、浓度为0.1-1μg/ml hydrocortisone和浓度为1-10ng/ml EGF。
3.根据权利要求2所述的非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，所述Wnt通路激活剂是Wnt激活蛋白和/或GSK-3抑制剂；所述Wnt激活剂浓度为0.05-2μg/ml，所述GSK-3抑制剂浓度为0.1-1μg/ml。
4.根据权利要求2所述的非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，所述FGF蛋白浓度为0.05-2μg/ml。
5.一种非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，由以下组分组成：cFAD培养液、6μM TGFβ1-4抑制剂LY2157299、3.5μM ALK抑制剂DMH1、5μM ROCK抑制剂Thiazovivin、Wnt通路激活剂、FGF蛋白和BMP抑制剂；
所述cFAD培养液由以下组分组成：25% (v/v) Ham’s F-12、75%(v/v) 含10% (v/v)的胎牛血清的DMEM、浓度为1-10μg/ml IGF、浓度为1-10μg/ml triiodothyronine、浓度为0.1-1μg/ml hydrocortisone和浓度为1-10ng/ml EGF。
6.根据权利要求5所述的非柱状上皮干细胞培养基，其特征在于，所述BMP抑制剂是头蛋白，所述头蛋白浓度为0.05-2μg/ml。
7.一种非柱状上皮干细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采集上皮组织样本，切细后消化、清洗，得到含干细胞的上皮细胞悬浮液；
（2）将步骤（1）获得的上皮细胞悬浮液种植于Swiss 3T3鼠成纤维细胞滋养层上，用cFAD培养液进行原代培养，待细胞贴壁生长后，每周换液2-3次；
（3）原代培养5-15天后，利用权利要求1~6任一项所述的非柱状上皮干细胞培养基进行后续扩增及单细胞克隆培养；
所述cFAD培养液由以下组分组成：25%(v/v) Ham’s F-12、75%(v/v) 含10%(v/v)的胎牛血清的DMEM、浓度为1-10μg/ml IGF、浓度为1-10μg/ml triiodothyronine、浓度为0.1-1μg/ml hydrocortisone和浓度为1-10ng/ml EGF。
8.根据权利要求7所述的非柱状上皮干细胞培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中将上皮细胞悬浮液以10000-20000 cells/cm2种植于Swiss 3T3鼠成纤维细胞滋养层上。
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