CN105026552A

CN105026552A - 上皮干细胞的液体培养

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Publication number: CN105026552A
Application number: CN201480010196.0A
Authority: CN
Inventors: B·比艾斯
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-02-25
Filing date: 2014-02-25
Publication date: 2015-11-04
Also published as: BR112015017977A2; JP2016512958A; EP2958991A1; BR112015017977A8; MX2015010844A; RU2015140912A; CA2900561A1; WO2014131033A1; US20150361392A1; KR20150123805A; HK1216904A1

Abstract

本文提供在细胞培养基中培养上皮干细胞和包含上皮干细胞的组织碎片的方法。

Description

上皮干细胞的液体培养

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年2月25日提交的美国专利申请号61/769,076的优先权，该美国专利申请以其整体引入作为参考。

技术领域

本文提供在细胞培养基中培养上皮干细胞和含有上皮干细胞的组织碎片(tissue fragment)的方法。

背景技术

小肠上皮每2至5天更新，使它成为再生性最强的哺乳动物组织之一。已基于定位和循环动态描述了小肠中的两类干细胞。参见例如Barker等,Nature 449,1003–1007(2007)；Sangiorgi,E.&Capecchi,M.R.NatureGenet.40,915–920(2008)；Li,L.&Clevers,H.Science 327,542–545(2010)。快循环干细胞表达包括Lgr5、Cd133(也称为Prom1)和Sox9的标记，且存在于整个肠中。参见Zhu,L.等,Nature 457,603–607(2009)；Furuyama,K.等,Nature Genet.43,34–41(2011)。这些细长细胞(也称为隐窝基底柱状细胞(CBC))3天内在隐窝和绒毛内繁殖，并散布在支持它们的帕内特细胞间。参见Sato,T.等,Nature 469,415–418(2011)；Cheng,H.&Leblond,C.P.,Am.J.Anat.141,537–561(1974)。以Bmi1或小鼠Tert(mTert)的富集表达为标记的慢循环干细胞代表更稀少的细胞群体。参见Sangiorgi,E.&Capecchi,M.R.Nature Genet.40,915–920(2008)。这些细胞从肠的近端区域至远端区域形成递减梯度，使得它们在十二指肠中比在结肠中更普遍存在。尽管它们稀少，但表达Bmi1的干细胞对隐窝维持至关重要。

已描述了用于培养包括肠上皮干细胞的原代上皮干细胞的多种培养系统(Bjerknes和Cheng,Methods Enzymol 419,337-83(2006)；及Sato等,Nature 459,262-265(2009))。迄今为止，培养系统倚赖于用固体胞外基质来培养原代上皮干细胞。之前的研究已表明，固体胞外基质对维持上皮干细胞的多能性和保持已从结肠或肠分离的隐窝的基本隐窝-绒毛生理学是必要的(参见例如WO2010/090513)。已显示用ECM培养干细胞增强了干细胞的长期存活和未分化干细胞的持续存在。之前，在缺乏ECM的情况下，干细胞培养基不能较长时期培养，且未观察到未分化干细胞的持续存在。此外，ECM的存在允许培养在缺乏ECM的情况下不能培养的三维组织类器官(organoid)。但是，由于该培养系统的固体性质，对可用该培养系统研究的测试和诊断化合物的类型存在大小限制(例如，大分子不能扩散入固体基质)。此外，由于细胞和高级结构包埋在固体基质中，分析细胞和高级结构的容易程度降低(例如，必须从固体基质剖出高级结构(例如类器官)进行分析)。需要更好的上皮干细胞(尤其是肠上皮干细胞)培养系统，该培养系统保持上皮干细胞的生理学结构，维持上皮干细胞的多能性，并保持类器官的基本生理学，同时增加测试和诊断化合物的类型及分析的容易程度。

发明概述

本文提供用于液体培养干细胞的方法。具体而言，本文提供用于液体培养(a)上皮干细胞和/或(b)分离的包含上皮干细胞的上皮组织碎片的方法，该方法包括在液体细胞培养基(liquid cell culture)中孵育上皮干细胞和/或分离的组织碎片，该液体细胞培养基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向该基础培养基加入(i)骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、(ii)促细胞分裂生长因子、(iii)Wnt激动剂和(iv)至少约4％w/v的胞外基质(ECM)。此外，本文提供用于获得和/或培养隐窝的方法，该方法包括在液体细胞培养基中孵育上皮干细胞和/或分离的组织碎片，该液体细胞培养基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向该基础培养基加入(i)骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、(ii)促细胞分裂生长因子、(iii)Wnt激动剂和(iv)至少约4％w/v的胞外基质(ECM)。

在任意方法的一些实施方案中，该BMP抑制剂是头蛋白、DAN和/或DAN样蛋白，包括Cerberus和Gremlin。在一些实施方案中，该BMP抑制剂是头蛋白。在一些实施方案中，该BMP抑制剂在该液体细胞培养基中的浓度在约5和约500ng/ml之间(例如约50至约100ng/mL)。

在任意方法的一些实施方案中，该Wnt激动剂是Wnt、R-spondin(RSPO)、Norrin和/或GSK抑制剂。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSPO。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSPO1。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSPO2。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSPO3。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是RSPO4。在一些实施方案中，该Wnt激动剂在该液体细胞培养基中的浓度在约500ng/mL和约5μg/ml之间(例如约500至约1500ng/mL)。

在任意方法的一些实施方案中，该促细胞分裂生长因子是上皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)和角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些实施方案中，该促细胞分裂生长因子是EGF。在一些实施方案中，该促细胞分裂生长因子在该液体细胞培养基中的浓度在约5和约500ng/ml之间(例如约5至约50ng/mL)。

在任意方法的一些实施方案中，该ECM是低生长因子ECM(growthfactor reduced ECM)。在一些实施方案中，该ECM是基质胶。在一些实施方案中，该ECM在该液体细胞培养基中的浓度在约4％至约10％w/v之间。在任意方法的一些实施方案中，该方法包括悬滴培养。

在任意方法的一些实施方案中，该培养基进一步包含Rock(Rho激酶)抑制剂。

在任意方法的一些实施方案中，该培养基进一步包含Notch激动剂。

在任意方法的一些实施方案中，该上皮干细胞和/或上皮组织碎片是胃肠干细胞和/或胃肠组织碎片。在一些实施方案中，该胃肠干细胞和/或胃肠组织碎片是小肠干细胞和/或小肠组织碎片。

本文还提供可通过本文所述的方法获得的隐窝及该隐窝在药物发现筛选、毒性测定中或在再生医学中的用途。

附图简述

图1A-B.(A)源自Lgr5^DTREGFP小鼠的类器官在隐窝样结构中显示膜GFP(Lgr5阳性干细胞)和溶菌酶染色(帕内特细胞，箭头)。(B)光学横截面。

图2A-D.在存在(B、B-1、D)或缺乏(A、A-1、C)白喉毒素(DT)的情况下培养源自Lgr5^DTREGFP小鼠的类器官10天。隐窝样结构和溶菌酶阳性细胞保持在DT处理的类器官中(B、B-1)。类器官在DT的存在下持续增殖(D)。

图3A-D.在多种浓度的基质胶中培养源自Lgr5^DTREGFP小鼠的类器官。

发明详述

I.定义

术语“多肽”在本文中指天然序列多肽、多肽变体及天然序列多肽和多肽变体(其在本文中进一步定义)的片段。本文所述的多肽可以是分离自多种来源(如分离自人组织类型或分离自另一来源)或通过重组方法或合成方法制备的多肽。

“天然序列多肽”包含与源自自然界的相应多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。

“多肽变体”或其变形意指本文定义的多肽，通常为活性多肽，其与本文公开的任意天然序列多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性。这类多肽变体包括，例如，其中在天然氨基酸序列的N-或C-端添加或缺失了一个或多个氨基酸残基的多肽。通常，多肽变体将与本文公开的天然序列多肽序列具有至少约80％氨基酸序列同一性，备选地，至少约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。通常，变体多肽长度为至少约10个氨基酸，备选地，长度为至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600个氨基酸，或更长。可选地，与天然多肽序列相比，变体多肽将具有不超过一个保守氨基酸取代，备选地，与天然多肽序列相比不超过2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代。

“分离的”指已从其天然环境的成分分开的多肽、抗体、核酸等。在抗体的一些实施方案中，将抗体纯化至通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反向HPLC)测定的纯度大于95％或99％。用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示希望的抗原结合活性。

就参考多肽序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口来达到最大百分比序列同一性，而不将任意保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以以本领域技术之内的多种方式来达到以测定百分比氨基酸序列同一性为目的的比对，例如，使用公开可得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长内达到最大比对所需的任意算法。但是，为了本文的目的，用序列比较计算机程序ALIGN-2来产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，源代码已随用户文件提交美国版权办公室,Washington D.C.,20559，它在美国版权办公室注册在美国版权注册号TXU510087之下。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South SanFrancisco,California公开可得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应编译用在UNIX操作系统上，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变动。

在利用ALIGN-2来进行氨基酸序列比较的情况下，按以下计算给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以备选地叙述为，具有或包含与给定氨基酸序列B的某％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)：

100乘以分数X/Y

其中X是在该程序的A和B的比对中通过序列比对程序ALIGN-2评分为相同的匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是用ALIGN-2计算机程序按前一段落中所述获得。

本领域普通技术人员可以容易地测定杂交反应的“严格性”，其一般是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。一般而言，较长的探针需要较高的温度进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。在互补链存在于低于它们的解链温度的环境中时，杂交一般取决于变性DNA再退火的能力。所希望的探针与可杂交序列间的同源性程度越高，可以使用的相对温度越高。结果，它遵循较高的相对温度将趋向于使得反应条件更严格，而较低的相对温度将趋向于使得反应条件更不严格。杂交反应的严格性的其他详情和解释参见Ausubel等,Current Protocols in MolecularBiology,Wiley Interscience Publishers,(1995)。

通过以下那些来鉴别本文所定义的“严格条件”或“高严格性条件”：(1)利用低离子强度和高温进行洗涤，例如，0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠于50℃；(2)杂交期间利用变性剂，如甲酰胺，例如，含0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠的pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液的50％(v/v)甲酰胺于42℃；或(3)在利用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt's溶液、超声处理的鲑精DNA(50μg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖的溶液中42℃过夜杂交，在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中42℃洗涤10分钟，然后是由含EDTA的0.1×SSC、55℃组成的10分钟高严格性洗涤。

可以按照Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press,1989所述鉴定“中等严格条件”，且其包括使用严格性低于上文所述的那些的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的实例是在包含20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt's溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切鲑精DNA的溶液中37℃过夜孵育，然后在约37-50℃下在1×SSC中洗涤滤膜。熟练的技术人员将理解如何根据需要调节温度、离子强度等，以适应诸如探针长度等的因素。

“组织样品”或“组织碎片”意指从对象或个体的组织获得的相似的细胞的收集。组织样品或组织碎片的来源可以是固体组织，如来自新鲜、冷冻和/或保藏的器官、组织样品、活检组织和/或吸出物；血液或任意血液组分，如血浆；体液，如脑脊液、羊水、腹水或组织液；来自个体妊娠或发育的任意时间的细胞。组织样品或组织碎片也可以是原代或培养的细胞或细胞系。可选地，组织样品或组织碎片获自患病组织/器官。组织样品可以包含并非在自然界中与组织天然混合的化合物，如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等。

本文所用的“参考样品”、“参考细胞”、“参考组织”、“对照样品”、“对照细胞”或“对照组织”指用于比较目的的样品、细胞、组织、标准或水平。在一个实施方案中，参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自同一对象或个体的身体的健康和/或未患病部分(例如组织或细胞)。例如，邻近患病细胞或组织的健康和/或未患病细胞或组织(例如邻近肿瘤的细胞或组织)。在另一实施方案中，参考样品获自同一对象或个体的身体的未处理组织和/或细胞。还在另一实施方案中，参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自不是该对象或个体的个体的身体(例如组织或细胞)的健康和/或未患病部分。还在另一实施方案中，参考样品、参考细胞、参考组织、对照样品、对照细胞或对照组织获自不是该对象或个体的个体的身体的未处理组织和/或细胞。

本文所用的术语“基本相同”指两个数值之间的相似度足够高，使得本领域技术人员可认为两个值之间的差异在通过该值(例如Kd值或抑制)测量的生物学特征的背景内几乎没有或没有生物学和/或统计学意义。作为参考/比较值的函数，两个值之间的差异例如小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％和/或小于约10％。

本文所用的短语“实质性不同的”指两个数值之间的差异程度足够高，使得本领域技术人员可认为两个值之间的差异在通过该值(例如Kd值或抑制)测量的生物学特征的背景内具有统计学意义。作为参考/比较分子的值的函数，两个值之间的差异例如大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％和/或大于约50％。

药物的“有效量”指在必要的剂量和时间下对达到希望的治疗或预防结果有效的量。

“患者”、“个体”或“对象”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类，如猴)、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，该患者、个体或对象是人。

“降低或抑制”意指引起20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更大的整体减少的能力。降低或抑制可以指所治疗的障碍的症状、转移的存在或大小、或原发性肿瘤的大小。

如本领域技术人员所理解，本文提到“约”某个值或参数包括(和描述)指向该值或参数本身的实施方案。例如，提到“约X”的描述包括“X”的描述。

应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括由该方面和实施方案组成和/或基本由该方面和实施方案组成。除非另有说明，本文所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。

II.方法和用途

本文提供用于液体培养干细胞的方法。本文提供在液体中培养上皮干细胞和来自含有上皮干细胞的小肠、结肠、胃和胰的分离碎片，同时保持保留了未分化表型和自维持能力的干细胞的存在的方法。例如，按照本文所述方法培养的分离的隐窝发育为隐窝-绒毛类器官，该类器官包含以绒毛样上皮为衬里的中央腔。所得到的类器官经历了多重隐窝分裂事件。令人惊奇地，本文提供的方法允许使单个分离的上皮干细胞在低水平胞外基质的存在下在细胞培养基中派生为隐窝-绒毛类器官。分离自胃幽门区的胃碎片表现得如肠隐窝类器官：在低水平胞外基质中，该单元开放的上部封闭，腔内充满凋亡细胞，类器官经历持续的出芽事件(表明腺体分裂)，同时维持其具有中央腔的极性。

具体而言，本文提供用于液体培养(a)上皮干细胞和/或(b)分离的包含上皮干细胞的上皮组织碎片的方法，该方法包括在液体细胞培养基中孵育上皮干细胞和/或分离的组织碎片，该液体细胞培养基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向该基础培养基加入(i)骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、(ii)促细胞分裂生长因子、(iii)Wnt激动剂和(iv)至少约4％w/v的胞外基质(ECM)。此外，本文提供用于获得和/或培养隐窝的方法，该方法包括在液体细胞培养基中孵育上皮干细胞和/或分离的组织碎片，该液体细胞培养基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向该基础培养基加入(i)骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、(ii)促细胞分裂生长因子、(iii)Wnt激动剂和(iv)至少约4％w/v的胞外基质(ECM)。

干细胞见于成体动物的许多器官中，保留未分化表型，它们的后代可以向存在于相关组织中的所有谱系分化，它们终生保留自维持能力，且它们能够在损伤后再生相关组织。干细胞驻留于特化位置干细胞巢(niche)中，干细胞巢提供适当的细胞-细胞接触，并发出维持干细胞群体的信号。

上皮干细胞能够形成组成上皮的不同细胞类型。一些上皮(如皮肤或肠)显示快速细胞更新，表明驻留干细胞必须持续增殖。其他上皮(如肝或胰)在正常条件下显示非常慢的更新。可以通过技术人员已知的流程从十二指肠、小肠和大肠(包括空肠、回肠和结肠)及胃幽门区分离隐窝。例如，可以通过用螯合剂孵育分离的组织来分离隐窝，该螯合剂将细胞从其与基膜和基质细胞类型的钙和镁依赖性相互作用中释放出来。洗涤组织后，用载玻片从粘膜下层刮下上皮细胞层并绞碎。然后在胰蛋白酶或更优选EDTA和/或EGTA中孵育，并用例如过滤和/或离心步骤将未消化的组织碎片和单细胞从隐窝分开。可以用其他蛋白水解酶(如胶原酶和/或中性蛋白酶I)代替胰蛋白酶。用相似的方法来分离胰和胃的碎片。

从上皮组织分离干细胞的方法为本领域已知。在一些实施方案中，该方法包括分离在其表面表达Lgr5和/或Lgr6的干细胞，Lgr5和/或Lgr6属于大的G蛋白偶联受体(GPCR)超家族。在一些实施方案中，该方法包括从上皮组织制备细胞悬液，使细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触，分离Lgr5和/或Lgr6结合化合物，并从结合化合物分离干细胞。在一些实施方案中，可以从分离的隐窝机械产生包含上皮干细胞的单细胞悬液。

在一些实施方案中，Lgr5和/或Lgr6结合化合物包含抗体，如特异性识别和结合Lgr5或Lgr6的胞外域的单克隆抗体，如包括小鼠和大鼠单克隆抗体的单克隆抗体。使用这种抗体，可以例如借助磁珠或通过萦光激活细胞分选来分离表达Lgr5和/或Lgr6的干细胞。在一些实施方案中，从隐窝、胃碎片或胰碎片分离上皮干细胞。例如，从分离自肠的隐窝分离上皮干细胞。在一些实施方案中，从小肠(包括十二指肠、空肠和回肠)、胰或胃分离上皮干细胞。

细胞巢部分由干细胞和周围细胞及巢中细胞所产生的胞外基质(ECM)决定。在一些实施方案中，分离的隐窝或上皮干细胞附着于ECM。ECM由多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白组成，其中糖蛋白包含胶原、触觉蛋白(巢蛋白)、纤连蛋白和层粘连蛋白。ECM由结缔组织细胞分泌。已知不同类型的ECM，其包含不同组合物，该组合物包括不同类型的糖蛋白和/或糖蛋白的不同组合。在去除这些细胞和加入分离的隐窝或上皮干细胞之前，可以通过在容器中培养产ECM细胞(例如成纤维细胞)来提供ECM。产胞外基质细胞的实例是：主要产生胶原和蛋白聚糖的软骨细胞，主要产生IV型胶原、层粘连蛋白、间质前胶原和纤连蛋白的成纤维细胞，及主要产生胶原(I、III和V型)、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤连蛋白和生腱蛋白-C的结肠肌成纤维细胞。备选地，ECM是市售的。市售胞外基质的实例是胞外基质蛋白(Invitrogen)和Matrigel^TM(BD Biosciences)。

在一些实施方案中，该ECM包含至少两种不同糖蛋白，如两种不同类型的胶原或胶原和层粘连蛋白。ECM可以是合成的水凝胶胞外基质或天然存在的ECM。最优选的ECM由Matrigel^TM(BD Biosciences)提供，其包含层粘连蛋白、巢蛋白和胶原IV。

在任意方法的一些实施方案中，该ECM是低生长因子ECM。在一些实施方案中，该ECM是基质胶。

在任意方法的一些实施方案中，该ECM在该液体细胞培养基中的浓度在约4％至约10％、约4％至约5％和/或约4％至约15％w/v的任意一个之间。在一些实施方案中，该ECM的浓度大于约4％、5％、6％、7％、8％、9％和/或10％中的任一个，且小于约20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％和/或10％中的任一个。在一些实施方案中，该ECM的浓度为约4％、5％、6％、7％、8％、9％和/或10％中的任一个。

用于本文所述方法的细胞培养基可以包含任意细胞培养基。在一些实施方案中，该细胞培养基是用基于碳酸盐的缓冲液缓冲在pH 7.4(例如7.2和7.6之间，或至少7.2且不高于7.6)的确定成分合成培养基，同时在包含5％至10％CO₂、或至少5％且不超过10％CO₂、优选5％CO₂的环境中培养细胞。在一些实施方案中，该细胞培养基选自补充了谷氨酰胺、胰岛素、青霉素/链霉素和转铁蛋白的DMEM/F12和RPMI 1640。在一些实施方案中，使用针对无血清培养优化且已包含胰岛素的高级DMEM/F12或高级RPMI。在这种情况下，该高级DMEM/F12或高级RPMI培养基优选补充谷氨酰胺和青霉素/链霉素。在一些实施方案中，该细胞培养基补充纯化、天然、半合成和/或合成生长因子，且不包含不确定的成分，如胎牛血清。补充剂例如B27(Invitrogen)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和N2(Invitrogen)刺激一些细胞的增殖，且可以进一步加至培养基。

在一些实施方案中，该基础培养基包含BMP抑制剂。BMP作为二聚体配体结合由两种不同受体丝氨酸/苏氨酸激酶I型和II型受体组成的受体复合物。II型受体磷酸化I型受体，导致此受体激酶的激活。I型受体随后磷酸化特异性受体底物(SMAD)，导致产生转录活性的信号转导途径。

在一些实施方案中，BMP抑制剂是与BMP分子结合形成复合物的物质，其中例如通过阻止或抑制BMP分子与BMP受体的结合来中和BMP活性。备选地，该抑制剂是作为拮抗剂或反向激动剂发挥作用的物质。此类抑制剂与BMP受体结合，并阻止BMP与受体结合。后一种物质的实例是结合BMP受体并阻止BMP与抗体结合的受体结合的抗体。

已知几类天然BMP结合蛋白，包括头蛋白(Peprotech)、脊索发生素和含有脊索发生素结构域的脊索发生素样蛋白(R&D sytems)、促滤泡素抑制素和含有促滤泡素抑制素结构域的促滤泡素抑制素相关蛋白(R&Dsytems)、DAN和含有DAN半胱氨酸结结构域的DAN样蛋白(R&Dsytems)、sclerostin/SOST(R&D sytems)、饰胶蛋白聚糖(R&D sytems)和α-2巨球蛋白(R&D systems)。在一些实施方案中，BMP抑制剂选自头蛋白、DAN和DAN样蛋白，包括Cerberus和Gremlin(R&D sytems)。在一些实施方案中，该BMP抑制剂是头蛋白。在一些实施方案中，可扩散蛋白能够以不同的亲和力程度结合BMP配体，并抑制它们接近信号发放受体。向基础培养基中加入任意这些BMP抑制剂阻止否则将在培养约2-3周后发生的干细胞丢失。

在一些实施方案中，相对于缺乏抑制剂情况下的BMP活性水平，该BMP抑制剂使细胞中的BMP依赖性活性抑制至多90％、至多80％、至多70％、至多50％、至多30％、至多10％或0％。在一些实施方案中，例如，如Zilberberg等,2007BMC Cell Biol 8:41中所示例，可以通过测量BMP的转录活性来测定BMP活性。

在一些实施方案中，该BMP在该液体细胞中的浓度在约5至500ng/mL、5至250ng/mL、25至150ng/mL和50至100ng/mL的任意一个之间。在一些实施方案中，该BMP抑制剂在该基础细胞培养基中的浓度为至少约10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml中的任一个。在一些实施方案中，BMP抑制剂的浓度为约100ng/ml。培养干细胞期间，优选每两天向培养基中加入BMP抑制剂，同时优选每四天更换新的培养基。在一些实施方案中，该BMP抑制剂是头蛋白。

在任意方法的一些实施方案中，向基础培养基中加入Wnt激动剂。Wnt信号传导途径通过Wnt蛋白与Frizzled受体家族成员的细胞表面受体结合时发生的一系列事件来定义。这导致Dishevelled家族蛋白质的激活，该Dishevelled家族蛋白质抑制包括轴蛋白、GSK-3和APC蛋白的蛋白质复合物降解胞内β-联蛋白。所产生的富集的核β-联蛋白增强了通过TCF/LEF家族转录因子进行的转录。在一些实施方案中，Wnt激动剂可以是在细胞中激活TCF/LEF介导的转录的物质。因此，Wnt激动剂选自结合并激活Frizzled受体家族成员的真正的Wnt激动剂，包括Wnt家族蛋白质、胞内β-联蛋白降解抑制剂和TCF/LEF激活剂中的任一种和全部。

Wnt激动剂包含分泌糖蛋白，其包括但不限于Wnt-1/Int-1、Wnt-2/Irp(例如InM相关蛋白质)、Wnt-2b/13、Wnt-3/Int-4、Wnt-3a(例如R&Dsytems)、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6(例如Kirikoshi H等(2001)Biochem Biophys Res Com 283:798-805)、Wnt-7a(例如R&D sytems)、Wnt-7b、Wnt-8a/8d、Wnt-8b、Wnt-9a/14、Wnt-9b/14b/15、Wnt-10a、Wnt-10b/12、WnM 1和/或Wnt-16。"THE WNT FAMILY OF SECRETEDPROTEINS",R&D Systems目录,2004中提供了人Wnt蛋白质的综述。在一些实施方案中，该Wnt激动剂是Wnt家族成员、R-spondin 1-4、Norrin和/或GSK抑制剂。

在一些实施方案中，该Wnt激动剂是R-spodin多肽。R-spodin家族的分泌蛋白质涉及Wnt信号传导途径的激活和调节，且包含4个成员(R-spondin 1(例如NU206,Nuvelo,San Carlos,CA)、R-spondιn 2(例如R&D sytems)、R-spondin 3和R-spondin-4)。

在一些实施方案中，该Wnt激动剂是Norrin(也称为Nome病蛋白或NDP)(例如R&D sytems)，其是像Wnt蛋白质一样发挥作用的分泌性调节蛋白质，因为它以高亲和力结合Frizzled-4受体，并诱导Wnt信号传导途径的激活(Kestutis Planutis等(2007)BMC Cell Biol 8:12)。最近鉴定出Wnt信号传导途径的小分子激动剂氨基嘧啶衍生物，且也作为Wnt激动剂明确包括在内(Lin等(2005)Angew Chem Int Ed Engl 44:1987-90)。

在一些实施方案中，该Wnt激动剂是GSK抑制剂。GSK抑制剂的实例包括但不限于小干扰RNA(siRNA,例如Cell Signaling)、锂(例如Sigma),kenpaullone(Biomol International,Leost等(2000)Eur J Biochem 267,5983-5994)、6-溴靛玉红-30-丙酮肟(Meyer等(2003)Chem Biol 10,1255-1266)、SB 216763和SB 415286(Sigma-Aldrich)及阻止GSK-3与轴蛋白相互作用的FRAT家族成员和FRAT衍生肽(Meijer等(2004)Trends inPharma.Sci.25,471-480)，其在此引入作为参考。用于测定GSK-3抑制水平的方法和测定为技术人员已知，且包括例如Liao等(2004)Endocrinology,145(6)2941-9中所述的方法和测定。

在一些实施方案中，相对于缺乏该分子情况下的Wnt活性水平，Wnt激动剂在细胞中刺激Wnt活性至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、至少90％、至少100％。如技术人员已知，可以例如通过pTOPFLASH和pFOPFLASH Tcf萤光素酶报道构建体(Korinek等(1997)Science 2751784-1787)测量Wnt的转录活性来测定Wnt活性。

在一些实施方案中，该Wnt激动剂在该液体细胞培养基中的浓度在约500ng/mL至5μg/ml、500ng/mL至5μg/mL、500ng/mL至约1.5μg/mL的任意一个之间。在一些实施方案中，按至少约50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、750ng/mL、1000ng/mL、1250ng/mL和/或1500ng/mL的任一个的浓度向基础培养基中加入Wnt激动剂。在一些实施方案中，Wnt激动剂的浓度为约500ng/ml。培养干细胞期间，优选每两天向培养基加入Wnt激动剂，同时优选每四天更换新的培养基。在一些实施方案中，该Wnt激动剂包含R-spondin 1或由R-spondin 1组成。在一些实施方案中，该Wnt激动剂包含R-spondin 2或由R-spondin 2组成。在一些实施方案中，该Wnt激动剂包含R-spondin 3或由R-spondin 3组成。在一些实施方案中，该Wnt激动剂包含R-spondin 4或由R-spondin4组成。

在一些实施方案中，该Wnt激动剂选自R-spondin、Wnt-3a和Wnt-6。在一些实施方案中，用R-spondin和Wnt-3a二者作为Wnt激动剂。在一些实施方案中，R-spondin的浓度为约500ng/ml，而Wnt3a的浓度为约100ng/ml。

在一些实施方案中，该基础培养基包含促细胞分裂生长因子。促细胞分裂生长因子的实例包括但不限于上皮生长因子(EGF，例如Peprotech)、转化生长因子-α(TGF-α，例如Peprotech)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，例如Peprotech)、脑衍生神经营养因子(BDNF，R&D Systems)和角质形成细胞生长因子(KGF，Peprotech)。EGF是多种培养的外胚层和中胚层细胞的有效的促细胞分裂因子，对体内具体细胞及体外细胞培养基中的一些成纤维细胞的分化具有深远影响。EGF前体作为膜结合分子存在，该膜结合分子经蛋白水解切割产生刺激细胞的53个氨基酸的肽激素。

在一些实施方案中，按5至500ng/ml之间或至少5且不高于500ng/ml的浓度向基础培养基中加入促细胞分裂生长因子。在一些实施方案中，该浓度为至少约5、10、20、25、30、40、45或50ng/mL中的任一个，且不高于约500、450、400、350、300、250、200、150或100ng/mL中的任一个。在一些实施方案中，促细胞分裂生长因子的浓度为至少约50且不高于约100ng/ml。在一些实施方案中，该浓度为约50ng/ml。在一些实施方案中，该促细胞分裂生长因子是EGF。在一些实施方案中，该促细胞分裂生长因子是bFGF(例如FGF10或FGF7)。在一些实施方案中，使用FGF7和/或FGF10。FGF7也称为KGF(角质形成细胞生长因子)。在一些实施方案中，向基础培养基中加入促细胞分裂生长因子的组合，例如，EGF和KGF、或EGF和BDNF。在一些实施方案中，向基础培养基中加入促细胞分裂生长因子的组合，例如，EGF和KGF、或EGF和FGF10。如果使用一种以上促细胞分裂生长因子，例如FGF7和FGF10，则促细胞分裂生长因子的浓度如上文所定义，且指所使用的促细胞分裂生长因子的总浓度。在一些实施方案中，培养干细胞期间，每两天向培养基中加入促细胞分裂生长因子，同时每四天更换新的培养基。可以使用bFGF家族的任意成员。

在一些实施方案中，该培养基包含Rock(Rho激酶)抑制剂。尤其是在培养单种干细胞时，发现Rock抑制剂的加入阻止失巢凋亡。Rock抑制剂优选选自R)-(+)-反式-4-(l-氨乙基)-N-(4-吡啶基)环己甲酰胺二盐酸一水合物(Y-27632,例如Sigma-Aldrich)、5-(l,4-二氮杂环庚烷-l-基磺酰基)异喹啉(fasudil或HA1077,例如Cayman Chemical)和(S)-(+)-2-甲基-l-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-l H-l,4-二氮杂二盐酸(H-1152,例如TocrisBioschience)。在培养干细胞的前7天期间，可以每两天向培养基中加入Rho激酶抑制剂，例如Y-27632。在一些实施方案中，Y27632的浓度为10DM。

在一些实施方案中，该培养基包含Notch激动剂。已显示Notch信号发放在细胞命运决定以及细胞存活和增殖中发挥重要作用。Notch受体蛋白可与包括但不限于Delta 1、Jagged 1和2、及Delta样1、Delta样3、Delta样4的许多表面结合的或分泌的配体相互作用。配体结合时，Notch通过涉及ADAM蛋白酶家族成员的系列切割事件以及受γ分泌酶presinilin调节的膜内切割激活。结果是Notch的胞内结构域易位至细胞核，在细胞核内转录激活下游基因。在一些实施方案中，该Notch激动剂选自Jagged 1和Delta 1，或其活性片段或衍生物。在一些实施方案中，Notch激动剂是具有序列CDDYYYGFGCNKFCRPR的DSL肽(Dontu等,2004.Breast Cancer Res 6:R605-R615)。优选按约10μM至约100nM之间或至少约10μM且不高于约100nM的浓度使用DSL肽(ANA spec)。尤其是在培养的第一周期间，Notch激动剂的加入可以使培养效率提高2-3个因子。在一些实施方案中，在培养干细胞的前7天期间每两天向培养基中加入Notch激动剂。

在一些实施方案中，Notch激动剂可以是这样的分子，相对于缺乏该分子情况下的Notch活性水平，其刺激细胞中的Notch活性至少约10％、20％、30％、50％、70％、90％和/或100％中的任一个。在一些实施方案中，可以例如通过(Hsieh等(1996)MoI Cell.Biol.16,952-959)所述的4xwtCBFl萤光素酶报道构建体测量Notch的转录活性来测定Notch活性。

在任意方法的一些实施方案中，该方法包括悬滴培养。在一些实施方案中，该方法包括常规悬滴培养。在一些实施方案中，该方法包括中空球悬滴培养(Lee等Tissue Engineering 15(00)(2009))。在任意方法的一些实施方案中，该方法包括无支架环境培养。在一些实施方案中，该方法包括悬滴平板培养(例如，如US2011/0306122和/或EP2342317中所述，其以其整体引入作为参考)。

在一些实施方案中，该上皮干细胞是胰、胃、肠和/或结肠上皮干细胞。在一些实施方案中，该上皮干细胞是小肠干细胞。在一些实施方案中，该上皮干细胞不包含胚胎干细胞。在一些实施方案中，该上皮干细胞包含成体干细胞。在一些实施方案中，来自小肠、结肠和胃的单种分选的上皮干细胞也能够在细胞培养基中建立这些三维类器官。

在一些实施方案中，本文所述的液体培养法允许建立长期培养条件，在该条件下，单个隐窝经历多重隐窝分裂事件，同时产生隐窝样上皮域，其中存在所有分化的细胞类型。在一些实施方案中，在将它们放入培养基中后，培养的隐窝经历显著的形态学变化。在一些实施方案中，现分离的隐窝的上端开口封闭，此区域逐渐向外膨胀，并充满凋亡细胞，很像在绒毛尖端掐掉凋亡细胞。在一些实施方案中，发现该隐窝区域经历持续的产生附加隐窝的出芽事件，这是表明隐窝分裂的过程。在一些实施方案中，该隐窝样延伸包含所有分化的上皮细胞类型，包括增殖细胞、帕内特细胞、肠细胞和杯形细胞。在一些实施方案中，在任何阶段的类器官中都检测不到肌成纤维细胞或其他非上皮细胞。

在一些实施方案中，本文所述的液体培养法允许扩大出芽的隐窝结构来产生类器官，该类器官包含>40个隐窝样结构，该隐窝样结构围绕以绒毛样上皮为衬里且充满凋亡细胞体的中央腔。在一些实施方案中，该隐窝-绒毛类器官包含以绒毛样上皮为衬里的中央腔。在一些实施方案中，腔按连贯的时间间隔打开，以将内容物释放入培养基。在一些实施方案中，该液体培养法允许至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月的培养期。在一些实施方案中，该类器官可以在培养基中传代和维持至少6个月而不丧失基本特征。在一些实施方案中，传代不涉及和/或需要手工碎片化类器官。

在一方面，本发明因此提供隐窝-绒毛类器官，其包含产生于在本文所述的培养基中培养上皮干细胞或分离的隐窝和/或可用本文所述的方法获得的以绒毛样上皮为衬里的中央腔。在一些实施方案中，该类器官是胃类器官。

为了高通量的目的，在多孔板例如96孔板或384孔板中培养隐窝-绒毛类器官。用分子文库来鉴定影响类器官的分子。优选的文库包括抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文库(例如LOPAP^TM,Sigma Aldrich)、液体文库(BioMol)、合成的化合物文库(例如LOPAP^TM,Sigma Aldrich)或天然化合物文库(Specs,TimTec)。这些遗传文库包括cDNA文库、反义文库和siRNA或其他非编码RNA文库。优选将细胞暴露于多种浓度的测试物质某个时期。暴露期结束时，评价培养基。用术语“影响”来涵盖细胞中的任意变化，包括但不限于降低、丧失、增殖、形态学变化和细胞死亡。还可以用隐窝-绒毛、胃或胰类器官来鉴定特异性靶向上皮癌细胞而不是靶向隐窝-绒毛、胃或胰类器官的药物。

隐窝-绒毛类器官可以进一步替代诸如Caco-2细胞的细胞系在潜在的新药或已知的或新的食品添加剂的毒性测定中的用途。

此外，隐窝-绒毛类器官可用于培养目前缺乏适宜的组织培养基或动物模型的病原体，如诺如病毒。

在一些实施方案中，还可在用于修复损伤或患病的组织的方法中使用基因治疗。例如，可以利用腺病毒或反转录病毒基因递送载体来将遗传信息(如DNA和/或RNA)递送至干细胞。技术人员可以替换或修复基因治疗中所靶向的具体基因。例如，可将正常基因插入基因组内的非特异性位置来替换非功能性基因。在另一实例中，可通过同源重组来将异常基因序列替换为正常基因序列。备选地，选择性逆向突变可使基因回复至其正常功能。另一实例是改变具体基因的调节(基因打开或关闭的程度)。优选地，通过基因治疗方法离体处理干细胞，随后转移至哺乳动物，优选需要治疗的人类。

在一些实施方案中，考虑本文提供的多肽(例如BMP抑制剂、Wnt激动剂等)的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过在编码抗体和/或结合多肽的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从抗体和/或结合多肽的氨基酸序列缺失残基、和/或在抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内插入残基、和/或取代抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内的残基。可以进行缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望的特征，例如抗原结合。

在某些实施方案中，提供具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体和/或结合多肽变体。进行取代诱变的目的位点包括HVR和FR。表1中在“优选的取代”的表头下显示保守取代。表1中在“示例性取代”的表头下显示更实质性的改变，如下文参考氨基酸侧链种类进一步描述。可以在目的抗体和/或结合多肽中引入氨基酸取代，并针对希望的活性(例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)筛选产物。

表1

氨基酸可以按照共有的侧链特性分组：

(1)疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe.

非保守取代将需要将这些种类之一的成员换为另一种类。

一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，所得到的选择用于进一步研究的一种或多种变体将相对于亲本抗体具有某些生物学特性(例如提高的亲和力、降低的免疫原性)的修饰(例如改善)和/或将具有基本上保留的亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简言之，突变一个或多个HVR残基，将变体抗体展示在噬菌体上，并针对具体的生物学活性(例如结合亲和力)进行筛选。

可以在HVR中进行改变(例如取代)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基)(见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或接触抗原的残基中进行这类改变，针对结合亲和力测试所得到的变体VH或VL。通过构建二级文库并从二级文库重新选择的亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编辑,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定点诱变)中的任一种来在选择用于成熟的可变基因中引入多样性。然后产生二级文库。然后筛选该文库来鉴定具有希望的亲和力的任意抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定点途径，其中随机化几个HVR残基(例如每次4-6个残基)。可以例如用丙氨酸扫描诱变或模拟来明确地鉴定出涉及抗原结合的HVR残基。尤其是通常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个HVR内，只要这类改变不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如本文提供的保守取代)。这类改变可以例如在HVR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，各HVR未改变，或包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。

如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述，用于鉴定可以靶向进行诱变的抗体和/或结合多肽的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此方法中，鉴定残基或靶残基组(例如带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在证明对最初的取代的功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。备选地或此外，用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。这类接触残基和邻近残基可以作为取代的候选残基靶向或消除。可以筛选变体来确定它们是否包含希望的特性。

氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽的范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端蛋氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如，对于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。

本说明书中引用的所有专利和参考文献在此以其整体引入作为参考。

实施例

以下是本发明的方法和组合物的实例。应理解，由于上文提供的一般描述，可以实施多种其他实施方案。

实施例1-细胞培养基中培养的类器官

已证明来自多种器官组织碎片的类器官培养基的生长。以下是允许来自包含干细胞的组织碎片(例如小肠)的类器官生长同时最大化进行旨在理解类器官的生物学的下游应用的可行性的技术描述。

材料和方法

小鼠

用6至12周龄之间的CD-1杂种小鼠进行隐窝分离。

隐窝分离

从单只小鼠收集包括十二指肠、空肠和回肠的小肠用于单个平板接种实验。用冷PBS冲洗小肠一次并纵向切开。用细胞刮棒来去除绒毛结构，从而使隐窝结构暴露于工作溶液。然后将肠剁为约5mm的小块，并在冷螯合缓冲液(5.6mM Na₂HPO₄、96.2mM NaCl、1.6mM KCl、43.4mM蔗糖、54.9D-山梨醇)加2mM EDTA、0.5M DL-二硫苏糖醇(Dithiothereitol)中冰上孵育30分钟。去除螯合EDTA-DTT缓冲液，用10-mL移液管将组织碎片剧烈重悬在冷螯合缓冲液中。用解剖显微镜监测溶液中游离隐窝的外观。重复螯合EDTA-DTT缓冲液中孵育和重悬的过程，直至游离隐窝达到10个隐窝/μL的浓度，这通常在3个循环之后。将含有隐窝的上清收集在15mL锥形管中，150-200g离心3分钟沉淀，并用冷螯合缓冲液洗涤。

平板接种和培养

在螯合缓冲液中洗涤后，再次沉淀隐窝，并按5个隐窝/μL的浓度重悬在生长培养基(见下文)中。然后按每孔40μL(200个隐窝)将隐窝平板接种在GravityPLUS 96孔悬滴平板(inSphero)上。向板底加入10mL PBS以防止蒸发，并将平板培养在37℃、5％CO₂和大气氧的湿润培养箱中。每2天，从每个孔去除一半的培养基，并替换为新鲜培养基，以确保生长所需因子的恒定来源。

增殖和分化测定

培养10天后，将平板偶联至GravityPLUS收集板(InSphero)，并150-200g离心3分钟。用多道移液器去除培养基，在生长培养基加10μMEdU中37℃孵育类器官30分钟。然后在4％多聚甲醛/PBS中室温固定类器官15分钟。在PBS加3％BSA中洗涤类器官2次，然后在PBS加0.5％Trion X-100中室温透化20分钟。透化后，在Click-iT EdU反应混合物中孵育类器官，并按厂家的流程(Invitrogen)处理。用PBS加0.1％Trion X-100洗涤类器官2次，并在1:3000的兔抗人溶菌酶一抗中4℃过夜孵育。第二天，用PBS加0.1％Trion X-100洗涤类器官2次，在alexa-fluor 488二抗中室温孵育1小时，用PBS加0.1％Trion X-100洗涤2次，封固在prolonggold封固剂中，并在Leica SPE共焦显微镜上成像。

生长培养基

高级DMEM/F12，补充了青霉素/链霉素、1×N2(Gibco)、1×B27(Gibco)、10mM HEPES、1x Glutamax(Gibco)、1mM N-乙酰半胱氨酸、鼠EGF 10-50ng/mL(PeproTech)、鼠头蛋白50-100ng/mL(PeproTech)、hRSPO31μg/mL和0-5％低生长因子基质胶(BD Biosciences)。

结果

用5％基质胶用上述方法观察到了一致的类器官生长。GFP染色在从主类器官体出芽的隐窝样结构中的存在和定位与Lgr5表达在体内隐窝基底处的定位一致(图1)。此外，观察到了类器官的隐窝样结构中的溶菌酶染色，表明此制备产生活性分化肠的特化细胞的类器官(图1)。

实施例2-肠类器官中Lgr5阳性干细胞的去除

之前的研究已显示，鼠肠中Lgr5阳性干细胞的去除产生正常肠形态，以及分化细胞的正常分布和数目(Tian等2011)。为了确定液体培养的类器官是否模拟体内肠组织的功能特征和形态特征，按下文所述在液体培养的类器官中去除Lgr5阳性干细胞。

材料和方法

小鼠

用最初在Tian等,2011中表征的Lgr5^DTREGFP/+小鼠来按上文分离隐窝。这些小鼠作为利用EGFP盒的Lgr5表达的报道者，并允许通过施用白喉毒素(DT)来去除Lgr5阳性干细胞。

Lgr5阳性干细胞去除

除在Lgr5阳性干细胞去除的情况下培养隐窝3-7天并目检类器官的存在外，按上文进行隐窝分离、平板接种和培养。然后用含10ng/mL白喉毒素(DT)的培养基处理类器官。在总计10天内每两天更换含DT的培养基和用于对照类器官的不含DT的培养基。

类器官染色

然后收集经处理的类器官和对照类器官，并进行GFP染色，以监测Lgr5干细胞去除的效应。同时，对类器官进行溶菌酶共染色，以鉴定分化的帕内特细胞。用PBS加0.1％Trion X-100洗涤类器官2次，在4％多聚甲醛/PBS中室温固定15分钟。在PBS加0.1％Trion X-100中洗涤类器官3次，并用无蛋白质封闭液(Dako)封闭1小时。用鸡抗GFP(1:2000)和兔抗人溶菌酶(1:2000)抗体4℃过夜孵育类器官。第二天，用PBS加0.1％TrionX-100洗涤类器官3次，在抗鸡IgG Cy3()和抗兔alexa-fluor 488二抗中室温孵育1小时，用PBS加0.1％Trion X-100洗涤2次，封固在prolong gold封固剂中，并在Leica SPE共焦显微镜上成像。

结果

在DT存在下长期孵育Lgr5^DTREGFP/+类器官产生正常外观的类器官，由于表达Lgr5的细胞的去除，该类器官缺乏任何Lgr5依赖性GFP表达(图2b)。这些类器官为溶菌酶染色阳性，表明在缺乏Lgr5阳性细胞的情况下发生分化(绿色染色，图2b、b’和d)，并显示强健的增殖(红色染色，图2d)。

概括起来，单个肠干细胞显示能够独立于来自其环境(包括固体胞外基质)的位置线索运转，且它可以产生表明正常肠的持续扩增、自组织上皮结构。所述包括液体培养法的培养系统将简化干细胞驱动的隐窝-绒毛生物学的研究。

实施例3-肠类器官生长对ECM(基质胶)的需要

为了测定肠类器官生长对基质胶的需要，用生长培养基中不同浓度的基质胶用悬滴法培养类器官。

小鼠、类器官制备和类器官染色

用WT CD-1小鼠进行这些实验。除在0％、1％、2％、3％、4％和5％基质胶存在下培养类器官外，按上文进行隐窝分离、平板接种和培养。隐窝接种7天后目检包含类器官的平板。按上文所述染色和成像类器官。

结果

图3显示以生长培养基中逐渐降低的基质胶浓度接种隐窝的结果。5％和4％基质胶(分别为a和b)产生一致的大尺寸类器官。较低浓度的基质胶不支持类器官的强健生长(c和d)，1％和0％基质胶显示无任何生长(数据未显示)。

Claims

1.用于液体培养(a)上皮干细胞和/或(b)分离的包含上皮干细胞的上皮组织碎片的方法，所述方法包括在液体细胞培养基中孵育所述上皮干细胞和/或所述分离的组织碎片，所述液体细胞培养基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向所述基础培养基加入(i)骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、(ii)促细胞分裂生长因子、(iii)Wnt激动剂和(iv)至少约4％w/v的胞外基质(ECM)。

2.用于获得和/或培养隐窝的方法，所述方法包括在液体细胞培养基中孵育上皮干细胞和/或分离的组织碎片，所述液体细胞培养基包含用于动物细胞或人细胞的基础培养基，向所述基础培养基加入(i)骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、(ii)促细胞分裂生长因子、(iii)Wnt激动剂和(iv)至少约4％w/v的胞外基质(ECM)。

3.权利要求1-2中任一项的方法，其中BMP抑制剂是头蛋白、DAN和/或DAN样蛋白，包括Cerberus和Gremlin。

4.权利要求3的方法，其中BMP抑制剂是头蛋白。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中BMP抑制剂在所述液体细胞培养基中的浓度在约5和约500ng/ml之间(例如约50至约100ng/mL)。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中Wnt激动剂是Wnt、R-spondin(RSPO)、Norrin和/或GSK抑制剂。

7.权利要求6的方法，其中Wnt激动剂是RSPO。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中Wnt激动剂在所述液体细胞培养基中的浓度在约500ng/mL和约5μg/ml之间(例如约500至约1500ng/mL)。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中促细胞分裂生长因子是上皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)和角质形成细胞生长因子(KGF)。

10.权利要求9的方法，其中促细胞分裂生长因子是EGF。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中促细胞分裂生长因子在所述液体细胞培养基中的浓度在约5和约500ng/ml之间(例如约5至约50ng/mL)。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中ECM是低生长因子ECM。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中ECM是基质胶。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中ECM在所述液体细胞培养基中的浓度在约4％至约10％w/v之间。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中培养基进一步包含Rock(Rho激酶)抑制剂。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中培养基进一步包含Notch激动剂。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中上皮干细胞和/或上皮组织碎片是胃肠干细胞和/或胃肠组织碎片。

18.权利要求17的方法，其中胃肠干细胞和/或胃肠组织碎片是小肠干细胞和/或小肠组织碎片。

19.隐窝，其通过权利要求1-18中任一项的方法获得。

20.权利要求19的隐窝的用途，用于药物发现筛选、毒性测定或用于再生医学。