TW202200786A - 自肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題在於提供一種自肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之方法，其包括於培養用培養基中培養包含肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本之步驟， 上述培養用培養基包含0～10%v/v之細胞外基質，且 包含選自由角質細胞生長因子(KGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)10及肝細胞生長因子(HGF)所組成之群中之至少1種、骨形態生成蛋白(BMP)抑制劑、以及TGFβ抑制劑之組合，並且 上述培養用培養基實質上不包含餵養細胞。

Description

自肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之方法
本發明係關於一種源自肺上皮細胞之類器官之製造方法。又，本發明亦關於一種源自肺癌細胞之類器官之製造方法。本發明還關於一種源自肺上皮細胞或肺癌細胞之類器官、包含源自肺上皮細胞之類器官之再生醫療用組合物、及篩選用於治療肺癌之物質之方法。
組織幹細胞於穩態下有助於分化細胞之適當代謝回轉。組織幹細胞於器官受到損傷之情形時，藉由供給分化細胞，會對損傷後之再生發揮關鍵性作用。肺中存在複數種組織幹細胞。已確立針對各種組織幹細胞之類器官培養方法，用於以幹細胞研究及再生醫療為目標之應用研究。作為類器官培養方法，廣泛利用使用餵養細胞之培養方法(專利文獻1)。近年來，亦對不使用餵養細胞之類器官培養方法進行了研究(專利文獻2、非專利文獻1)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻１]日本專利特表2016-513469 [專利文獻２]日本專利特表2018-503360 [非專利文獻]
[非專利文獻１] Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 515, Issue 4, 6 August 2019, Pages 579 - 585
[發明所欲解決之問題]
本發明之主要目的在於提供一種源自肺上皮細胞或肺癌細胞之類器官之新穎製造方法。 [解決問題之技術手段]
本發明提供一種自肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之方法，上述方法包括於培養用培養基中培養包含肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本之步驟，上述培養用培養基包含0～10%v/v之細胞外基質，且包含選自由角質細胞生長因子(KGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)10及肝細胞生長因子(HGF)所組成之群中之至少1種、骨形態生成蛋白(BMP)抑制劑、以及TGFβ(Transforming Growth Factor Beta，轉化生長因子β)抑制劑之組合，並且上述培養用培養基實質上不包含餵養細胞。
本發明進而提供一種藉由上述方法所製造之源自肺上皮細胞或肺癌細胞之類器官。本發明提供一種源自肺上皮細胞之類器官，其包含內腔、及面對上述內腔之細胞層。
本發明進而提供一種再生醫療用組合物，其包含藉由上述方法所製造之源自肺上皮細胞之類器官。
本發明進而提供一種篩選用於治療肺癌之物質之方法，其包括以下步驟：使藉由上述方法所製造之源自肺癌細胞之類器官與試驗樣品接觸；對與上述試驗樣品接觸後之類器官進行測定；及將與上述試驗樣品接觸後之類器官之測定值與對照值進行比較。
本發明進而提供一種自肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之方法，其包括於培養用培養基中培養包含肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本之步驟，上述培養用培養基包含0～10%v/v之細胞外基質，且包含以下組合：包含Wnt訊息活化劑、骨形態生成蛋白(BMP)抑制劑、TGFβ抑制劑、及肝細胞生長因子(HGF)之組合；包含角質細胞生長因子(KGF)及纖維母細胞生長因子(FGF)10之任一者或兩者、BMP抑制劑、TGFβ抑制劑、及HGF之組合；或者包含KGF及FGF10之任一者或兩者、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、TGFβ抑制劑、及HGF之組合，並且上述培養用培養基實質上不包含餵養細胞。
本發明提供下述發明。 [項1]一種自肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之方法，其包括於培養用培養基中培養包含肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本之步驟，上述培養用培養基包含0～10%v/v之細胞外基質，且包含選自由角質細胞生長因子(KGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)10及肝細胞生長因子(HGF)所組成之群中之至少1種、骨形態生成蛋白(BMP)抑制劑、以及TGFβ抑制劑之組合，並且上述培養用培養基實質上不包含餵養細胞。 [項2]如項1所記載之方法，其中上述組合進而包含Wnt訊息活化劑及Rho-激酶(ROCK)抑制劑之任一者或兩者。 [項3]如項2所記載之方法，其中上述組合為以下組合：KGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；KGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；FGF10、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；FGF10、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；HGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；HGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；KGF、FGF10、HGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；KGF、FGF10、HGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；ROCK抑制劑、KGF、FGF10、HGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；或者ROCK抑制劑、KGF、FGF10、HGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合。 [項4]如項1至3中任一項所記載之方法，其中上述BMP抑制劑為Noggin，及/或上述TGFβ抑制劑為SB431542。 [項5]如項2至4中任一項所記載之方法，其中上述Wnt訊息活化劑為CHIR99021，及/或上述ROCK抑制劑為Y-27632。 [項6]如項1至5中任一項所記載之方法，其中上述樣本中所包含之肺上皮幹細胞包含選自由基底細胞、棒狀細胞、支氣管肺泡上皮幹細胞及肺泡上皮細胞所組成之群中之至少1種細胞種。 [項7]如項1至5中任一項所記載之方法，其中上述樣本中所包含之肺上皮細胞本質上由2型肺泡上皮細胞(以下亦稱為「AT2細胞」)組成；本質上由棒狀細胞組成；或者本質上由基底細胞及棒狀細胞之組合組成。 [項8]如項1至5中任一項所記載之方法，其中上述樣本中所包含之肺上皮細胞本質上由2型肺泡上皮細胞組成；或者本質上由棒狀細胞組成。 [項9]如項1至8中任一項所記載之方法，其包括以下步驟：於在上述培養用培養基中培養上述樣本之前，基於針對棒狀細胞-I、AT2細胞及棒狀細胞-II各者於表A中列舉之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種，自上述樣本選擇棒狀細胞-I、AT2細胞或棒狀細胞-II。
表A      
棒狀細胞-I AT2細胞 棒狀細胞-II
Cbr2 Lamp3 Tff2
Hp Lyz2 Reg3g
Cyp2f2 Napsa Bpifb1
Prdx6 Slc34a2 Muc5b
Scgb1a1 Lyz1 Sult1d1
Ldhb Rnase4 Fxyd3
Ces1d Hc Scgb3a1
Cckar Cd74 Lypd2
Selenbp1 Scd1 Chad
Gstm2 Sftpc S100a6
Scnn1b Lgi3 Pglyrp1
Scgb1c1 Cldn18 Aldh3a1
Plpp3 Etv5 Bpifa1
Ephx1 Cxcl15 Gsto1
Dcxr S100g Lgals3
Alas1 Elovl1 Pigr
Retnla Fas Scgb3a2
Sec14l3 H2-Aa Ltf
Ptgr1 Fabp5 Qsox1
Krtap17-1 Rn4.5s Cyp2a5
      Cpd
      Ly6a
      Perp
      Kcne3
      Il13ra1
      Slc15a2
      Cd14
[項10]如項1至9中任一項所記載之方法，其包括以下步驟：將於包含上述組合之上述培養用培養基中培養之上述細胞進而於不包含上述組合之培養用培養基中進行培養。 [項11]一種源自肺上皮細胞或肺癌細胞之類器官，其係藉由如項1至10中任一項所記載之方法所製造。 [項12]一種類器官，其係包含內腔、及面對上述內腔之細胞層之源自肺上皮細胞之類器官，且上述肺上皮細胞為肺泡細胞，上述細胞層本質上由AT2細胞組成；本質上由AT2細胞與表現出AT2細胞標記物及支氣管上皮標記物之細胞之組合組成；或者本質上由表現出支氣管上皮標記物之細胞組成；或者上述肺上皮細胞為呼吸道細胞，上述細胞層本質上由基底細胞與表現出基底細胞標記物及支氣管上皮標記物之細胞之組合組成。 [項13]如項12所記載之類器官，其中上述肺上皮細胞為肺泡細胞，上述細胞層本質上由AT2細胞組成，上述AT2細胞表現出HT2-280及SFTPC之任一者或兩者，且上述HT2-280於上述AT2細胞中局部存在於面對上述內腔之細胞膜或其附近。 [項14]如項12所記載之類器官，其中上述AT2細胞標記物為HT2-280及SFTPC之任一者或兩者，上述支氣管上皮標記物為SOX2，及/或上述基底細胞標記物為KRT5。 [項15]一種再生醫療用組合物，其包含藉由如項1至10中任一項所記載之方法所製造之源自肺上皮細胞之類器官、如項12至14中任一項所記載之源自肺上皮細胞之類器官、及/或上述類器官之細胞。 [項16]一種再生醫療用組合物，其包含本質上由表現出表A中所列舉之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種之棒狀細胞-I、AT2細胞或棒狀細胞-II組成的肺上皮細胞。
表A      
棒狀細胞-I AT2細胞 棒狀細胞-II
Cbr2 Lamp3 Tff2
Hp Lyz2 Reg3g
Cyp2f2 Napsa Bpifb1
Prdx6 Slc34a2 Muc5b
Scgb1a1 Lyz1 Sult1d1
Ldhb Rnase4 Fxyd3
Ces1d Hc Scgb3a1
Cckar Cd74 Lypd2
Selenbp1 Scd1 Chad
Gstm2 Sftpc S100a6
Scnn1b Lgi3 Pglyrp1
Scgb1c1 Cldn18 Aldh3a1
Plpp3 Etv5 Bpifa1
Ephx1 Cxcl15 Gsto1
Dcxr S100g Lgals3
Alas1 Elovl1 Pigr
Retnla Fas Scgb3a2
Sec14l3 H2-Aa Ltf
Ptgr1 Fabp5 Qsox1
Krtap17-1 Rn4.5s Cyp2a5
      Cpd
      Ly6a
      Perp
      Kcne3
      Il13ra1
      Slc15a2
      Cd14
[項17]一種篩選用於治療肺癌之物質之方法，其包括以下步驟：使藉由如項1至10中任一項所記載之方法所製造之源自肺癌細胞之類器官與試驗樣品接觸；對與上述試驗樣品接觸後之類器官進行測定；及將與上述試驗樣品接觸後之類器官之測定值與對照值進行比較。 [項18]一種醫藥組合物，其包含：肺上皮細胞，其本質上由基於針對棒狀細胞-II於表A中列舉之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種自包含肺上皮細胞之樣本中選擇的棒狀細胞-II組成；及用於治療肺損傷或肺部疾病之藥劑。
[自肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之方法] 本發明之一態樣提供一種自肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之方法。上述方法包括於培養用培養基中培養包含肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本之步驟，上述培養用培養基包含0～10%v/v之細胞外基質，且包含本發明之添加劑，並且上述培養用培養基實質上不包含餵養細胞。
本說明書中之用語「類器官」意指於試管內(in vitro)形成之類似三維活體組織之細胞聚集體。於類器官之文理中，「類似活體組織」或「與活體組織類似」意指類器官之解剖學結構與活體組織之解剖學結構類似。構成類器官之細胞例如大部分為具有分化能力及增殖能力之細胞。可依照公知之方法使構成類器官之培養細胞分化成各種細胞類型。例如，可藉由使培養用培養基中包含添加劑或自培養用培養基中去除添加劑，而使構成類器官之培養細胞分化成複數種細胞類型。例如，可藉由在不含本發明之添加劑之培養用培養基中進行培養，而誘導構成類器官之培養細胞分化。類器官可包含一部分經分化之細胞或不具分化能力之細胞。類器官例如可依照公知之細胞培養方法進行製造。例如，類器官可藉由在細胞培養裝置中維持包含本發明之添加劑之培養用培養基中之規定細胞而製造。於一實施方式中，類器官為源自肺上皮幹細胞或肺癌細胞之類器官。
於一實施方式中，類器官於在顯微鏡下觀察時係直徑至少為50 μm之培養細胞之聚集體。於培養細胞之聚集體為橢圓形之情形時，直徑為長邊之長度。於培養細胞之聚集體為複雜形狀之情形時，直徑為上述細胞聚集體之外接圓之直徑。類器官之形成效率(CFE：Colony Forming Efficiency)由將包含肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本於培養用培養基中培養6天後之培養物中之直徑50 μm以上之細胞塊之數量除以上述培養用培養基中所包含之肺上皮細胞或肺癌細胞之細胞數所得之比率[%]表示。
本說明書中之用語「幹細胞」意指具有自己增殖之能力(亦稱為「增殖能力」)、及分化成特定之細胞類型之能力(亦稱為「分化能力」)的細胞。幹細胞例如可分化成上皮幹細胞。例如，可依照公知之方法使幹細胞於維持其分化能力之狀態下增殖。又，可依照公知之方法使幹細胞分化成特定之細胞類型，並且增殖。
本說明書中之用語「肺上皮細胞」意指構成肺之上皮組織之細胞。肺上皮細胞例如可為棒狀細胞(Club cell)、纖毛細胞(Ciliated cell)、神經內分泌細胞、基底細胞(Basal cell)、杯狀細胞或肺泡上皮細胞、或者具備分化成上述細胞之能力之肺上皮幹細胞。肺泡上皮細胞例如可為1型肺泡上皮細胞(Type II alveolar epithelial cell：AT1細胞)及2型肺泡上皮細胞(AT2細胞)之任一者或兩者。本說明書中之用語「肺上皮幹細胞」意指存在於肺組織中且具有增殖能力、及分化成特定之肺上皮細胞之能力的細胞。肺組織例如包含氣管、支氣管、細支氣管及肺泡。
肺上皮幹細胞例如具有分化成選自由基底細胞、棒狀細胞、及2型肺泡上皮細胞所組成之群中之至少1種細胞種之能力。肺上皮幹細胞例如可為支氣管肺泡上皮幹細胞(Bronchioalveolar stem cell：BASCs)。肺上皮幹細胞可依照公知之方法(例如專利文獻2中記載之方法)進行製備。
基底細胞於穩態下具有在氣管傷害再生時分化成棒狀細胞及纖毛細胞之能力。棒狀細胞於穩態下具有在支氣管傷害再生時分化成纖毛細胞之能力，但於嚴重之肺泡傷害時，分化成AT2細胞及AT1細胞。AT2細胞於穩態下具有在肺泡傷害時分化成AT1細胞之能力。
本說明書中之用語「肺泡細胞」意指自肺泡組織獲得之細胞。肺泡細胞可依照公知之方法由肺泡組織製備。肺泡細胞可以商業方式獲取。肺泡細胞例如包含肺泡上皮細胞。於一例中，肺泡細胞包含AT1細胞及AT2細胞之任一者或兩者。本說明書中之用語「呼吸道細胞」意指自呼吸道組織獲得之細胞。呼吸道細胞可依照公知之方法由呼吸道組織製備。呼吸道細胞可以商業方式獲取。
本說明書中之用語「包含肺上皮細胞之樣本」例如可由哺乳動物之肺組織製備。包含肺上皮細胞之樣本例如可將規定之細胞標記物(例如細胞膜表面上之特定蛋白質)作為指標而自哺乳動物之肺組織製備。規定之細胞標記物例如可為EPCAM(Epithelial cell adhesion molecule，上皮細胞黏著分子)。又，亦可由包含肺上皮細胞之樣本製備包含所需之肺上皮細胞種之樣本。於製備包含所需之肺上皮細胞種之樣本時，基底細胞例如可將神經生長因子受體(NGFR)作為細胞標記物(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 106 (31): 12771 - 12775, 2009)，AT2細胞例如可將AT2-280作為細胞標記物(Journal of Histochemistry & Cytochemistry, vol. 58 (10): 891 - 901, 2010)。規定之細胞標記物可為存在於活細胞內之特定之RNA(Ribonucleic acid，核糖核酸)標的。RNA標的例如可為EPCAM、Sftpc、KRT-5或Scgb1a1。
於利用細胞膜表面上之特定蛋白質作為規定之細胞標記物之情形時，亦可使用結合有針對上述蛋白質之螢光物質之抗體，將來自該螢光物質之螢光作為指標。為了進行將細胞標記物作為指標之細胞之製備，可使用公知之裝置(例如FACS(Fluorescence-activated cell sorter，螢光激發細胞分選儀))。又，於利用RNA標的作為規定之細胞標記物之情形時，可包括如下步驟：於特定條件下利用FACS對包含肺上皮細胞之樣本進行區分，基於RNA標的(例如RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction，反轉錄聚合酶鏈反應))特定出所獲得之各份之部分標本中所包含之細胞種。
包含肺上皮細胞之樣本例如可藉由如下方式製備：將哺乳動物之肺組織切碎，利用蛋白酶(例如膠原酶、分散酶、彈性蛋白酶或胰蛋白酶)對上述肺組織片進行處理後，移至規定之溶液(例如基本培養基)中，使之懸浮。亦可對藉由上述方式製備之細胞懸浮液進行過濾及/或離心分離而將組織片等夾雜物去除。於一實施方式中，包含肺上皮細胞之樣本可由哺乳動物之成體、幼體、新生兒或兒童之肺組織製備。於一實施方式中，包含肺上皮細胞之樣本可包含在由哺乳動物之肺組織製備後，為了具有所需之特徵而實施了基因改變(其中，不包括如賦予多能性般之改變)之肺上皮細胞。
於一實施方式中，上述樣本中所包含之肺上皮細胞包含選自由基底細胞、棒狀細胞、支氣管肺泡上皮幹細胞及肺泡上皮細胞(例如AT1細胞及AT2細胞之任一者或兩者)所組成之群中之至少1種細胞種。包含肺上皮細胞之樣本可以商業方式獲取。包含肺上皮細胞之樣本例如可為包含人肺泡細胞之樣本、或包含人呼吸道細胞之樣本。於一實施方式中，上述樣本中所包含之肺上皮細胞本質上由選自由基底細胞、棒狀細胞、支氣管肺上皮幹細胞及肺泡上皮細胞所組成之群中之至少1種、至少2種或至少3種細胞組成。於一實施方式中，上述樣本中所包含之肺上皮細胞本質上由2型肺泡上皮細胞組成。於一實施方式中，上述樣本中所包含之肺上皮細胞本質上由棒狀細胞組成。於一實施方式中，上述樣本中所包含之肺上皮細胞本質上由基底細胞及棒狀細胞之組合組成。肺上皮細胞之文理中之「本質上由…組成」不排除「僅由…所組成」。於一實施方式中，上述樣本中所包含之肺上皮細胞僅由特定之細胞種所組成。上述樣本中所包含之肺上皮細胞例如包含80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、99%以上之特定之細胞種。
於一實施方式中，本態樣之方法進而包括由哺乳動物之肺組織製備包含上述肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本之步驟。上述樣本之製備可依照本說明書中揭示之方法或公知之方法實施。本說明書中之用語「肺癌細胞」例如為來自肺腫瘤之腫瘤細胞。肺癌細胞例如可為在血液中循環之腫瘤細胞，或者亦可為不在血液中循環之腫瘤細胞。肺癌細胞例如可以商業方式獲取，或者亦可依照公知之方法由包含腫瘤細胞之肺組織製備。肺癌細胞例如為肺腺癌細胞。
本說明書中之用語「包含肺癌細胞之樣本」例如可將肺癌細胞標記物作為指標而自罹患肺癌之哺乳動物之肺組織中分取。肺癌細胞標記物例如可為SOX2、CD24、CD44、CD133、CD166、及ESA之任一者或其等之組合。肺癌細胞例如可將肺癌細胞標記物作為指標而利用FACS分取。包含肺癌細胞之樣本例如可藉由如下方式製備：將以商業方式獲取之肺癌細胞進行培養而使其增殖，並使藉此獲得之細胞懸浮於規定之溶液中。包含肺癌細胞之樣本例如可依照關於包含肺上皮細胞之樣本所述之方法製備。包含肺癌細胞之樣本例如亦可包含正常之肺上皮細胞。
本說明書中之用語「哺乳動物」例如為人、除人以外之哺乳動物。除人以外之哺乳動物例如可為：小鼠、大鼠、土撥鼠、倉鼠等嚙齒類；黑猩猩等非人靈長類；牛、山羊、綿羊等偶蹄目；馬等奇蹄目；兔、狗、貓等寵物。於一實施方式中，哺乳動物為嚙齒類或非人靈長類。於一實施方式中，哺乳動物為人。
本說明書中之用語「源自肺上皮細胞之類器官」或「源自肺癌細胞之類器官」意指於試管內(in vitro)形成之源自肺上皮細胞或肺癌細胞之三維活體組織類似體。於一實施方式中，源自肺上皮細胞之類器官或源自肺癌細胞之類器官為藉由在包含本發明之添加劑之培養用培養基中培養肺上皮細胞或肺癌細胞而形成之類器官。於一實施方式中，源自肺上皮細胞之類器官包含內腔、及面對上述內腔之細胞層。
本說明書中之用語「培養用培養基」意指包含細胞培養所需之成分之液體。培養用培養基例如包含基本培養基及本發明之添加劑。培養用培養基例如可藉由將基本培養基與本發明之添加劑加以組合而製備。培養用培養基例如可藉由如下方式製備：將用於製備基本培養基之規定量之各成分(固體)與規定量之本發明之添加劑(固體)加以混合而獲得混合物，再將該混合物與成為規定濃度之量之純水加以混合。培養用培養基亦可進而包含細胞外基質及輔助幹細胞之增殖之餵養細胞之任一者或兩者。培養用培養基例如可藉由如下方式製備：將基本培養基與本發明之添加劑加以混合而獲得混合物，再向該混合物中添加細胞外基質及輔助幹細胞之增殖之餵養細胞之任一者或兩者。
本說明書中之用語「基本培養基」可為公知之細胞培養用之培養基，例如可為杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)、最低限度必需培養基(MEM)、伊格爾基本培養基(BME)、或DMEM/F12。於一實施方式中，基本培養基為DMEM/F12。
本發明之「添加劑」意指對源自肺上皮細胞或肺癌細胞之類器官之形成效率產生影響之2種以上之物質之組合。添加劑例如可為提高源自肺上皮細胞或肺癌細胞之類器官之形成效率之2種以上之物質之組合。添加劑例如可包含維持構成所形成之類器官之細胞之分化能力或誘導其向特定之細胞種分化之物質。
於一實施方式中，添加劑可為包含選自由角質細胞生長因子(KGF)、肝細胞生長因子(HGF)及纖維母細胞生長因子(FGF)10所組成之群中之至少1種、骨形態生成蛋白(BMP)抑制劑(例如Noggin)、以及TGFβ抑制劑(例如SB431542)之組合或由其等所組成之組合。就有效率地形成AT2之類器官之觀點而言，上述組合較佳為進而包含Wnt訊息活化劑(例如CHIR99021)。上述組合可進而包含Rock抑制劑(例如Y-27632)。
就有效率地形成類器官之觀點而言，添加劑為包含Wnt訊息活化劑(例如CHIR99021)、BMP抑制劑(例如Noggin)、TGFβ抑制劑(例如SB431542)、及HGF之組合或由其等所組成之組合。上述組合可進而包含Rock抑制劑。
就更有效率地形成類器官之觀點而言，添加劑為包含KGF及FGF10之任一者或兩者、BMP抑制劑(例如Noggin)、TGFβ抑制劑(例如SB431542)、及HGF之組合或由其等所組成之組合。於一實施方式中，添加劑為包含KGF、FGF10、BMP抑制劑(例如Noggin)、TGFβ抑制劑(例如SB431542)、及HGF之組合或由其等所組成之組合。就有效率地形成AT2之類器官之觀點而言，上述組合較佳為進而包含Wnt訊息活化劑(例如CHIR99021)。上述組合可進而包含Rock抑制劑。
就進一步有效率地形成類器官之觀點而言，添加劑為包含KGF、FGF10、Wnt訊息活化劑(例如CHIR99021)、BMP抑制劑(例如Noggin)、TGFβ抑制劑(例如SB431542)、HGF、及FGF10之組合或由其等所組成之組合。添加劑例如為包含KGF、FGF10、Wnt訊息活化劑(例如CHIR99021)、BMP抑制劑(例如Noggin)、TGFβ抑制劑(例如SB431542)、HGF、FGF10、及Rock抑制劑之組合或由其等所組成之組合。
本說明書中之用語「角質細胞生長因子(KGF)」意指刺激構成皮膚表面、口腔、胃及腸道等之黏膜之上皮細胞之增殖的物質。KGF例如可以商業方式獲取。KGF於存在於培養用培養基中之情形時，例如為10～250 ng/mL、20～100 ng/mL、30～70 ng/mL之濃度，較佳為50 ng/mL之濃度。KGF於本說明書中有時簡寫為「K」。
本說明書中之用語「肝細胞生長因子(HGF)」意指作為肝細胞之最強有力之生長因子已知之細胞激素。HGF通常具有分子量約6萬之重鏈與分子量約3.5萬之輕鏈雙硫鍵結而成之異源二聚物之結構。HGF例如可以商業方式獲取。HGF於存在於培養用培養基中之情形時，例如為5～150 ng/mL、10～75 ng/mL、20～40 ng/mL之濃度，較佳為30 ng/mL之濃度。HGF於本說明書中有時簡寫為「H」。
本說明書中之用語「纖維母細胞生長因子(FGF)10」意指藉由刺激上皮細胞之增殖、移動及分化，而促進受到損傷之皮膚或黏膜組織之修復的訊息因子。FGF10例如可以商業方式獲取。FGF10於存在於培養用培養基中之情形時，例如為10～250 ng/mL、20～100 ng/mL、30～70 ng/mL之濃度，較佳為50 ng/mL之濃度。FGF10於本說明書中有時簡寫為「F10」。
本說明書中之用語「Wnt訊息活化劑」意指於細胞內使由T細胞轉錄因子(TCF/LEF)介導之轉錄活化之物質。Wnt訊息活化劑亦被稱為Wnt促效劑。Wnt訊息活化劑例如可為抑制由磷酸分子對絲胺酸與蘇胺酸之胺基酸殘基之加成介導之絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶即GSK-3之作用的物質(亦稱為「GSK-3抑制劑」)、Wnt家族蛋白質、或β-連環蛋白分解抑制劑，或者亦可為該等中之2種以上之組合。Wnt訊息活化劑例如可以商業方式獲取。
Wnt訊息活化劑例如可為GSK-3抑制劑。GSK-3抑制劑例如可為SB216763(Chemscene公司)、CHIR-98014(Abcam)、TWS119(Cayman Chemical公司)、或CHIR99021(SIGMA)，或者亦可為其等中之2種以上之組合。Wnt訊息活化劑例如可為Wnt家族蛋白質(亦稱為「Wnt配體」)。Wnt家族蛋白質例如可為該領域中公知之19種源自Wnt基因之蛋白質之任一種或2種以上之組合。Wnt家族蛋白質例如可為Wnt1、2、3a、6、7a、7b、8a、9a、10a或16，或者亦可為其等中之2種以上之組合。Wnt家族蛋白質例如可為Wnt1。Wnt訊息活化劑例如可為β-連環蛋白分解抑制劑。β-連環蛋白分解抑制劑例如可為抑制β-連環蛋白之磷酸化之物質(例如UBE1-41)。
於一實施方式中，Wnt訊息活化劑為GSK-3抑制劑。GSK-3抑制劑較佳為CHIR99021。Wnt訊息活化劑於存在於培養用培養基中之情形時，例如為0.5～15 μM、1～7 μM、2～5 μM之量，較佳為表現出與3 μM之CHIR99021所表現出之抑制作用相當的抑制作用之量。CHIR99021於本說明書中有時簡寫為「C」。
本說明書中之用語「BMP抑制劑」意指與BMP分子結合而形成複合體之物質。BMP抑制劑例如可為低分子化合物、蛋白質(例如抗體)、DNA(Deoxyribonucleic acid，去氧核糖核酸)、RNA、低分子干擾RNA、或反義寡核苷酸。BMP抑制劑例如可以商業方式獲取。BMP抑制劑例如可為Noggin(Bmp抑制劑)、腱蛋白或包含腱蛋白結構域之腱蛋白樣蛋白質(R&D systems)、濾泡抑素或包含濾泡抑素結構域之濾泡抑素相關蛋白(R&D systems)、DAN或包含DAN半胱胺酸結節結構域之DAN樣蛋白質(R&D systems)、骨硬化蛋白/SOST(sclerosteosis，硬化性骨化病)(R&D systems)、核心蛋白聚糖(R&D systems)、或α-2巨球蛋白(R&D systems)，或者亦可為其等中之2種以上之組合。於一實施方式中，BMP抑制劑為Noggin。BMP抑制劑於存在於培養用培養基中之情形時，例如為20～500 ng/ml、40～250 ng/ml、80～125 ng/ml之量，較佳為表現出與100 ng/ml之Noggin所表現出之抑制作用相當的抑制作用之量。Noggin於本說明書中有時簡寫為「N」。
本說明書中之用語「TGFβ抑制劑」意指抑制TGFβ訊息傳遞之物質。TGFβ抑制劑例如意指抑制與TGFβ結合而活化之I型受體(ALK5)因絲胺酸/蘇胺酸激酶產生之由Smad2/3蛋白質之磷酸化介導之細胞內訊息傳遞的物質。TGF-β抑制劑例如可為低分子化合物、蛋白質(例如抗體)、DNA、RNA、低分子干擾RNA、或反義寡核苷酸。TGF-β抑制劑可為A83-01(Abcam)、SB-431542(Calbiochem)、SB-505124(R&D systems)、SB-525334(Chemscene LLC)、LY364947(Sigma-Aldrich)、SD-208(Sigma-Aldrich)、或SJN2511(R&D systems)，或者亦可為其等中之2種以上之組合。於一實施方式中，TGFβ抑制劑為SB431542。TGFβ抑制劑於存在於培養用培養基中之情形時，例如為2～50 μM、4～25 μM、8～12 μM之量，較佳為表現出與10 μM之SB431542所表現出之抑制作用相當的抑制作用之量。SB431542於本說明書中有時簡寫為「S」。
本說明書中之用語「上皮細胞生長因子(EGF)」意指與存在於細胞表面之上皮生長因子受體(EGFR)結合而承擔細胞之生長及增殖之調節作用的蛋白質。EGF通常具有53個胺基酸殘基及3個分子內雙硫鍵且具有約6,000道爾頓之分子量。EGF例如可以商業方式獲取(例如Corning公司)。EGF於存在於培養用培養基中之情形時，例如為5～125 ng/ml、10～60 ng/ml、20～30 ng/ml，較佳為25 ng/ml。EGF於本說明書中有時簡寫為「E」。
本說明書中之用語「Rho-激酶(ROCK)抑制劑」例如為R-(+)-反式-4-(1-胺基乙基)-N-(4-吡啶基)環己烷甲醯胺二鹽酸鹽一水合物(Y-27632，Sigma-Aldrich)、5-(1,4-二氮雜環庚烷-1-基磺醯基)異喹啉(法舒地爾或HA1077，Cayman Chemical公司)、或(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基)磺醯基]-六氫-1H-1,4-二氮呯二鹽酸鹽(H-1152，Tocris Bioscience)。ROCK抑制劑例如可以商業方式獲取。於一態樣中，ROCK抑制劑為Y-27632。Rock抑制劑於存在於培養用培養基中之情形時，例如為2～50 μM、4～25 μM、8～12 μM之量，較佳為表現出與10 μM之Y-27632所表現出之抑制作用相當的抑制作用之量。Y-27632於本說明書中有時簡寫為「Y」。
於一實施方式中，本發明之添加劑可為選自由KGF、FGF10及HGF所組成之群中之至少1種、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合。上述添加劑可進而包含Wnt訊息活化劑及ROCK抑制劑之任一者或兩者。於一實施方式中，上述添加劑例如可為KGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；KGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；FGF10、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；FGF10、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；HGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；HGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；KGF、FGF10、HGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；KGF、FGF10、HGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；ROCK抑制劑、KGF、FGF10、HGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；或ROCK抑制劑、KGF、FGF10、HGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合。於上述添加劑中，上述BMP抑制劑可為Noggin，上述TGFβ抑制劑可為SB431542，上述Wnt訊息活化劑可為CHIR99021，及/或上述ROCK抑制劑可為Y-27632。
於一實施方式中，培養用培養基包含「細胞外基質」。細胞外基質(ECM)並無限定，但包含水、多糖、彈性蛋白、整合素、及糖蛋白。糖蛋白例如包含膠原蛋白、內動素(巢蛋白)、纖維黏連蛋白、及層黏連蛋白。ECM例如可藉由如下方式製備：於試管內培養ECM生成細胞(例如上皮細胞、內皮細胞、壁內胚層樣細胞、或纖維母細胞)後，將上述ECM細胞去除。ECM生成細胞例如可為：主要生成膠原蛋白及蛋白多醣之軟骨細胞；主要生成IV型膠原蛋白、層黏連蛋白、間質膠原蛋白原、及纖維黏連蛋白之纖維母細胞；以及主要生成膠原蛋白(I型、III型、及V型)、硫酸軟骨素蛋白多醣、玻尿酸、纖維黏連蛋白、及肌腱蛋白-C之結腸肌纖維母細胞。ECM可以商業方式獲取。可以商業方式獲取之細胞外基質例如可為細胞外基質蛋白質(Invitrogen)、源自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤細胞之基底膜製備物(例如Cultrex(註冊商標)基底膜萃取物(Trevigen, Inc.)、或Matrigel(註冊商標)(corning公司))。ECM可為合成細胞外基質(例如ProNectin(Sigma Z378666))。細胞外基質可為1種，或者亦可為2種以上之混合物。於一實施方式中，ECM為Matrigel。於一實施方式中，培養用培養基不包含細胞外基質。
細胞外基質於存在於培養用培養基中之情形時，可作為「分散成分」存在。作為分散成分之細胞外基質並無限定，為細胞外基質成分分散或溶解於培養用培養基中之狀態。作為分散成分之細胞外基質例如以每單位體積之培養用培養基中上述細胞外基質為10%v/v以下、7%v/v以下、5%v/v以下、例如2.5%v/v之分量存在。於一實施方式中，培養用培養基以0～10%v/v、0～7%v/v、0～5%v/v、0.1～10%v/v、0.1～7%v/v、0.1～5%v/v、1～10%v/v、1～7%v/v、1～5%v/v、1～2.5%v/v、2～10%v/v、  2～7%v/v、2～5%v/v、或2～2.5%v/v之分量包含細胞外基質。於細胞外基質包含源自生物體之產物(例如源自小鼠肉瘤細胞之基底膜製備物)之情形時，就防止或降低所製造之類器官之污染之觀點而言，培養用培養基中之細胞外基質之含有濃度較佳為低濃度。
細胞外基質於存在於培養用培養基中之情形時，可作為「支架」存在。作為支架之細胞外基質並無限定，為提供至少局部模仿細胞天然存在之細胞生態區位之微小環境的形態。作為支架之細胞外基質例如可為凝膠之形態。作為支架之細胞外基質例如可為以超過10%v/v、20%v/v以上、30%v/v以上、50%v/v以上、或70%v/v以上之濃度形成之凝膠。
本說明書中之用語「餵養細胞」意指用於輔助幹細胞之增殖之細胞種。餵養細胞通常與目標細胞一起培養，用以提供適合於輔助目標細胞之增殖之表面。餵養細胞為特定之細胞種(例如初生成獸小鼠纖維母細胞、小鼠纖維母細胞株(MLg)、人類胎兒纖維母細胞株：MRC-5)本身，或者藉由預先以不會致死之程度投予抗生物質或照射γ射線而製備。由於餵養細胞之使用會使目標細胞之繼代操作變得複雜，故而不理想。於一實施方式中，培養用培養基實質上不包含餵養細胞。本說明書中之用語「實質上不包含」不排除「完全不包含」。於一實施方式中，實質上不包含餵養細胞之培養用培養基完全不包含餵養細胞。於一實施方式中，實質上不包含餵養細胞之培養用培養基相對於所培養之包含肺上皮細胞或肺癌細胞之培養細胞之數量，可包含未達3%、未達2%、未達1%、或未達0.5%之餵養細胞。較佳為包含所培養之肺上皮細胞或肺癌細胞之培養用培養基不包含餵養細胞。
作為用以於培養用培養基中「培養」包含肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本之方法，可使用專利文獻2所揭示之方法。上述培養例如可包括如下步驟：將包含肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本添加於培養容器中之培養用培養基中，於37℃且5%CO2 下維持上述培養用培養基。培養溫度不限定於37℃，可適當地使用細胞培養領域公知之溫度。CO2 濃度不限定於5%，可適當地使用細胞培養領域公知之CO2 濃度。上述培養用培養基可以任意間隔、例如每1～14天、每2～12天、或每3～10天更換為新的培養用培養基。於例如所培養之細胞為肺上皮細胞之情形時，培養用培養基可每3～7天、每3～5天、或每3天進行更換。於例如所培養之細胞為肺癌上皮幹細胞之情形時，培養用培養基可每3～14天、每5～10天、或每10天進行更換。
可將藉由上述培養所形成之「源自肺上皮細胞之類器官」或「源自肺癌細胞之類器官」自培養用培養基中單離。單離例如可包括如下步驟：基於其尺寸分取細胞而將未形成細胞塊之細胞與類器官分離。單離例如可使用CELL HANDLER(Yamaha公司)進行。
於一實施方式中，本態樣之方法包括如下步驟：於在包含本發明之添加劑之培養用培養基中培養由哺乳動物之肺組織所製備之包含肺上皮細胞之樣本之前，基於針對棒狀細胞-I、AT2細胞及棒狀細胞-II各者於表A中列舉之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種，自上述樣本選擇棒狀細胞-I、AT2細胞或棒狀細胞-II。 [表1]
表A      
棒狀細胞-I AT2細胞 棒狀細胞-II
Cbr2 Lamp3 Tff2
Hp Lyz2 Reg3g
Cyp2f2 Napsa Bpifb1
Prdx6 Slc34a2 Muc5b
Scgb1a1 Lyz1 Sult1d1
Ldhb Rnase4 Fxyd3
Ces1d Hc Scgb3a1
Cckar Cd74 Lypd2
Selenbp1 Scd1 Chad
Gstm2 Sftpc S100a6
Scnn1b Lgi3 Pglyrp1
Scgb1c1 Cldn18 Aldh3a1
Plpp3 Etv5 Bpifa1
Ephx1 Cxcl15 Gsto1
Dcxr S100g Lgals3
Alas1 Elovl1 Pigr
Retnla Fas Scgb3a2
Sec14l3 H2-Aa Ltf
Ptgr1 Fabp5 Qsox1
Krtap17-1 Rn4.5s Cyp2a5
      Cpd
      Ly6a
      Perp
      Kcne3
      Il13ra1
      Slc15a2
      Cd14
於一實施方式中，上述方法包括如下步驟：基於針對棒狀細胞-I於表A中列舉之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種，自上述樣本選擇棒狀細胞-I。於一實施方式中，上述方法包括如下步驟：基於針對AT2細胞於表A中列舉之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種，自上述樣本選擇AT2細胞。於一實施方式中，上述方法包括如下步驟：基於針對棒狀細胞-II於表A中列舉之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種，自上述樣本選擇棒狀細胞-II。
於本說明書中，用語「棒狀細胞-I」意指表現出表A中所列舉之細胞標記物以及其等之同源物中之至少1種的棒狀細胞。棒狀細胞-I例如於包含本發明之添加劑之培養用培養基中形成類器官。棒狀細胞-I例如表現出選自由Cbr2、Hp、Cyp2f2、Prdx6、Scgb1a1、Ldhb、Ces1d、Cckar、Selenbp1、Gstm2、Scnn1b、Scgb1c1、Plpp3、Ephx1、Dcxr、Alas1、Retnla、Sec14l3、Ptgr1、及Krtap17-1以及其等之同源物所組成之群中之至少1種、至少2種、至少3種、或至少4種細胞標記物。
於本說明書中，用語「棒狀細胞-II」意指表現出表A中所列舉之細胞標記物以及其等之同源物中之至少1種的細胞。棒狀細胞-II例如於包含本發明之添加劑之培養用培養基中形成類器官。棒狀細胞-II例如相較於棒狀細胞-I，形成類器官之傾向更高。棒狀細胞-II例如表現出選自由Tff2、Reg3g、Bpifb1、Muc5b、Sult1d1、Fxyd3、Scgb3a1、Lypd2、Chad、S100a6、Pglyrp1、Aldh3a1、Bpifa1、Gsto1、Lgals3、Pigr、Scgb3a2、Ltf、Qsox1、Cyp2a5、Cpd、Ly6a、Perp、Kcne3、Il13ra1、Slc15a2、及Cd14以及其等之同源物所組成之群中之至少1種、至少2種、至少3種、或至少4種細胞標記物。棒狀細胞-II例如表現出選自由Fxyd3、Pigr、Cpd、Ly6a、Perp、Kcne3、Il13ra1、Slc15a2、及Cd14以及其等之同源物所組成之群中之至少1種、至少2種、至少3種、或至少4種細胞標記物。
基於細胞標記物選擇規定細胞之實施方式中之用語「AT2細胞」或「2型肺泡上皮細胞」意指表現出表A中所列舉之細胞標記物以及其等之同源物中之至少1種之AT2細胞。上述AT2細胞例如於包含本發明之添加劑之培養用培養基中形成類器官。上述AT2細胞例如表現出選自由Lamp3、Lyz2、Napsa、Slc34a2、Lyz1、Rnase4、Hc、Cd74、Scd1、Sftpc、Lgi3、Cldn18、Etv5、Cxcl15、S100g、Elovl1、Fas、H2-Aa、Fabp5、及Rn4.5s以及其等之同源物所組成之群中之至少1種、至少2種、至少3種、或至少4種細胞標記物。
於本說明書中，「選擇」規定之細胞意指自包含複數種細胞之樣本中選擇規定之細胞。規定細胞之選擇例如可藉由如下方式實施：自包含各種細胞之樣本測定規定之細胞標記物(例如表A中記載之細胞標記物)之表現，基於其測定結果，分取出表現出上述規定之細胞標記物之細胞作為規定之細胞。規定細胞之選擇例如可利用螢光激發細胞分選術(FACS)來實施。FACS例如可使用對與規定之細胞標記物結合之探針(例如抗體)接合螢光物質而成之螢光探針，利用可以商業方式獲取之FACS裝置來實施。於一例中，在受檢細胞中之規定之細胞標記物之表現等級高於陰性對照中之上述規定之細胞標記物之表現等級時，可選擇上述受檢細胞作為規定之細胞。螢光物質例如可依照公知之方法製備，或者可以商業方式獲取。與規定之細胞標記物結合之探針、例如抗體可依照公知之方法製備，或者可以商業方式獲取。螢光物質與上述探針之接合例如可依照公知之方法實施。於一實施方式中，規定之肺上皮細胞之選擇可基於表A中記載之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種之表現來實施。
於本說明書中，用語「同源物」意指同種或異種生物間，其序列及功能類似之基因或蛋白質。於本說明書中，同源物包含直系同源物(ortholog)、旁系同源物(paralog)及異同源物(xenolog)。特定之基因或蛋白質之「同源物」例如相對於上述特定之基因或蛋白質之序列，具有至少75%、80%、85%或90%之同源性，較佳為具有至少95%、96%、97%、98%或99%之同源性。同源性意指使用業者周知之對位演算法對2個基因或蛋白質之序列進行整理後該等2個序列間相同之核苷酸或胺基酸殘基的比率。同源性例如可使用公知之方法或可公開獲取之電腦程式(例如BLAST或FASTA)來執行。
於本說明書中，用語「Cbr2」係指羰基還原酶2，參與NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，還原態之菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)之合成。 於本說明書中，用語「Hp」係指結合球蛋白，為血紅素結合蛋白。 於本說明書中，用語「Cyp2f2」係指細胞色素P450(CYP)2f2，為存在於內質網膜之小鼠特異性膜結合蛋白。除小鼠以外之哺乳動物中之Cyp2f2之同源物係眾所周知的，例如其人同源物為CYO2F1。 於本說明書中，用語「Prdx6」係指過氧化物還原酶-6，為屬於抗氧化酶之過氧化物還原酶家族之蛋白質。於人類中由PDRX6基因編碼。 於本說明書中，用語「Scgb1a1」係指分泌球蛋白家族1A成員1，具有抗炎症性功能。
於本說明書中，用語「Ldhb」係指乳酸脫氫酶B，係由LDHB基因編碼之LDH酶之單體。 於本說明書中，用語「Ces1d」係指羧基酯酶1d。 於本說明書中，用語「Cckar」係指膽囊收縮素A受體，Cckar係與肽激素結合之G蛋白偶聯受體之2種不同亞型中之亞型A。
於本說明書中，用語「Selenbp1」係指硒結合蛋白1，為屬於硒結合蛋白家族之蛋白質。Selenbp1於人類中由SELENBP1基因編碼。 於本說明書中，用語「Gstm2」係指麩胱甘肽S-轉移酶Mu2，為於人類中由GSTM2基因編碼之酶。 於本說明書中，用語「Scnn1b」係指鈉通道次單元β1，為於人類中由SCN1B基因編碼之蛋白質。
於本說明書中，用語「Scgb1c1」係指分泌球蛋白1C1，亦作為配體結合蛋白RYD5為人所知。Scgb1c1由分泌球蛋白1C1基因編碼。 於本說明書中，用語「Plpp3」係指磷脂質磷酸酶3，亦作為磷脂酸磷酸酶2B型為人所知。Plpp3係於人類中由第1染色體上之PPAP2B基因編碼之酶。 於本說明書中，用語「Ephx1」係指環氧化物水解酶1，為於人類中由EPHX1基因編碼之酶。
於本說明書中，用語「Dcxr」係指二羰基L-木酮糖還原酶，為參與各種生理學系統中之各種蛋白質相互作用過程之多功能蛋白質。 於本說明書中，用語「Alas1」係亦作為δ-胺基乙醯丙酸合成酶1為人所知之蛋白質，於人類中由ALAS1基因編碼。 於本說明書中，用語「Retnla」係指抵抗素樣分子α(Resistin-like molecule alpha)，為屬於富含半胱胺酸之小分子分泌蛋白家族之蛋白質。
於本說明書中，用語「Sec14l3」係指SEC14-like3，係亦作為維生素E相關蛋白2為人所知之對源自高爾基之傳輸囊泡之生物合成發揮重要作用的磷脂醯肌醇轉移蛋白。 於本說明書中，用語「Ptgr1」係指前列腺素還原酶-1，為參與類花生酸之異化作用及4-羥基壬烯醛等之脂質過氧化之蛋白質。 於本說明書中，用語「Krtap17-1」係指角蛋白相關蛋白17-1，為屬於角蛋白相關蛋白(KAP)家族之蛋白質。
於本說明書中，用語「Tff2」係指三葉因子2，為於人類中由TFF2基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Reg3g」係指胰島再生源蛋白3γ，為於人類中由REG3G基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Bpifb1」係指BPI(Bactericidal/permeability-increasing，殺菌/通透性增加)摺疊家族B成員1，為於人類中由BPIFB1基因編碼之蛋白質。
於本說明書中，用語「Muc5b」係指黏蛋白5亞型B，為於人類中由MUC5B基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Sult1d1」係指硫酸轉移酶1D成員1，將硫酸基轉移至激素、神經傳導物質。已知於人之情形時，藉由變異而偽基因化。 於本說明書中，用語「Fxyd3」係指含有FXYD域之離子傳輸調節器3，為於人類中由FXYD3基因編碼之蛋白質。
於本說明書中，用語「Scgb3a1」係指分泌球蛋白家族3A成員1，為於人類中由SCGB3A1基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Lypd2」係指含有Ly6/PLAUR域之蛋白2，為於人類中由LYPD1基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Chad」係指鈣黏蛋白，為參與動物細胞間之黏著之跨膜型糖蛋白。
於本說明書中，用語「S100a6」係指S100鈣結合蛋白A6，為於人類中由S100A6基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Pglyrp1」係指肽聚醣識別蛋白1，為於人類中由PGLYRP1基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Aldh3a1」係指醛脫氫酶3家族成員A1，為於人類中由ALDH3A1基因編碼之蛋白質。
於本說明書中，用語「Bpifa1」亦稱為Palate lung and nasal epithelium clone protein齶/肺/鼻上皮克隆蛋白(PLUNC)，為由BPIFA1(Bactericidal/permeability-increasing fold-containing family A1，殺菌/通透性增加摺疊家族A1)基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Gsto1」係指麩胱甘肽S-轉移酶Ω-1，為於人類中由GSTO1基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Lgals3」係指半乳糖凝集素-3，為於人類中由LGALS3基因編碼之屬於凝集素家族之蛋白質。
於本說明書中，用語「Pigr」係指高分子免疫球蛋白受體，為於人類中由PIGR基因編碼之跨膜蛋白。 於本說明書中，用語「Scgb3a2」係指分泌球蛋白家族3A成員2，為於人類中由SCGB3A2基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Ltf」係指乳鐵蛋白，為於哺乳動物中主要存在於乳汁中之鐵結合性糖蛋白。
於本說明書中，用語「Qsox1」係指硫氫基氧化酶1，為於人類中由QSOX1基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Cyp2a5」係指細胞色素P450(CYP)2A5，為於小鼠中在肝臟及鼻腔之嗅上皮中表現之蛋白質。除小鼠以外之哺乳動物中之Cyp2a5之同源物或直系同源物係眾所周知的，例如其人直系同源物為CYP2A6/13，大鼠直系同源物為CYP2A3。
於本說明書中，用語「Cpd」係指羧基肽酶D，為於人類中由CPD基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Ly6a」係指淋巴細胞抗原6複合物、基因座A，為亦稱為Sca-1之糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定蛋白。 於本說明書中，用語「Perp」係指與PMP-22相關之p53細胞凋亡效應物，為於人類中由PERP基因編碼之膜蛋白。
於本說明書中，用語「Kcne3」係指電位閘控鉀離子通道-Isk相關家族-成員3，亦稱為MinK相關肽2(MiRP2)。Kcne3為於人類中由KCNE3基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Il13ra1」係指介白素13受體次單元α1，藉由構成介白素4受體α與異源二聚物，而作為介白素13之受體發揮作用。 於本說明書中，用語「Slc15a2」係指溶質載體家族15成員2，作為質子結合肽轉運體發揮功能。
於本說明書中，用語「Cd14」係指CD14蛋白，發揮構成自然免疫系統之作用。CD14例如可為作為膜結合型蛋白之mCD14，或者亦可為作為可溶性蛋白之sCD14。於選擇棒狀細胞-II細胞之文理中，CD14例如為mCD14。 於本說明書中，用語「Lamp3」係指溶酶體相關膜糖蛋白3，為於人類中由LAMP3基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Lyz2」係指溶菌酶C-2。
於本說明書中，用語「Napsa」係指Napsin A，為於人類中由NAPSA基因編碼之天冬胺酸蛋白酶。 於本說明書中，用語「Slc34a2」係指鈉依賴性磷酸轉運蛋白2B(NaPi2b)，為於人類中由SLC34A2基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Lyz1」係指溶菌酶C-1。
於本說明書中，用語「Rnase4」係指核糖核酸酶4，為於人類中由RNASE4基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Hc」係指溶血補體。為自然免疫中之補體系統之構成要素。 於本說明書中，用語「Cd74」係指第二類HLA(Human leukocyte antigen，人類白血球抗原)組織相容性抗原γ鏈，為於人類中由CD74基因編碼之蛋白質。
於本說明書中，用語「Scd1」係指硬脂醯基-CoA去飽和酶-1，為對於脂肪酸代謝而言重要之酶。 於本說明書中，用語「Sftpc」係指表面活性蛋白C(SP-C)，為肺表面活性蛋白之一。Sftpc於人類中由SFTPC基因編碼。 於本說明書中，用語「Lgi3」係指富白胺酸神經膠質瘤不活化3，為屬於LGI家族之脊椎動物中之分泌蛋白。
於本說明書中，用語「Cldn18」係指密連蛋白18，為於人類中由CLDN18基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Etv5」係指Ets變異體5，亦稱為ERM轉錄因子。Etv5為於人類中由ETV5基因編碼之轉錄因子。 於本說明書中，用語「Cxcl15」係指趨化因子(C-X-C模體)配體15，為屬於CXC趨化因子家族之細胞激素。
於本說明書中，用語「S100g」係指S100鈣結合蛋白G，為於人類中由S100G基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Elovl1」係指脂肪酸延伸酶1，為於飽和及一元不飽和極長鏈脂肪酸之產生中發揮重要作用之酶。 於本說明書中，用語「Fas」係指脂肪酸合成酶，為於人類中由FASN基因編碼之酶。
於本說明書中，用語「H2-Aa」係指組織蛋白H2A型1-A，為於人類中由HIST1H2AA基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Fabp5」係指表皮型脂肪酸結合蛋白，為於人類中由FABP5基因編碼之蛋白質。 於本說明書中，用語「Rn4.5s」係指4.5S RNA。
於一實施方式中，本態樣之方法包括如下步驟：將於包含本發明之添加劑之培養用培養基中培養之肺上皮細胞進而於不含上述添加劑之培養用培養基中進行培養。於該實施方式中，於培養用培養基中培養之上述肺上皮細胞可形成類器官，或者亦可為直徑未達50 μm之細胞聚集體。於培養用培養基中培養之鹼肺上皮細胞較佳為形成類器官。藉由將於包含本發明之添加劑之培養用培養基中培養之肺上皮細胞進而於不含上述添加劑之培養用培養基中進行培養，可誘導所培養之肺上皮細胞之分化，例如自棒狀細胞向肺泡細胞(例如AT2細胞、AT1細胞)分化。
不含本發明之添加劑之培養用培養基例如可為基本培養基。於包含上述添加劑之培養用培養基中進行之上述細胞之培養例如可包括對所培養之細胞進行繼代操作。於不含上述添加劑之培養用培養基中進行之上述細胞之培養例如可包括對所培養之細胞進行繼代操作。於培養用培養基中培養上述細胞之天數並無特別限定。於培養用培養基中進行之上述細胞之培養例如可為1～30天、1～25天、或1～20天。
源自肺上皮細胞之類器官例如可模仿肺上皮組織之基本生理功能。因此，源自肺上皮細胞之類器官可用於再生醫療。又，源自肺癌細胞之類器官可用於用以治療肺癌之物質之篩選(NATURE COMMUNICATIONS 2019 103991)。
[源自肺上皮細胞或肺癌細胞之類器官] 本發明之一態樣提供一種源自肺上皮細胞或肺癌細胞之類器官。上述類器官可依照本發明之類器官之製造方法，由包含肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本製造。所製造之源自肺上皮細胞或肺癌細胞之類器官例如包含內腔、及面對上述內腔之細胞層。
於一實施方式中，源自肺上皮細胞之類器官包含內腔、及面對上述內腔之細胞層。上述類器官可為源自肺上皮細胞之類器官，或者亦可為源自呼吸道細胞之類器官。於一例中，源自肺上皮細胞之類器官包含內腔、及面對上述內腔之細胞層，上述細胞層本質上由AT2細胞組成。於上述例中，AT2細胞例如表現出HT2-280及SFTPC之任一者或兩者，且上述HT2-280於上述AT2細胞中局部存在於面對上述內腔之細胞膜或其附近。
於另一例中，源自肺上皮細胞之類器官包含內腔、及面對上述內腔之細胞層，上述細胞層本質上由AT2細胞與表現出AT2細胞標記物及支氣管上皮標記物之細胞之組合組成。於另一例中，源自肺上皮細胞之類器官包含內腔、及面對上述內腔之細胞層，上述細胞層本質上由表現出支氣管上皮標記物之細胞組成。於一例中，源自呼吸道細胞之類器官包含內腔、及面對上述內腔之細胞層，上述細胞層本質上由基底細胞與表現出基底細胞標記物及支氣管上皮標記物之細胞之組合組成。
上述AT2細胞標記物並無特別限定，可使用公知之AT2細胞標記物。AT2細胞標記物例如可為HT2-280及SFTPC中之任一者或兩者。上述支氣管上皮標記物並無特別限定，可使用公知之支氣管上皮標記物。支氣管上皮標記物例如可為SOX2。上述基底細胞標記物並無特別限定，可使用公知之上述基底細胞標記物。基底細胞標記物例如可為KRT5。
本說明書中之用語「HT2-280」係於2型肺泡上皮細胞中表現之280～300 kDa之蛋白質。本說明書中之用語「SFTPC」意指肺表面活性蛋白C。SFTPC具有在包含26個胺基酸之疏水性α螺旋結構中9個親水性胺基酸相連之結構。本說明書中之用語「SOX2」意指含有SRY-box所含之基因2。SOX2包含作為DNA結合部位之HMG(high mobility group proteins，高速泳動族蛋白)域與其C末端側之轉錄活化域。由於HMG域包含2個核定位訊息序列，故SOX2主要存在於核內。本說明書中之用語「KRT5」係中間絲蛋白，於人類中由KRT5基因編碼。
[再生醫療用組合物] 本發明之一態樣提供一種再生醫療用組合物。於一實施方式中，上述再生醫療用組合物包含本發明之源自肺上皮細胞之類器官、及/或上述類器官之細胞。於一實施方式中，上述再生醫療用組合物包含本質上由表現出表A中所列舉之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種之棒狀細胞-I、AT2細胞或棒狀細胞-II組成的肺上皮細胞。 [表2]
表A      
棒狀細胞-I AT2細胞 棒狀細胞-II
Cbr2 Lamp3 Tff2
Hp Lyz2 Reg3g
Cyp2f2 Napsa Bpifb1
Prdx6 Slc34a2 Muc5b
Scgb1a1 Lyz1 Sult1d1
Ldhb Rnase4 Fxyd3
Ces1d Hc Scgb3a1
Cckar Cd74 Lypd2
Selenbp1 Scd1 Chad
Gstm2 Sftpc S100a6
Scnn1b Lgi3 Pglyrp1
Scgb1c1 Cldn18 Aldh3a1
Plpp3 Etv5 Bpifa1
Ephx1 Cxcl15 Gsto1
Dcxr S100g Lgals3
Alas1 Elovl1 Pigr
Retnla Fas Scgb3a2
Sec14l3 H2-Aa Ltf
Ptgr1 Fabp5 Qsox1
Krtap17-1 Rn4.5s Cyp2a5
      Cpd
      Ly6a
      Perp
      Kcne3
      Il13ra1
      Slc15a2
      Cd14
再生醫療用組合物例如可為用於修復肺損傷或肺部疾病之醫藥組合物。於一實施方式中，包含本質上由表現出上述至少1種細胞標記物之棒狀細胞-I、AT2細胞或棒狀細胞-II組成的肺上皮細胞之再生醫療用組合物包含本發明之添加劑。於一例中，含有包含棒狀細胞-I或本質上由棒狀細胞-I組成之肺上皮細胞的再生醫療用組合物不會於已傳遞到上述棒狀細胞-I之肺中引起炎症等不良影響，具有形成類器官之能力，且可能具有分化成肺泡及支氣管系統之細胞之能力，因此可用於用以修復肺損傷或肺部疾病之再生醫療用組合物。於一例中，含有包含棒狀細胞-II或本質上由棒狀細胞-II組成之肺上皮細胞的再生醫療用組合物具有於已傳遞到上述棒狀細胞-II之肺中有效率地形成類器官之能力，且具有分化成肺泡及支氣管系統之細胞之能力，因此可用於用以修復肺損傷或肺部疾病之再生醫療用組合物。
於一例中，含有包含棒狀細胞-II或本質上由棒狀細胞-II組成之肺上皮細胞之再生醫療用組合物藉由使用棒狀細胞-II作為搬運用於治療受損之肺或罹患疾病之肺之藥劑(例如有機化合物、基因或蛋白質)的載體，而可用於用以治療肺損傷或肺部疾病之醫藥組合物。因此，本發明之一態樣提供一種醫藥組合物，其包含：肺上皮細胞，其本質上由棒狀細胞-II所組成，該棒狀細胞-II係自基於針對棒狀細胞-II於表A中列舉之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種，自由哺乳動物之肺組織所製備之包含肺上皮細胞的樣本中選出；及用於治療肺損傷或肺部疾病之藥劑。
再生醫療用組合物例如可適當地包含醫藥上容許之載體。再生醫療用組合物可依照公知之方法適當地製造。再生醫療用組合物例如可藉由將源自肺上皮細胞之類器官及/或上述類器官之細胞與醫藥上容許之載體加以混合而製造。「醫藥上容許之載體」意指於哺乳動物中安全性較高，過敏反應性較小之除本發明之源自肺上皮細胞之類器官以外之任意成分。醫藥上容許之載體例如包含適合醫藥投予之水性或非水性溶劑、溶液(例如生理鹽水、基本培養基或細胞懸浮保存液)、防凍劑(例如甘油)、水溶性高分子(例如葡聚糖)、或緩衝劑(例如磷酸緩衝液)。
上述源自肺上皮細胞之類器官可依照本發明之製造方法製備。上述源自肺上皮細胞之類器官例如包含內腔、及面對上述內腔之細胞層。「源自肺上皮細胞之類器官之細胞」可為構成源自肺上皮細胞之類器官之細胞塊之形態，及/或亦可為自源自肺上皮細胞之類器官分離之單個細胞之形態。自源自肺上皮細胞之類器官分離之單個狀態之細胞例如可藉由如下方式製備：利用蛋白酶(例如膠原酶、分散酶、彈性蛋白酶或胰蛋白酶)對上述類器官進行處理後，懸浮於規定之溶液(例如基本培養基)中。於再生醫療用組合物包含源自肺上皮細胞之類器官之細胞塊之形態的細胞時，上述再生醫療用組合物中之細胞塊例如可於對需要投予之哺乳動物進行投予之前，進行處理以使其成為單個狀態之細胞。
再生醫療用組合物例如藉由如下方式投予至需要投予之哺乳動物：利用外科手法移植至規定之部位，或藉由注射注入至規定之部位。就減輕移植片排斥反應之觀點而言，待投予再生醫療用組合物之哺乳動物與提供該類器官之肺上皮細胞之哺乳動物較佳為同一種，進而較佳為同一個體。於再生醫療用組合物之文理中，哺乳動物例如為人類。
本說明書中之用語「肺損傷」或「肺部疾病」例如可例舉：病原性疾病、肺癌(例如小細胞肺癌或非小細胞肺癌(例如腺癌、鱗狀細胞癌或大細胞癌))、間質性肺病、肺炎(例如器質化肺炎)、結核病、囊腫纖化症、支氣管炎、肺纖維化症、類肉瘤病、II型增生、慢性阻塞性肺病、肺氣腫、哮喘、肺水腫、急性呼吸窘迫症候群、喘鳴、支氣管擴張症、漢他病毒肺症候群、中東呼吸症候群(MERS)、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)及塵肺。病原性疾病例如可為由如下病毒或病菌引起之疾病：腺病毒、冠狀病毒(例如COVID-19(coronavirus disease 2019，新冠病毒肺炎)、SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS-CoV、或其等之變異株)、人類間質肺炎病毒、流行性感冒病毒、副流行性感冒病毒、呼吸道融合細胞病毒、鼻病毒、漢他病毒、腸病毒(例如腸病毒D68：EV-D68)、百日咳嗜血桿菌、肺炎披衣菌、白喉桿菌、伯納特氏柯克斯氏體、流行性感冒細菌、退伍軍人嗜肺部疾病菌、卡他莫拉菌、結核桿菌、肺炎黴漿菌、金黃葡萄球菌、肺炎鏈球菌、或化膿性鏈球菌。
[用於治療肺癌之物質之篩選方法] 本發明之一態樣提供一種用於治療肺癌之物質之篩選方法。上述篩選方法包括以下步驟：使根據本發明所製造之源自肺癌細胞之類器官與試驗樣品接觸；對與上述試驗樣品接觸後之類器官進行測定；及將與上述試驗樣品接觸後之類器官之測定值與對照值進行比較。於一實施方式中，上述方法包括基於比較結果判定上述試驗樣品是否為可治療肺癌之物質之步驟。
本說明書中之用語「肺癌」並無限定，可為小細胞肺癌或非小細胞肺癌(例如腺癌、鱗狀細胞癌或大細胞癌)。
本說明書中之用語「試驗樣品」例如可為低分子化合物、蛋白質(例如抗體)、DNA、RNA、低分子干擾RNA、或反義寡核苷酸。試驗樣品例如可為用於治療除肺癌以外之疾病或癌症之藥劑。試驗樣品例如可為1種，或者亦可為2種以上之混合物。試驗樣品較佳為1種物質。
使本發明之源自肺癌細胞之類器官與試驗樣品「接觸」意指將上述類器官與試驗樣品置於能夠接觸之情況下。上述類器官與試驗樣品之接觸例如可為向包含上述類器官之溶液中添加試驗樣品之步驟。
本說明書中之用語「對類器官進行測定」例如可為對類器官之尺寸進行測定，或對構成類器官之細胞之標記物蛋白之表現進行測定之步驟。類器官之尺寸例如可使用公知之裝置(例如顯微鏡或FACS)進行測定。構成類器官之細胞之標記物蛋白之表現可使用公知之裝置(例如顯微鏡或FACS)及公知之試劑(例如經螢光物質標記化之抗體)進行測定。類器官之尺寸例如可為類器官之周圍長度、直徑(例如長徑及短徑)或面積。構成類器官之細胞之標記物蛋白之表現例如可為每單位面積之類器官之與標記物蛋白之表現量相對應之螢光強度。所測定之標記物蛋白可為1種，或者亦可為2種以上之組合。所測定之標記物蛋白較佳為2種以上之組合。
本說明書中之用語「類器官之測定值」例如可為1次測定之1個測定值，亦可為複數次測定之平均值，還可為複數個類器官之測定值之平均值。類器官之測定值例如可為接觸試驗樣品前後之變化值(例如差量或倍數)。
本說明書中之用語「對照值」例如可為使用肺癌細胞治療用之藥劑作為對照物質時之測定值。關於對照值，於例如將接觸試驗樣品後之值設為類器官之測定值之情形時，可將接觸上述試驗樣品之前或未接觸上述試驗樣品之對照類器官之測定值設為對照值。
於例如測定值為類器官之尺寸之情形時，試驗樣品是否為可治療肺癌之物質之「判定」可包括如下步驟：於接觸過試驗樣品之類器官之尺寸之測定值小於對照值之情形時(即類器官之尺寸之增加程度降低或尺寸縮小之情形時)，判定上述試驗樣品為可治療肺癌之物質。
[培養用培養基] 本發明之一態樣提供一種用於由肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之培養用培養基。上述培養用培養基包含0～10%v/v之細胞外基質，且包含選自由角質細胞生長因子(KGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)10及肝細胞生長因子(HGF)所組成之群中之至少1種；骨形態生成蛋白(BMP)抑制劑；及TGFβ抑制劑之組合。
上述培養用培養基例如可為以各成分成為所需濃度之方式調配之液體形態。上述培養用培養基例如可為以藉由混合規定量之純水而使各成分成為所需濃度之方式調配之固體形態。
只要未特別提及，則本發明所提供之用語及實施方式之說明可適當地應用於本發明所提供之態樣及實施方式。
以下記載具體之實施例，但其等係揭示本發明之較佳實施方式者，不對隨附之申請專利範圍所記載之發明進行任何限定。 [實施例]
[製備例1] (包含肺上皮幹細胞之懸浮液之製備) 準備具有於人肺表面活性蛋白C(SFTPC)啟動子之控制下編碼綠色螢光蛋白(GFP)之基因，伴隨Sftpc之表現而表現出GFP之SFTPC-GFP小鼠(J Immunol 2008; 180: 881 - 888、及Rapid Communications: L349 - L356)。於SFTPC-GFP小鼠之肺末梢區域之組織切片中，進行針對Sftpc及Scgb1a1(別名為CC10或CCSP)之免疫染色。
Scgb1a1作為棒狀細胞之細胞標記物為人所知。上述免疫染色表明：肺泡區域中存在表現出Sftpc及GFP之AT2細胞，並且支氣管之末梢存在表現出Sftpc、GFP、及Scgb1a1之支氣管肺泡上皮幹細胞(BASCs)、以及較弱地表現出Sftpc及GFP且表現出Scgb1a1之棒狀細胞(別名為變異型棒狀細胞)。肺末梢區域中之GFP之表現圖案與STEM CELLS 2012; 30: 1948 - 1960中所報告之表現圖案相同。該免疫染色之結果揭示：藉由以GFP之表現處在SFTPC啟動子之控制下的GFP作為指標，能夠自SFTPC-GFP小鼠之肺組織中所包含之各種細胞中識別出作為肺上皮幹細胞之AT2細胞、BASCs及棒狀細胞。
利用二氧化碳使SFTPC-GFP小鼠安樂死，將血液去除。去除胸骨，使肺及氣管露出。自氣管插入靜脈留置針(Surflo)，通過其向上述肺及氣管中注入1.5 mL之蛋白酶溶液。自SFTPC-GFP小鼠切出肺，並移至注入有2.5 mL之蛋白酶溶液之培養皿中。於上述培養皿中將切出之肺切碎，藉由移液操作獲得肺組織懸浮液。對上述肺組織懸浮液施加4℃之離心分離(400 g×5分鐘)，分離出沈澱物與上清液，將上述上清液廢棄。向上述沈澱物中添加含有3%FBS(fetal bovine serum，胎牛血清)之PBS(phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝液)而使之懸浮，獲得包含肺上皮幹細胞之懸浮液。
向上述包含肺上皮幹細胞之懸浮液中添加經螢光物質標記化之抗EpCAM抗體。EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)係作為對上皮細胞具有特異性之細胞間細胞黏著分子為人所知之I型跨膜糖蛋白。使用FACS Aria II(BD公司)，基於源自抗EpCAM抗體之螢光強度特定出肺上皮幹細胞。進而，基於源自GFP之螢光強度，將特定出之肺上皮幹細胞分為三份(P17、P18、P19)(圖1)。
[試驗例1] 藉由對標記基因之表現圖案進行調查，而特定出各份中所包含之細胞種。對於標記基因之表現圖案，藉由qPCR(quantitative polymerase chain reaction，定量聚合酶鏈反應)使各標記基因擴增而進行調查。其結果表明，P17份主要包含棒狀細胞、纖毛細胞、AT1細胞(Type I alveolar epithelial cell)及基底細胞。同樣地，其結果表明P18份包含變異型棒狀(遠端棒狀)細胞，P19份包含AT2細胞及BASCs。
(基本培養基) 於不使用餵養細胞之情況下培養包含圖1中之P19份之肺上皮幹細胞之懸浮液、包含P18份之肺上皮幹細胞之懸浮液、及包含P17份之肺上皮幹細胞之懸浮液，形成類器官。培養時，使用MTEC/B27作為基本培養基。將MTEC/B27之成分示於下文。 [表3]
成分 經銷商 分量(mL)
DMEM/F12 不含酚紅 Lifetechnologies 500
1 M HEPES NACALAI TESQUE 7.5
7.5% NaHCO3 NACALAI TESQUE 2
B27(註冊商標)補充劑(×50) 無血清 GIBCO 10
FBS(最終濃度5%) SIGMA 25
fungizone(最終濃度250 ng/mL) ThermoFisher 500[μL]
青黴素/鏈黴素(最終濃度100 U/mL、100 μg/mL) Nacalai 5
(添加劑) 將上述基本培養基與以下添加劑適當地加以組合而製成培養用培養基。 [表4]
簡寫符號 名稱 經銷商 最終濃度 備註
K KGF/Fgf7 小鼠重組體 R&D 50 ng/mL Fgf7，Fgf配體
C CHIR99021 SIGMA 3 μM GSK-3抑制劑(Wnt活化劑)
N 重組鼠類Noggin PeproTech 100 ng/mL Bmp抑制劑
S TGF-BETA RI激酶抑制劑 VI SB431542 Calbiochem 10 μM ALK4/5抑制劑(Tgf β訊息抑制劑)
H HGF 小鼠重組體 R&D 30 ng/mL Met配體
F10 重組人類FGF-10 PEPROTECH 50 ng/mL Fgf配體
E EGF Corning 25 ng/mL Egf配體
X XAV939 SIGMA 10 μM 端錨聚合酶抑制劑(Wnt/β連環蛋白抑制劑)
Y Y-27632二鹽酸鹽 LC Laborato ries 10 μM Rock抑制劑
(肺上皮幹細胞之類器官形成) 對包含肺上皮幹細胞之懸浮液施加離心分離(400 g，10分鐘，4℃)，使沈澱物懸浮於MTEC/B27中。將規定數量之肺上皮幹細胞與50%或75%之Matrigel(註冊商標)(Matrigel低生長因子基底膜基質(Corning公司))加以混合。將所獲得之混合液20 μL滴加至加溫至37℃之48孔板之各孔中，將上述板於37℃下維持20分鐘，於各孔中形成凝膠。將向上述基本培養基中添加Hgf、Fgf10、KGF、Noggin、及SB431542之組合而得之培養用培養基250 μL應用於所形成之凝膠上，將上述板於37℃、5%CO2 下培養6天。培養用培養基係3天更換一次。
分別以上述方式培養包含P17份～P19份之肺上皮幹細胞之懸浮液，結果於顯微鏡下觀察到直徑50 μm以上之細胞塊。對培養物進行免疫組織染色。免疫組織染色表明於P19份中觀察到之細胞塊係以AT2細胞為主之表現出Sftpc之類器官。又，表明於P18份中觀察到之細胞塊係以變異型棒狀細胞等表現出Sftpc及Scgb1a1之細胞為主之類器官。並且，表明於P17份中觀察到之細胞塊分別形成認為源自棒狀細胞之較強地表現出Scgb1a1之類器官、及認為源自基底細胞之表現出Krt5之類器官。
[試驗例2] 以製備例1所記載之方式，分別自6隻SFTPC-GFP小鼠製備包含肺上皮幹細胞之懸浮液(n＝6)。以下，將圖1所示之基於GFP螢光強度之肺上皮幹細胞之散佈圖中相當於P19份之份稱為GFPhi 份。同樣地，將相當於P18份之份稱為GFPlo 份，該P18份所對應之GFP螢光強度低於P19份所對應之GFP強度，將相當於P17份之份稱為GFPneg 份，該P17份所對應之GFP螢光強度低於P18份所對應之GFP強度。
(GFPhi 份) 以與試驗例1相同之方式培養GFPhi 份之肺上皮幹細胞之懸浮液。但是，試驗例2中與試驗例1不同，向培養用培養基中添加以下添加劑之組合，將一份包含肺上皮幹細胞之懸浮液以每孔中有5,000細胞之方式於4孔中進行培養。 [表5]
   名稱 KCNS HCNS F10CNS KNS KCS KCN KF10HCNS ECNS
K KGF + - - + + + + -
C CHIR99021 + + + - + + + +
N Noggin + + + + - + + +
S SB431542 + + + + + - + +
H HGF - + - - - - + -
F10 FGF10 - - + - - - + -
E EGF - - - - - - - +
+：用作添加劑 -：未用作添加劑
培養6天後，使用顯微鏡拍攝培養物，並使用軟體對直徑50 μm以上之細胞塊進行計數。使用各孔中之細胞塊之數量除以所添加之細胞數所得之比率即CFE[%]作為類器官形成效率之指標。CFE(n＝6)之平均值及其標凖偏差係根據6隻小鼠中獲得之CFE算出(圖2)。又，長徑[μm](n＝6)之平均值及其標凖偏差係根據6隻小鼠中獲得之類器官之長徑算出(圖3)。
・4種添加劑之組合 圖2及圖3分別表明4種添加劑之組合「KCNS」之CFE為約0.18%，且長徑為約136 μm。使用將KCNS中之添加劑K置換成H後之添加劑之組合「HCNS」之情形時之CFE及長徑分別與使用KCNS之情形時之CFE及長徑同等。該結果表明：於4種添加劑之組合KCNS中，在有效率之類器官形成方面，添加劑「K」與「H」可相互替代。
將「KCNS」中之添加劑K置換成F10後之添加劑之組合「F10CNS」之CFE及長徑分別與「KCNS」之CFE及長徑同等。該結果表明：於4種添加劑之組合「KCNS」中，在有效率之類器官形成方面，添加劑「K」與「F10」可相互替代。將「KCNS」中之添加劑「K」置換成「E」後之添加劑之組合「ECNS」之CFE相較於「KCNS」之CFE顯著變小(塔基檢定，*：P＜0.05)。
・3種添加劑之組合 針對4種添加劑之組合「KCNS」中除了可替代為添加劑「H」或「F10」之添加劑「K」以外之3種添加劑對於有效率之類器官形成(較高之CFE)及長徑之重要性進行研究。自「KCNS」將添加劑「N」去除後之添加劑之組合「KCS」之CFE及長徑分別相較於「KCNS」之CFE及長徑顯著變小(塔基檢定，*：P＜0.05)。自「KCNS」將添加劑「S」去除後之添加劑之組合「KCN」之CFE雖然相較於「KCNS」之CFE無有意義差，但有降低之傾向。該等結果表明：於4種添加劑之組合「KCNS」中，添加劑「N」及「S」對於有效率之類器官形成較為重要。
自「KCNS」將添加劑「C」去除後之添加劑之組合「KNS」之CFE與「KCNS」之CFE及長徑無有意義差。該結果表明：於4種添加劑之組合「KCNS」中，添加劑「C」對於有效率之類器官形成並不重要。但是，如試驗例3中所述，揭示了添加劑「C」會引起構成細胞塊之肺上皮幹細胞之分化轉化。
・6種添加劑之組合 圖2及圖3分別表明6種添加劑之組合「KF10HCNS」之CFE為約0.87%，且長徑為約113 μm。「KF10HCNS」之CFE相較於4種添加劑之組合「KCNS」及「F10CNS」顯著變大(塔基檢定，*：P＜0.05)。使用「KF10HCNS」之情形時之長徑與4種添加劑之組合中表現出最大長徑之「KCNS」同等。該結果表明：6種添加劑之組合「KF10HCNS」對於有效率之類器官形成較佳。
・5種添加劑之組合 如上所述，已表明6種添加劑之組合「KF10HCNS」中之添加劑「C」對於有效率之類器官形成並不重要。因此，揭示了將「KF10HCNS」中之添加劑「C」去除後之5種添加劑之組合「HF10KNS」對於有效率之類器官形成較佳。
(GFPlo 份) 與上述GFPhi 份之肺上皮幹細胞之懸浮液同樣地，亦以與試驗例1相同之方式培養GFPlo 份之肺上皮幹細胞之懸浮液，算出CFE[%]。但是，與GFPhi 份不同，以每孔中有150細胞之方式進行培養。算出CFE(n＝6)之平均值及標凖偏差(圖4)。進而算出類器官之長徑(n＝6)之平均值及標凖偏差(圖5)。
・4種添加劑之組合 圖4及圖5分別表明4種添加劑之組合「KCNS」之CFE為約8.0%，且長徑為約127 μm。將「KCNS」中之添加劑「K」置換成「H」或「F10」後之添加劑之組合「HCNS」或「F10CNS」之CFE及長徑與「KCNS」之CFE無有意義差。該結果表明：於4種添加劑之組合「KCNS」中，在有效率之類器官形成方面，添加劑「K」與「H」或「F10」可相互替代。將「KCNS」中之添加劑「K」置換成「E」後之添加劑之組合「ECNS」之CFE相較於「KCNS」之CFE顯著變小(塔基檢定，*：P＜0.05)。
・3種添加劑之組合 如對GFPhi 份所進行之操作般，對於GFPlo 份，亦對自4種添加劑之組合「KCNS」將添加劑「C」、「N」、或「H」去除後之3種添加劑之組合「KNS」、「KCS」、或「KCN」之CFE及長徑進行調查。「KCS」相較於「KCNS」之CFE及長徑顯著變小(塔基檢定，*：P＜0.05)。「KNS」之CFE雖然與「KCNS」之CFE及長徑無有意義差，但顯示出降低之傾向。自「KCNS」將添加劑「C」去除後之添加劑之組合「KNS」之CFE及長徑與「KCNS」之CFE無有意義差。該等結果與針對GFPhi 份之結果相同。
・6種添加劑之組合、及5種添加劑之組合 圖4及圖5表明6種添加劑之組合「KF10HCNS」雖然在有效率之類器官形成方面，與4種添加劑之組合「KCNS」無有意義差，但有變大之傾向。「KF10HCNS」在有效率之類器官形成方面，與4種添加劑之組合「HCNS」及「F10CNS」無有意義差。如上所述，6種添加劑之組合「KF10HCNS」中之添加劑「C」對於有效率之類器官形成並不重要，因此揭示了5種添加劑之組合「HF10KNS」於GFPlo 份中亦為對於有效率之類器官形成較佳之添加劑之組合。
(GFPneg 份) 與上述GFPhi 份之肺上皮幹細胞之懸浮液同樣地，亦針對GFPneg 份之肺上皮幹細胞之懸浮液算出CFE[%]。3種添加劑之組合「KNS」之CFE為0.75%。
試驗例2揭示：在有效率之類器官形成方面，較佳為包含選自由添加劑KGF(K)、HGF(H)及FGF10(F10)所組成之群中之至少1種、Noggin(N)等BMP抑制劑、及SB431542(S)等TGFβ抑制劑之組合，關於更有效率之類器官形成，更佳為包含CHIR99021(C)、「N」、「S」、及「H」之組合，進而較佳為包含「K」、「N」、「S」、「H」、及「F10」之組合或包含「K」、「C」、「N」、「S」、「H」、及「F10」之組合。關於AT2之類器官之有效率之形成，如試驗例3所示，較佳為包含「C」。
[試驗例3] 試驗例2表明即便添加CHIR99021(Wnt訊息活化劑)，類器官之形成效率亦無變化。試驗例3針對CHIR99021(C)對肺上皮幹細胞之分化轉化產生之影響進行了研究。使用作為典型之Wnt抑制劑之XAV939(X)。以與試驗例2相同之方式培養包含GFPhi 份及GFPlo 份之肺上皮幹細胞之懸浮液，形成類器官。將4種添加劑之組合「KCNS」或「KXNS」添加至基本培養基MTEC/B27中而製成培養用培養基。進行培養後，製作所形成之類器官之石蠟切片。對於上述石蠟切片中之類器官，使用針對Sftpc之抗體及針對作為支氣管上皮細胞標記物之Sox2之抗體，進行組織免疫染色。
關於GFPhi 份，確認到於包含作為Wnt訊息活化劑之CHIR99021(C)之添加劑之組合KCNS中，類器官中之Sox2之表現於一部分類器官中表現得較弱。確認到於包含作為Wnt/β連環蛋白抑制劑之10 μM之XAV939(X)之添加劑之組合「KXNS」中，Sox2之表現於一部分類器官中較強。於添加劑之組合「KCNS」中，Sftpc之表現有相較於添加劑之組合「KXNS」變強之傾向。如試驗例1所示，GFPhi 份中主要包含AT2，一部分中包含BASCs。因此，根據該等結果推測：於GFPhi 份之懸浮液中局部存在之BASCs於Wnt訊息活化劑之存在下分化轉化成AT2，結果形成AT2之類器官，並且，於Wnt抑制劑之存在下，形成包含局部存在之BASCs之類器官與主要存在之AT2之類器官在內之至少2種類器官。
關於GFPlo 份，類器官中之Sox2之表現於包含Wnt訊息活化劑之添加劑之組合「KCNS」中較弱，相對於此，Sox2之表現於包含Wnt抑制劑之添加劑之組合「KXNS」中較強。Sftpc之表現於「KCNS」中有相較於「KXNS」變強之傾向。GFPlo 份中之結果顯示出與GFPhi 份中之結果相同之傾向。
試驗例3揭示：若於Wnt訊息活化劑(例如CHIR99021)之存在下形成肺上皮幹細胞之類器官，則可自除AT2細胞以外之細胞種誘導AT2之類器官形成。
[實施例1]自肺上皮幹細胞形成類器官 將GFPhi 份之肺上皮幹細胞以每孔中有2,500細胞之方式接種於96孔之超低吸附板(細胞排斥性96孔板)中。向於冰上冷卻之基本培養基MTEC/B27中添加7種添加劑即Y-27632(Y)、HGF(H)、Fgf10(F10)、KGF(K)、CHIR99021(C)、CHIR99021(N)、及SB431542(S)之組合而獲得培養用培養基，向該培養用培養基中添加2.5%之Matrigel而獲得最終之培養用培養基，使用該最終之培養用培養基，與試驗例2同樣地培養6天，算出CFE(圖6)。與上述同樣地，將GFPlo 份之肺上皮幹細胞以每孔中有200細胞之方式進行接種，培養6天後，算出CFE(圖6)。
圖6表明：藉由在包含2.5%之低濃度之Matrigel之培養用培養基中培養肺上皮幹細胞而形成肺上皮幹細胞之類器官，且該類器官之形成效率於GFPhi 份中為約1.4%，於GFPlo 份中為約6.4%。該結果表明：於包含50%或75%Matrigel之凝膠之培養用培養基中之肺上皮幹細胞之類器官的形成效率與GFPhi 份中之0.86%及GFPlo 份中之12%為同等程度。
實施例1表明：若存在本發明之添加劑，則無論是於包含作為支架之細胞外基質之凝膠(例如50%或75%Matrigel)之培養用培養基中進行培養，抑或是於包含細胞外基質(例如2.5%Matrigel)作為分散成分之培養用培養基中進行培養，均可形成肺上皮幹細胞之類器官。
[試驗例4] 對所形成之類器官是否具有分化能力進行調查。與試驗例2同樣地，將GFPhi 份之肺上皮幹細胞於向基本培養基MTEC/B27中添加4種添加劑之組合「KCNS」而得之培養用培養基中培養8天。將2份培養物中之1份進而於上述培養用培養基中培養4天。將另一份進而於基本培養基中培養4天。顯示於培養第12天，藉由在基本培養基中進行培養而形成之類器官中，較強地表現出作為肺泡之分化細胞之AT1細胞之細胞標記物的Hopx。試驗例4表明：於本發明之添加劑之存在下形成之類器官具有分化能力。
[製備例2] (包含肺腺癌細胞之懸浮液之製備) 準備使小鼠B6.129S-Sftpctm1(cre/ERT2)Blh/J(以下稱為「Sftpc-CreERT2」)(Jackson Lab, StockNo. 028054)、小鼠B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato, -EGFP)Luo/J(以下稱為「Rosa26-mTmG」)(Jackson Lab, StockNo. 007676)、及小鼠B6N.Cg-Krastm4Tyj/CjDswJ(以下稱為KrasLSLG12D)(Jackson Lab, StockNo. 019104)這3種小鼠雜交而獲得之Sftpc-CreERT2; KRASLSLG12D; Rosa26-mTmG小鼠。於Sftpc-CreERT2; KRASLSLG12D; Rosa26-mTmG小鼠中，Kras活化之細胞之細胞膜發出源自EGFP之綠色螢光。
於Sftpc-CreERT2中，在未投予泰莫西芬之情況下，Cre基因重組酶活化，約5-10%之細胞發生重組(Barkauskas CE. et al., J Clin Invest. 2013; 123 (7): 3025 - 36.)。於Sftpc-CreERT2; KRASLSLG12D; Rosa26-mTmG小鼠之肺中，確認到多個小結節(nodule)，揭示了癌化之細胞存在於上述小鼠之肺中。
以與製備例1相同之方式，自Sftpc-CreERT2; KRASLSLG12D; Rosa26-mTmG小鼠製備包含肺上皮細胞之懸浮液。與製備例1同樣地，基於源自經螢光物質標記化之抗EpCAM抗體之螢光、及源自GFP之螢光，自所製備之包含肺上皮細胞之懸浮液獲得包含Kras活化之肺腺癌細胞之懸浮液。
[實施例2]自肺腺癌細胞形成類器官 將藉由上述方式所獲得之肺腺癌細胞以每孔中有2,500細胞之方式接種於96孔之超低吸附板(細胞排斥性96孔板)中。向於冰上冷卻之基本培養基MTEC/B27中添加7種添加劑即Y-27632(Y)、HGF(H)、Fgf10(F10)、KGF(K)、CHIR99021(C)、CHIR99021(N)、及SB431542(S)之組合而獲得培養用培養基，向該培養用培養基中添加2.5%之Matrigel而獲得最終之培養用培養基，使用該最終之培養用培養基，與試驗例2同樣地培養6天，算出CFE(圖7)。與上述同樣地，將藉由上述方式所獲得之肺腺癌細胞於包含基本培養基MTEC/B27及2.5%之Matrigel之培養用培養基中培養6天後，算出CFE(圖7)。
如圖7所示，藉由在上述添加劑之存在下(圖7中為「+」)培養肺腺癌細胞而形成類器官，其CFE為約1.7%。於不存在上述添加劑之情形時(圖7中為「-」)，未觀察到肺腺癌細胞之類器官形成。
實施例2表明：若存在本發明之添加劑，則即便於不使用支架之培養用培養基中進行培養，亦可形成肺腺癌細胞之類器官。
[製備例3] 以與製備例1相同之方式，自SFTPC-GFP小鼠之肺獲得包含肺上皮幹細胞之懸浮液，使用FACS Aria II(BD公司)，基於源自GFP之螢光強度，將特定出之肺上皮幹細胞分成三份(GFPhi 、GFPlo 、及GFPneg )(圖8)。GFPhi 份相當於試驗例2之P19份。GFPlo 份相當於試驗例2之P18份。GFPneg 份相當於試驗例2之P17份。
[試驗例5] 以與試驗例1相同之方式，藉由qPCR使各標記基因擴增而對標記基因之表現圖案進行調查，自其表現圖案推定各份中所包含之細胞種(圖9)。其結果表明：GFPneg 份主要包含作為Krt5陽性細胞之基底細胞、及Scgb1a1及Scgb3a2為陽性之棒狀細胞。GFPneg 份與試驗例1之P17份同樣地，亦包含纖毛細胞及AT1細胞。且表明GFPlo 份主要包含Scgb1a1及Scgb3a2為陽性之棒狀細胞。又，表明GFPhi 份主要包含Sftpc及Abca3為陽性之AT2細胞，揭示包含一部分BASC。
[試驗例6] 於向基本培養基MTEC/B27中以成為表2所記載之最終濃度之方式添加HGF(H)、FGF10(F10)、KGF(K)、NOGGIN(N)、SB431542(S)及CHIR99021(C)而得之增殖培養基(包含50%Matrigel)中，不使用餵養細胞而分別培養GFPhi 份、GFPlo 份、及GFPneg 份之細胞。向基本培養基中添加之CHIR99021(C)雖然對於類器官形成並非必需，但有可能參與棒狀細胞向AT2細胞之分化，故進行添加。於培養第9天，將上述增殖培養基更換為基本培養基MTEC/B27，進而培養3天，促進分化而形成類器官。
藉由使用以下試劑之免疫染色，調查促進分化前後所形成之類器官中之標記物蛋白之表現。 [表6]
名稱 型號 經銷商 備註
CC10(B6) sc-390313 Santa cruz 主體：小鼠 1：500-1000
前表面活性蛋白C(proSP-C) AB3786 Millipore 主體：兔 1：300
人/小鼠/大鼠SOX2抗體 14-9965-82 R&D 主體：山羊 1：200
Cytokeratin5抗體(EP1601Y)(兔) ab52635 Abcam 主體：兔 1：500
於小鼠中製造之單株抗乙醯化微管蛋白抗體 T7541 Sigma 主體：小鼠 1：1000
抗m/rRAGE純化大鼠單株IgG殖株175410 MAB1179 R&D 主體：大鼠1：200
於兔中製造之抗HOPX抗體 HPA030180 Sigma 主體：兔1：200
抗HT2-280 TB-27AHT2-280 TERRACE BIOTECH 主體：小鼠 1：50
來自豬胰腺之胰蛋白酶 細胞生物學用 T4799-5G Sigma   
抗原未遮蔽溶液 H-3300 Vector   
抗原未遮蔽溶液(高pH值) H-3301 Vector   
M.O.M.(mouse on mouse，小鼠抗小鼠)免疫檢測套組 BMK-2202 Vector   
藉由培養GFPneg 份之細胞，形成至少2種類器官(圖10)。一種類器官於分化前(d9)由包含Krt5陽性(基底細胞標記物)之基底細胞及SCGB1A1陽性(棒狀細胞標記物)之棒狀細胞之細胞集群構成。構成於試驗例6之分化條件下所形成之上述類器官之細胞未分化成纖毛細胞。另一種類器官於分化前(d9)由包含SCGB1A1陽性(棒狀細胞標記物)之棒狀細胞之細胞集群構成，於分化後(d12)由包含變成ACTUB陽性(纖毛細胞標記物)之棒狀細胞之細胞集群構成。
藉由培養GFPlo 份之細胞，形成至少2種類器官(圖11)。一種類器官於分化前(d9)由包含SCGB1A1陽性(棒狀細胞標記物)之棒狀細胞、SOX2陽性(支氣管上皮標記物)之細胞及SFTPC陽性(AT2細胞標記物)之細胞之細胞集群構成，於分化後(d12)由包含變成AGER陽性(AT1細胞標記物)之肺泡系統(譜系)之細胞之細胞集群構成。另一種類器官於分化前(d9)由SOX2陽性(支氣管上皮標記物)且SFTPC陽性(AT2細胞標記物)之細胞集群構成，於分化後(d12)由包含變成AGER陽性(AT1細胞標記物)之肺泡系統之細胞之細胞集群構成。
藉由培養GFPhi 份之細胞，形成至少1種類器官(圖12)。上述類器官於分化前(d9)由包含SFTPC陽性(AT2細胞標記物)之細胞之細胞集群構成，於分化後(d12)由包含AGER陽性(AT1細胞標記物)之AT2細胞之細胞集群構成。
[試驗例7] 使用來自SFTPC-GFP小鼠之GFPhi 份、GFPlo 份及GFPneg 份之細胞作為對象細胞，研究對有效率之類器官形成有用之添加劑之組合。使用50%或75%之Matrigel(註冊商標)，以與試驗例2相同之方式，形成包含上述細胞之凝膠，進行培養。類器官之形成效率係基於CFE[%]及類器官之長徑之值進行評估。於試驗例7中，使用6隻SFTPC-GFP小鼠，使用以合計計分別為120,000細胞、3,600細胞及24,000細胞之GFPhi 份、GFPlo 份及GFPneg 份之細胞(n＝6)。
(GFPhi 份) 以與試驗例2相同之方式，將GFPhi 份之肺上皮幹細胞於添加有以下添加劑之組合之培養用培養基中進行培養而形成類器官。於上述培養中，以每孔中有5,000細胞之方式進行接種而進行培養。藉由與試驗例2相同之方法測定CFE[%]及長徑[μm](圖13)。 [表7]
   名稱 KCNS KNS KCS KCN CNS ECNS F10CNS HCNS KF10HCNS
K KGF + + + + - - - - +
C CHIR99021 + - + + + + + + +
N Noggin + + - + + + + + +
S SB431542 + + + - + + + + +
H HGF - - - - - - - + +
F10 FGF10 - - - - - - + - +
E EGF - - - - - + - - -
+：用作添加劑 -：未用作添加劑
「KCNS」、「KNS」、「F10CNS」、「HCNS」或「KF10HCNS」之CFE相較於3種添加劑之組合「CNS」之CFE，顯示出更大之值(圖13A)。無論使用何種添加劑之組合，類器官之長徑均未觀察到有意義差(圖13B)。
・6種添加劑之組合 於使用6種添加劑之組合「KF10HCNS」之情形時，與試驗例2之結果相同，獲得最大之CFE(圖13A)。例如，使用「KF10HCNS」之情形時之CFE相較於使用3種添加劑之組合「CNS」、對上述3種添加劑之組合進而組合1種受體酪胺酸激酶活化因子而得之4種添加劑之組合「KCNS」、「ECNS」或「F10CNS」之情形時之CFE，顯著變大。
・4種添加劑之組合 4種添加劑之組合「HCNS」之CFE相較於「CNS」或「ECNS」之CFE，顯著變大(圖13A)。4種添加劑之組合「KCNS」、「F10CNS」及「HCNS」分別獲得同等之CFE(圖13A)。該結果表明：與試驗例2之結果相同，在有效率之類器官形成方面，添加劑「K」、「F10」及「H」可相互替代。
・3種添加劑之組合 自4種添加劑之組合「KCNS」將添加劑「N」去除後之3種添加劑之組合「KCS」或將添加劑S去除後之3種添加劑之組合「KCN」之CFE分別相較於「KCNS」之CFE有降低之傾向。(圖13A)該結果表明：與試驗例2之結果相同，於4種添加劑「KCNS」中，添加劑「N」及「S」對於有效率之類器官形成較為重要。
自KCNS將添加劑C去除後之添加劑之組合「KNS」之CFE與「KCNS」之CFE無有意義差(圖13A)。該結果表明：與試驗例2之結果相同，添加劑「C」對於有效率之類器官形成並不重要。但是，如試驗例3所示，揭示了添加劑「C」會引起構成細胞塊之肺上皮幹細胞之分化轉化。
(GFPlo 份) 關於GFPlo 份之肺上皮幹細胞，亦以與上述GFPhi 份之肺上皮幹細胞相同之方式算出CFE[%]。但是，與GFPhi 份不同，以每孔中有150細胞之方式進行培養。算出CFE(n＝6)之平均值及標凖偏差(圖14A)。進而，算出類器官之長徑(n＝6)之平均值及標凖偏差(圖14B)。 相較於3種添加劑之組合「CNS」之CFE，「KCNS」、「KNS」、「F10CNS」、「HCNS」、或「KF10HCNS」之CFE顯示出更大之值(圖14A)。
・6種添加劑之組合 於使用6種添加劑之組合「KF10HCNS」之情形時，與試驗例2之結果相同，獲得最大之CFE及長徑(圖14A及B)。例如，「KF10HCNS」之CFE相較於3種添加劑之組合「CNS」之CFE、或對上述3種添加劑之組合進而組合EGF(E)而得之4種添加劑之組合「ECNS」之CFE，顯著變大(圖14A)。「KF10HCNS」中之長徑相較於「ECNS」中之長徑，顯著變大(圖14B)。
・4種添加劑之組合 4種添加劑之組合「F10CNS」或「HCNS」之CFE相較於3種添加劑之組合「CNS」之CFE，顯著變大(圖14A)。4種添加劑之組合「KCNS」、「F10CNS」及「HCNS」分別顯示出同等之CFE(圖14A)。該結果表明：與試驗例2之結果相同，在有效率之類器官形成方面，添加劑「K」、「F10」及「H」可相互替代。於使用添加劑「E」代替「KCNS」中之添加劑「K」而得之4種添加劑之組合「ECNS」相較於KCNS，顯示出顯著降低之CFE及長徑(圖14A及B)。該等結果表明：在有效率之類器官形成方面，添加劑「E」無法與添加劑「K」、「F10」或「H」相互替代。
・3種添加劑之組合 自4種添加劑之組合「KCNS」將添加劑「N」或「K」去除後之3種添加劑之組合「KCS」或「CNS」之CFE分別相較於「KCNS」之CFE，顯著降低(圖14A)。使用「KCNS」之情形時之長徑相較於使用「KCS」之情形時之長徑，顯著降低(圖14B)。又，自「KCNS」將添加劑S去除後之3種添加劑之組合「KCN」之CFE相較於「KCNS」之CFE，有降低之傾向(圖14A)。該等結果表明：與試驗例2之結果相同，於4種添加劑「KCNS」中，添加劑「N」及「S」對於有效率之類器官形成較為重要。
自「KCNS」將添加劑「C」去除後之添加劑之組合「KNS」之CFE與「KCNS」之CFE無有意義差(圖14A)。該結果表明：與試驗例2之結果相同，添加劑「C」對於有效率之類器官形成並不重要。
(GFPneg 份) 關於GFPneg 份之肺上皮幹細胞，亦以與上述GFPhi 份之肺上皮幹細胞相同之方式算出CFE[%]。但是，與GFPhi 份不同，以每孔中有1,000細胞之方式進行培養。算出CFE(n＝6)之平均值及標凖偏差(圖15A)。進而，算出類器官之長徑(n＝6)之平均值及標凖偏差(圖15B)。 相較於3種添加劑之組合「CNS」之CFE，「KCNS」、「KNS」、「F10CNS」、「HCNS」、或「KF10HCNS」之CFE顯示出更大之值(圖15A)。該等添加劑之組合包含「N」及「C」，進而包含選自由「K」、「H」及「F10」所組成之群中之至少1種。
・6種添加劑之組合 於使用6種添加劑之組合「KF10HCNS」之情形時，獲得最大之CFE及長徑(圖15A及B)。例如「KF10HCNS」之CFE相較於不含受體酪胺酸激酶活化因子之3種添加劑之組合「CNS」之CFE，顯著變大(圖15A)。
使用於3種添加劑之組合CNS中進而組合1種受體酪胺酸激酶活化因子所得之4種添加劑之組合「KCNS」、「ECNS」、「F10CNS」或「HCNS」之情形時之長徑相較於使用上述3種添加劑之組合CNS之情形時之長徑，顯著變大(圖15B)。該結果表明：在類器官形成方面，重要的是於3種添加劑之組合「CNS」中組合4種受體酪胺酸激酶活化因子「K」、「E」、「F10」及「H」之任一種。
在類器官形成方面，與GFPhi /lo 份之細胞不同，若為GFPneg 份之細胞，則即便於使用ECNS之情形時，亦相較於使用CNS之情形存在有意義差(圖13A、圖14A及圖15B)。該結果與不使用餵養細胞而培養基底細胞時使用EGF之結果一致(Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Aug 4; 106 (31): 12771 - 5)。
試驗例7揭示：在有效率之類器官形成方面，較佳為包含選自由添加劑KGF(K)、HGF(H)及FGF10(F10)所組成之群中之至少1種、Noggin(N)等BMP抑制劑、及SB431542(S)等TGFβ抑制劑的組合，在更有效率之類器官形成方面，更佳為包含CHIR99021(C)、「N」、「S」、及「H」之組合，進而較佳為包含「K」、「N」、「S」、「H」、及「F10」之組合或包含「K」、「C」、「N」、「S」、「H」、及「F10」之組合。
[實施例3]向肺損傷小鼠移植源自棒狀細胞之類器官 準備基因重組小鼠rShh-Cre; Rosa26-CAG-LSL-H2B-mCherry; SFTPC-GFP小鼠(圖16A，供體小鼠)。上述基因重組小鼠係使小鼠B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J(於本說明書中簡稱為「Shh-Cre」)(Jackson Lab. Stock No. 005602)、小鼠B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1Ksvo/J(於本說明書中簡稱為「ROSA26-mCherry」)(Jackson Lab. Stock No. 023139)、及SFTPC-GFP小鼠這3種小鼠雜交而獲得。
藉由與製備例1相同之方法，自上述基因重組小鼠取得GFPlo 之細胞集群(棒狀細胞)。所取得之細胞之核被mCherry染色。於上述細胞變成AT2細胞之情形時，較強地表現出GFP。
依照以下方法，由自上述基因重組小鼠取得之上述細胞形成類器官，並對肺損傷小鼠投予上述來自類器官之細胞(圖16B)。將於培養基(MTEC/B27＋YHF10KCNS＋2.5%Matrigel 2 mL)中包含自上述基因重組小鼠取得之上述細胞的細胞懸浮液以每孔有1×104 細胞之方式接種於6孔板中。每3天向上述孔中添加一次不含Matrigel之上述培養基1 mL，共計培養9天。於培養第9天，對包含類器官之培養液施加離心分離(400 G，3分鐘，4℃)，將類器官回收。對所回收之類器官添加預先加溫至37℃之蛋白酶溶液10 mL(Accutase，I型膠原蛋白酶(450 U/mL，Worthington)，DNase(0.1 mg/mL，SIGMA))，於37℃下使用旋轉器平穩地攪拌20分鐘。對上述溶液進行移液而獲得細胞懸浮液，對其施加離心分離(400 G，5分鐘，4℃)，將細胞塊回收。對所回收之細胞塊添加0.25%胰蛋白酶5 mL(Gibco，包含0.1 mg/mL之DNase)，於37℃下使用旋轉器平穩地攪拌10分鐘。對上述溶液進行移液而獲得細胞懸浮液，為了使蛋白酶停止反應，向上述細胞懸浮液中添加DMEM/F12 10 mL(含10%FBS)。對上述細胞懸浮液施加離心分離(400 G，5分鐘，4℃)，使所回收之細胞以每75 μL培養基中活細胞有4×105 之方式懸浮於90 μL之培養基(MTEC/B27＋「YHF10KNS」)中。
肺損傷小鼠係藉由如下方式製備：於投予來自類器官之上述細胞之9天前，利用異氟醚(輝瑞)將裸小鼠麻醉，經鼻投予3 mg/Kg容量之博萊黴素溶液(日本化藥)。
於投予來自類器官之上述細胞之日，利用異氟醚(輝瑞)將上述肺損傷小鼠麻醉，自氣管對上述小鼠投予藉由上述方式所製備之細胞懸浮液。於細胞投予2週後，對上述肺損傷小鼠進行解剖，製作肺之冷凍切片。利用螢光顯微鏡拍攝上述冷凍切片中之源自mCherry及GFP之螢光，對所投予之上述細胞對肺組織之黏著及生存進行調查(圖16C及D)。
於肺切片中觀察到自核發出源自mCherry之螢光之細胞(圖16C)。該結果表明：由自作為供體之基因重組小鼠取得之棒狀細胞形成類器官後所獲得之棒狀細胞黏著於作為受體之肺損傷小鼠之肺組織並生存。自核發出源自mCherry之螢光之細胞中之若干細胞發出源自GFP之螢光(圖16D)。該結果表明：自棒狀細胞分化成AT2細胞之細胞黏著於肺損傷小鼠之肺組織並生存。
[實施例4]自人類初代細胞形成類器官 購入以下之人肺泡細胞(人肺泡上皮細胞：HPAEpiC)及人呼吸道細胞(人小氣道上皮細胞：HPSAEpiC)。 [表8]
名稱 型號 經銷商 批次
人小氣道上皮細胞(HPSAEpiC) 3230 ScienCell 28775
人肺泡上皮細胞(HPAEpiC) 3200 ScienCell 28699
將購入之冷凍人類初代細胞於37℃下融解，並使融解液100 μl懸浮於培養用培養基(MTEC/B27＋「YHF10KCNS」＋5%Matrigel)2 mL中，將細胞懸浮液接種於6孔撥水板(repellent plate)中。HPAEpiC係以每孔中有1.44×105 細胞之方式進行接種。HPSAEpiC係以每孔中有5.6×104 細胞之方式進行接種。於培養第3天添加上述培養用培養基1 ml。於培養第6天，以每孔中有2×105 細胞之方式對培養細胞進行繼代操作。之後，每12天對培養細胞進行繼代操作。
於人類初代細胞之培養第6天繼代之細胞之培養第12天，對培養細胞進行觀察(圖17)。於培養有人肺泡細胞及人呼吸道細胞之孔中分別觀察到類器官(圖17A及B)。藉由使用試驗例6之表4所示之試劑之免疫染色對所形成之類器官中之標記物蛋白之表現進行調查(圖18)。免疫染色係使用類器官之石蠟切片進行。其結果表明：由人肺泡細胞形成了3種類型之類器官(圖18A～C)，且由人呼吸道細胞形成了一種類型之類器官(圖18D)。
圖18A表明：由人肺泡細胞所形成之類器官係表現出人類特異性AT2細胞標記物(HT2-280)及與小鼠共通之AT2細胞標記物(SFTPC)之肺泡型。圖18B表明：由人肺泡細胞所形成之類器官係表現出上述2種標記物蛋白HT2-280及SFTPC，且表現出作為支氣管上皮標記物之SOX2之支氣管肺泡型。圖18C表明：由人肺泡細胞所形成之類器官係僅表現出作為支氣管上皮標記物之SOX2之支氣管型。實施例4中，由人肺泡細胞形成了3種類型之類器官。認為該結果之原因之一在於購入之人肺泡細胞中混入有末梢呼吸道之細胞。
圖18D表明：由人呼吸道細胞所形成之類器官係由表現出基底細胞標記物(KRT5)及支氣管上皮標記物(SOX2)之基底細胞形成。
實施例4表明：藉由在包含本說明書所揭示之添加劑之組合之培養用培養基中培養人肺初代細胞，可形成類器官。
[實施例5]以細胞集群進行培養時之類器官形成之成像 自基因重組小鼠Scgb1a1-CreER; Rosa26-mTmG製備肺上皮細胞。若對上述基因重組小鼠投予他莫昔芬，則Scgb1a1藉由Cre重組酶組入至Rosa26基因座。結果為，Scgb1a1之表現可藉由源自細胞膜存在型GFP(mGFP)之螢光檢測出。
對上述基因重組小鼠投予5次他莫昔芬。投予他莫昔芬3週後，將氣管經切除之肺摘除。以與製備例1相同之方式，自摘除之肺製備細胞懸浮液。向上述細胞懸浮液中添加下述抗體：抗EPCAM-PE-Cy7(#25-5791-80，eBioscience)、抗CD24-APC(#25-0242-80，Invitrogen)、抗CD45-biotin(#13-0451，eBioscience)、抗CD31-biotin(#13-0311，eBioscience)，於冰上反應20分鐘。使上述反應液懸浮於500 μL之DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，杜氏磷酸鹽緩衝液)(-)/3%FBS之後，施加離心分離(400 g，3分鐘，4℃)，再次使沈澱細胞懸浮於100 μL之DPBS(-)/3%FBS中。向細胞懸浮液中添加每1×106 細胞為0.25 μL之鏈黴親和素APC-Cy7，於冰上反應10分鐘。使上述細胞懸浮於500 μL之DPBS(-)/3%FBS之後，施加離心分離(400 g，3分鐘，4℃)，再次使沈澱細胞懸浮於500 μL之DPBS(-)/3%FBS中。向細胞懸浮液中添加每1×106 細胞為5 μL之7-胺基-放線菌素D(7-AAD)，於冰上反應20分鐘。使用40 μm之細胞濾網自上述反應液將細胞塊去除之後，供於FACS。
藉由進行FACS，自所製備之上述細胞懸浮液將經7-AAD染色之死細胞去除，將經抗CD31染色之內皮細胞去除，進而將經抗CD45抗體染色之血球系細胞去除。自殘留之細胞集群收集經抗EPCAM抗體染色之上皮細胞，收集發出源自GFP之螢光之Scgb1a1陽性細胞(主要為棒狀細胞)，進而收集經抗CD24抗體染色之組織幹細胞/祖細胞(CD24lo )。對所獲得之細胞施加離心分離(400 g，5分鐘，4℃)，使沈澱細胞懸浮於培養用培養基(MTEC/B27＋5%FBS＋「YHF10KNS」)中之後，添加培養用培養基(MTEC/B27＋5%FBS＋「YHF10KNS」＋2.5%Matrigel)而製備每250 μL中包含300細胞之細胞懸浮液。將上述細胞懸浮液接種於超低吸附96孔板(CELLSTAR，#655970，Greiner)，將上述96孔板設置於作為培養器一體型顯微鏡之Celldiscoverer7(Zeiss)中。一面將上述細胞培養10天，一面以規定之間隔於明視野下拍攝培養細胞。於初日(第0天)每4小時拍攝一次，於第1～10天以每天1次之間隔進行拍攝。物鏡之倍率係使用10倍。以Z寬度45 μm拍攝17張照片。因此，所拍攝之圖像檔案在各時點於Z軸方向上包含17張圖像資料。
(圖像分析方法) 使用圖像分析軟體ZEN3.0(blue edition)將所拍攝之圖像檔案轉換成Tiff檔案，繼而，使用圖像分析軟體ImageJ(ver.1.52n)進行分析。通過第0天至第10天之圖像檔案追蹤由單細胞形成類器官之過程。於細胞塊之長徑變成50 μm以上之情形時，判斷形成了類器官。於類器官形成之追蹤中，將失焦之細胞、位於平鋪邊緣而看不到整體圖像之細胞、與其他細胞接觸之細胞、及出於某種原因在培養第6天之前無法追蹤之細胞(例如與生長之類器官重疊之細胞)排除在分析之外。於第0天之圖像資料中，將包含觀察到由單細胞形成類器官之過程之細胞之區域裁切而製成圖像檔案。使用作為ImageJ之外掛程式之StackReg(http://bigwww.epfl.ch/ thevenaz/stackreg/)，將所裁切之圖像檔案之Z軸方向之圖像資料進行整合。對整合後之圖像資料中之三維構築之細胞之形態進行測量。形態測量係針對面積(Area)、周圍長度(Perimeter)、長徑(Major axis)、短徑(Minor axis)、真球值(Circularity)、灰值(Gray value)及重心(Centroid)之項目而進行。
(結果) 培養自3隻小鼠獲得之細胞懸浮液中之1,056細胞之細胞集群，對關於該細胞集群內之各個細胞之類器官形成之過程進行觀察。1,056細胞中之235細胞形成類器官，821細胞未形成類器官。對形成類器官之細胞、及未形成類器官之細胞各者之形態進行測量(圖19)。圖19A表明：形成類器官之細胞相較於未形成類器官之細胞，面積顯著變大。圖19B～圖19D分別表明：形成類器官之細胞相較於未形成類器官之細胞，周圍長度、長徑及短徑顯著變大。圖19E～圖19H表明：關於真球度、灰值(平均數、眾數)及重心，形成類器官之細胞與未形成類器官之細胞之間無有意義差。
實施例5表明：自小鼠獲得之肺上皮細胞中相對較大之細胞，具體而言為其面積、周圍長度、長徑、及/或短徑較大之細胞形成類器官之傾向較高。
[實施例6]以單細胞進行培養時之類器官形成之成像 於如實施例5般以集群培養細胞而對該集群內之各個細胞之培養經過進行觀察之情形時，存在如下情況：隨著時間經過，某一細胞與其他細胞成為一體而形成細胞塊等，從而無法追蹤該細胞之類器官形成過程。於實施例6中，藉由將單細胞接種於1孔中進行培養，更準確地對容易形成類器官之細胞之形態特徵進行調查。
以與實施例5相同之方式，自小鼠製備肺上皮細胞之細胞懸浮液，繼而，將上述細胞懸浮液供於FACS而收集棒狀細胞。使上述棒狀細胞懸浮於培養用培養基(MTEC/B27＋5%FBS＋「YHF10KNS」)中，製備出每1 ml培養用培養基中包含2,500～5,000細胞之細胞懸浮液。將上述細胞懸浮液2 ml接種於使用Biosurfine AWP-MRH(6%aq)(東洋合成)經非黏著化之Elplasia6孔板(Corning 4444)中，將上述板靜置30分鐘。其後，使用作為細胞擷取&成像系統之Cellhandler(Yamaha)，取得上述板之孔之明視野(BF)圖像及碘化丙啶(PI，#130-093-233，Miltenyi Biotec)之螢光圖像，將PI陰性之活細胞逐個添加於384孔板(CELLSTAR，#655892，Greiner)之1孔中之50 μL培養液(MTEC/B27＋5%FBS＋「YHF10KNS」＋2.5%Matrigel)中。將各孔中之細胞於37℃、5%CO2 下培養10天，形成類器官。於細胞塊之長徑變成50 μm以上之情形時，判斷形成了類器官。以與實施例5相同之時間間隔拍攝由單細胞形成類器官之過程。對於所取得之圖像資料，使用ImageJ(ver.1.52n)，以與實施例5相同之方式對細胞形態之項目進行測量。
(結果) 將自3隻小鼠獲得之1,053細胞分別於不同之孔中進行培養，觀察由單細胞形成類器官之過程。1,053細胞中之307細胞形成類器官，746細胞未形成類器官。對形成類器官之細胞、及未形成類器官之細胞各者之形態進行測量(圖20)。形成類器官之細胞相較於未形成類器官之細胞，面積、周圍長度、長徑及短徑顯著變大(圖20A～圖20D)。關於真球度、灰值(平均數、眾數)及重心，形成類器官之細胞與未形成類器官之細胞之間無有意義差(圖20E～圖20H)。
實施例6與實施例5相同，表明自小鼠獲得之肺上皮細胞中相對較大之細胞，具體而言為其面積、周圍長度、長徑、及/或短徑較大之細胞形成類器官之傾向較高。
[實施例7]單細胞時之細胞形態之測量及RNA序列測定之組合 為了對具有實施例5及6所示之形態特徵之細胞中之基因表現圖案進行調查，將一分子之細胞之形態測量資料與一分子RNA序列測定資料加以組合而進行分析。 以與實施例6相同之方式，從自小鼠獲得之肺上皮細胞中將棒狀細胞回收，使上述棒狀細胞懸浮於培養用培養基(MTEC/B27＋5%FBS＋「Y」)中而製備每1 ml培養用培養基中包含2,500～5,000細胞之細胞懸浮液。將上述細胞懸浮液2 ml接種於使用Biosurfine AWP-MRH(6%aq)(東洋合成)經非黏著化之Elplasia6孔板(Corning 4444)中，將上述板靜置30分鐘。其後，使用Cellhandler(Yamaha)，取得上述板之孔之BF圖像及PI圖像，將PI陰性之活細胞逐個添加於96孔之PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)板之1個孔中之RNase(ribonuclease，核糖核酸酶)抑制劑溶液2 μL(RNAsin plus 0.2 μL，5xMaxima H-buffer 0.4 μL，無RNase水1.4 μL)中。對上述各細胞進行RNA序列測定，取得單細胞RNA序列測定資料。又，使用ImageJ(ver.1.52n)，以與實施例5相同之方式，根據關於各細胞之圖像資料對細胞形態之項目進行測量。使用分析軟體Seurat(ver.3)，將關於所測量之細胞形態之圖像分析資料與單細胞RNA序列測定資料進行整合。
(結果) 將關於單細胞之細胞形態之圖像分析資料與單細胞RNA序列測定資料加以組合而進行聚類分析，結果為，已測定之細胞主要分為3個叢集(圖21)。將圖21A～C中右上方所示之叢集稱為「叢集0」，將右下方所示之叢集稱為「叢集1」，並將左下方所示之叢集稱為「叢集2」。圖21A表示各叢集中之作為棒狀細胞標記物之Scgb1a1之表現等級，顯示叢集0及2較強地表現出Scgb1a1。該結果揭示了與叢集0及2對應之細胞為棒狀細胞(圖21C)。圖21B表示各叢集中之作為AT2細胞標記物之Sftpc之表現等級，顯示叢集1較強地表現出Sftpc。該結果表明，與叢集1對應之細胞為AT2細胞(圖21C)。
圖21D表示與各叢集對應之細胞之面積。圖21D表明：與叢集2對應之棒狀細胞(圖21D之右側)相較於與叢集0對應之棒狀細胞(圖21D之左側)，細胞之面積更大。若考慮實施例4及5之結果，則揭示了與叢集2對應之相對較大之棒狀細胞係形成類器官之傾向較高之細胞。
藉由將關於細胞形態之圖像分析資料與單細胞RNA序列測定資料進行整合，可知與各叢集對應之細胞較強地表現出特定之基因。以下之表分別揭示各叢集中較強地表現之基因之前20位基因。 [表9]
表現等級 Top 叢集0 叢集1 叢集2
1 Cbr2 Lamp3 Tff2
2 Hp Lyz2 Reg3g
3 Cyp2f2 Napsa Bpifb1
4 Prdx6 Slc34a2 Muc5b
5 Scgb1a1 Lyz1 Sult1d1
6 Ldhb Rnase4 Fxyd3
7 Ces1d Hc Scgb3a1
8 Cckar Cd74 Lypd2
9 Selenbp1 Scd1 Chad
10 Gstm2 Sftpc S100a6
11 Scnn1b Lgi3 Pglyrp1
12 Scgb1c1 Cldn18 Aldh3a1
13 Plpp3 Etv5 Bpifa1
14 Ephx1 Cxcl15 Gsto1
15 Dcxr S100g Lgals3
16 Alas1 Elovl1 Pigr
17 Retnla Fas Scgb3a2
18 Sec14l3 H2-Aa Ltf
19 Ptgr1 Fabp5 Qsox1
20 Krtap17-1 Rn4.5s Cyp2a5
對相較於與其他叢集對應之細胞，在與叢集2對應之細胞中更強地表現之細胞表面蛋白所對應之基因之轉錄等級進行調查(圖22)。其結果可知，Fxyd3、Pigr、Cpd、Ly6a、Perp、Kcne3、Il13ra1、Slc15a2、及Cd14於叢集2中相對較強地表現。
實施例5～7表明：藉由選擇表現出實施例7中發現之標記物之肺上皮細胞，可選出形成類器官之傾向較高之肺上皮細胞。
[實施例8]CD14+ 之棒狀細胞之類器官形成 使用實施例7中發現之標記物中之CD14，自肺上皮細胞分取出表現出CD14之CD14+ 細胞(與叢集2對應之細胞)，對CD14+ 細胞形成類器官之傾向是否較高進行調查。 使用以下抗體：抗CD14-APC(#17-1401-81，invitrogen)、抗MHC class2-eFluoro450(#48-5321，eBioscience)、抗CD24-PEcy7(#25-0242-80，invitrogen)、抗CD45-biotin(#13-0451，eBioscience)、抗CD31-biotin(#13-0311，eBioscience)，除此以外，以與實施例5相同之方式製備用以供於FACS之細胞懸浮液。
(CD14+ 細胞之分取) 藉由進行FACS，自所製備之細胞懸浮液將經7-AAD染色之死細胞去除，將經抗CD31染色之內皮細胞去除，將經抗CD45抗體染色之血球系細胞去除，進而將經抗MHC class2抗體染色之AT2細胞(與叢集1對應之細胞)去除。自殘留之細胞集群收集發出源自GFP之螢光之Scgb1a1陽性細胞(主要為棒狀細胞)，並收集經抗CD24抗體染色之組織幹細胞/祖細胞(CD24lo )。藉此，選出與叢集0及叢集2對應之細胞。繼而，分別分取出經抗CD14抗體染色之CD14+ 細胞與未經染色之CD14- 細胞。利用FACS進行之CD14+ 細胞與CD14- 細胞之分取藉由如下方式進行。首先，將使用同型抗體之細胞懸浮液供於FACS，並設定門以包含所獲得之細胞分佈。繼而，將使用抗CD14抗體之細胞懸浮液供於FACS，分取出所獲得之細胞分佈中之超出所設定之門範圍之細胞作為CD14+ 細胞，分取出該門內之細胞作為CD14- 細胞。
為了調查CD14+ 細胞是否為與叢集2對應之棒狀細胞，藉由qPCR對發現在與叢集2對應之細胞中較強地表現之基因、Muc5b、Scgb3a1及Tff2之表現等級進行調查(圖23A)。圖23A表明：於CD14+ 細胞中，作為在與叢集2對應之細胞中較強地表現之標記基因之Muc5b、Scgb3a1及Tff2之表現等級較高。該結果揭示了CD14+ 細胞為與叢集2對應之棒狀細胞。
進而，調查CD14+ 細胞是否為形成類器官之傾向較高之相對較大之細胞(圖23B)。對藉由上述方式獲得之CD14+/- 細胞施加離心分離(400 G，5分鐘，4℃)，再次使其懸浮於250 μL之基本培養基中，添加5 μL之PI，分注於黑色之玻璃底96孔板(Sensoplate，Greiner#655892)中，將上述96孔板靜置30分鐘。其後，針對上述孔之各孔取得明視野(BF)圖像及GFP/PI之螢光圖像。將經PI染色之死細胞排除在以後之分析外。又，亦將失焦之細胞、位於平鋪邊緣而看不到整體圖像之細胞、與其他細胞接觸之細胞排除在以後之分析外。針對發出源自GFP之螢光之棒狀細胞測量細胞形態。細胞形態之測量係以與實施例5相同之方式使用ImageJ對BF圖像資料進行(圖23B)。圖23B表明：CD14+ 細胞相較於CD14- 細胞，細胞之面積顯著變大。 該等結果表明：藉由基於用以選擇叢集2之上述細胞標記物之至少1種(例如CD14+ )選擇細胞，可獲得細胞面積相對較大之與叢集2對應之細胞。
(形成CD14+ 細胞之類器官) 調查藉由上述方式獲得之CD14+ 細胞形成類器官之傾向是否較高。將以與實施例3相同之方式使培養用培養基(MTEC/B27＋「YHF10KNS」＋2.5%Matrigel 2 mL)中包含CD14+/- 細胞而得之細胞懸浮液以每孔中有300細胞之方式進行接種並培養9天，形成類器官(圖24A)。圖24A表明：相較於CD14- 細胞，CD14+ 細胞形成更多更大之類器官。培養CD14+/- 細胞所形成之細胞塊之比率(CFE[%])亦證實了CD14+ 細胞相較於CD14- 細胞，形成類器官之傾向顯著變高(圖24B)。
調查培養第9天之源自CD14+/- 細胞之類器官中，與叢集2對應之棒狀細胞以何種程度分化(圖25)。圖25表明：CD14+ 細胞及CD14- 細胞關於Alveolar系統之標記基因，具體而言為Sftpc、Ager及Hopx之表現均無有意義差。另一方面，關於Bronchiolar系統之標記基因，具體而言為Sox2(支氣管上皮細胞標記物)之表現，CD14- 細胞相較於CD14+ 細胞顯著變低。又，關於Scgb1a1(棒狀細胞標記物)及Foxj1(纖毛細胞標記物)之表現，CD14- 細胞相較於CD14+ 細胞顯示出更低之傾向。該等結果表明：與叢集0對應之CD14- 細胞自棒狀細胞分化成肺泡細胞之傾向較高。
針對上述CD14+/- 細胞之培養第9天及第12天(為了誘導分化，於培養第9天將培養用培養基置換為基本培養基並培養3天)之類器官進行免疫染色(圖26)。圖26A表明：培養第9天之類器官包含同時表現出作為棒狀細胞標記物之SCGB1A1及作為AT2細胞標記物之SFTPC兩者之細胞。圖26B表明：培養第9天之類器官同時表現出作為AT1標記物之AGER及HOPX兩者。該等結果表明：與叢集2對應之CD14+ 細胞於源自上述細胞之類器官中分化成肺泡系統之細胞之傾向較高。
[實施例9]向肺損傷模型小鼠移植初代肺上皮細胞 對CD14+/- 細胞於自肺損傷恢復過程中之肺中能否增殖或分化成肺泡細胞進行調查。 以與實施例8相同之方式自基因重組小鼠Scgb1a1-CreER; Rosa26-mTmG回收CD14+/- 細胞，分別使上述CD14- 細胞及CD14+ 細胞懸浮於培養用培養基(MTEC/B27＋5%FBS＋「YHF10KNS」)中，製備出每75 μL培養用培養基中包含7,000細胞之CD14+/- 細胞懸浮液。於投予上述細胞懸浮液1週前，對胸腺及T細胞功能缺失之裸小鼠BALB/cSlc-nu/nu(10週齡，25 g以上)以成為3 mg/Kg之方式經鼻注入博萊黴素，準備肺損傷模型小鼠。通過氣管對上述肺損傷模型小鼠之肺投予上述細胞懸浮液。
於投予上述細胞懸浮液2週後，將上述肺損傷模型小鼠進行解剖，對所投予之上述細胞於肺中之生存及增殖情況進行調查(圖27)。於上述調查中使用上述小鼠之左肺。使用左肺製作冷凍塊，使用切片機將上述塊製成厚度8 μm之組織切片。組織切片間之間隔為約100 μm。對於每一隻小鼠，於40片組織切片中觀察源自GFP之螢光。基於上述肺中確認到之叢集之數量(圖27A)及1個叢集中所包含之細胞之數量(圖27B)，對所投予之細胞於上述肺中之生存能力進行評估。於實施例9中，將發出源自GFP之螢光之細胞間之距離為100 μm以下之細胞之聚集體定義為1個叢集。
圖27A表明：CD14+ 細胞及CD14- 細胞分別可於受到博萊黴素傷害之肺中生存。圖27A表明：相較於CD14- 細胞，顯著更多之CD14+ 細胞於上述肺中生存。圖27B表明：相較於源自CD14- 細胞之叢集，源自CD14+ 細胞之叢集包含顯著更多之細胞。於投予有CD14+ 細胞之小鼠之肺中，觀察到認為源於炎症之纖維化。另一方面，相較於投予有CD14+ 細胞之小鼠之肺中觀察到之纖維化，於投予有CD14- 細胞之小鼠之肺中觀察到更輕度之纖維化。
藉由對上述肺中發出源自GFP之螢光之細胞中之細胞標記物之表現進行調查，而調查所投予之細胞於上述肺中之分化能力。於上述調查中使用上述小鼠之右肺。自冷凍之右肺製作石蠟塊，自上述塊製備厚度6 μm之組織切片。對上述組織切片進行免疫染色。上述免疫染色表明：於投予有CD14+ 細胞之肺中，存在表現出GFP且表現出作為AT2細胞標記物之SFTPC之AT2細胞、及表現出GFP且表現出作為AT1細胞標記物之PDPN之AT1細胞。上述肺中未觀察到表現出作為纖毛細胞標記物之AcTub之纖毛細胞、及表現出基底細胞標記物AcTub之細胞。該等結果表明：所投予之CD14+ 細胞(GFP陽性細胞)分化成作為肺泡系統之細胞之AT2細胞及AT1細胞(圖28)。又，上述免疫染色表明：於投予有CD14+ 細胞之肺中，存在表現出GFP且表現出作為棒狀細胞標記物之SCGB1A1之棒狀細胞、及表現出GFP且表現出作為纖毛細胞標記物之AcTub之纖毛細胞。該結果表明：由於所投予之CD14+ 細胞(GFP陽性細胞)同時表現出作為棒狀細胞標記物之SCGB1A1與作為纖毛細胞標記物之AcTUB，因此亦分化成作為支氣管系統之細胞之纖毛細胞(圖29)。
實施例9揭示：與叢集0對應之細胞(例如CD14- 細胞)於傳遞至之肺中不會引起炎症等不良影響，具有形成類器官之能力，且可具有分化成肺泡及支氣管系統之細胞之能力，因此可用於用以修復肺損傷或肺部疾病之再生醫療用組合物。又，實施例9揭示：與叢集2對應之細胞(例如CD14+ 細胞)具有有效率地形成類器官之能力，且具有分化成肺泡及支氣管系統之細胞之能力，因此可用於用以修復肺損傷或肺部疾病之再生醫療用組合物。又，揭示了與叢集2對應之細胞(例如CD14+ 細胞)可用於用以搬運修復損傷之肺或罹患疾病之肺之藥劑(例如有機化合物、基因或蛋白質)之載體。
圖1係基於源自來自SFTPC-GFP小鼠之肺上皮幹細胞之綠色螢光蛋白(GFP)螢光強度之上述肺上皮幹細胞的散佈圖。 圖2係表示包含細胞外基質作為支架之培養用培養基中所形成之GFPhi 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官之形成比率的條形圖。 圖3係表示包含細胞外基質作為支架之培養用培養基中所形成之GFPhi 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官之長徑的條形圖。 圖4係表示包含細胞外基質作為支架之培養用培養基中所形成之GFPlo 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官之形成比率的條形圖。 圖5係表示包含細胞外基質作為支架之培養用培養基中所形成之GFPlo 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官之長徑的條形圖。 圖6係表示包含細胞外基質作為分散成分之培養用培養基中所形成之源自肺上皮幹細胞之類器官之形成比率的條形圖。 圖7係表示源自肺癌細胞之類器官之形成比率的條形圖。 圖8係基於源自來自SFTPC-GFP小鼠之肺上皮幹細胞之GFP螢光強度之上述肺上皮幹細胞的散佈圖。 圖9係表示各GFP份中之各標記基因之表現量的條形圖。 圖10係GFPneg 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官的螢光圖像。 圖11係GFPlo 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官的螢光圖像。 圖12係GFPhi 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官的螢光圖像。 圖13A係表示包含細胞外基質作為支架之培養用培養基中所形成之GFPhi 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官之形成比率的條形圖。圖13B係表示包含細胞外基質作為支架之培養用培養基中所形成之GFPhi 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官之長徑的圖表。 圖14A係表示包含細胞外基質作為支架之培養用培養基中所形成之GFPlo 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官之形成比率的條形圖。圖14B係表示包含細胞外基質作為支架之培養用培養基中所形成之GFPlo 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官之長徑的圖表。 圖15A係表示包含細胞外基質作為支架之培養用培養基中所形成之GFPneg 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官之形成比率的條形圖。圖15B係表示包含細胞外基質作為支架之培養用培養基中所形成之GFPneg 份中之源自肺上皮幹細胞之類器官之長徑的圖表。 圖16A係實施例3中使用之供體小鼠及受體小鼠之模式圖。圖16B係實施例3之方案圖。圖16C係被投予了來自類器官之細胞之小鼠之肺之冷凍切片的螢光圖像。圖16D係將圖16C之由白四邊形包圍之區域放大後之螢光圖像。 圖17A係由人肺泡細胞所形成之類器官之顯微鏡圖像。圖17B係由人呼吸道細胞所形成之類器官之顯微鏡圖像。 圖18A係由人肺泡細胞所形成之肺泡型類器官之螢光圖像。圖18B係由人肺泡細胞所形成之支氣管肺泡型類器官之螢光圖像。圖18C係由人肺泡細胞所形成之支氣管型類器官之螢光圖像。圖18D係由人呼吸道細胞所形成之類器官之螢光圖像。 圖19A係表示以細胞集群進行培養之情形時之形成類器官之細胞之面積的圖表。圖19B係表示以細胞集群進行培養之情形時之形成類器官之細胞之周圍長度的圖表。圖19C係表示以細胞集群進行培養之情形時之形成類器官之細胞之長徑的圖表。圖19D係表示以細胞集群進行培養之情形時之形成類器官之細胞之短徑的圖表。圖19E係表示以細胞集群進行培養之情形時之形成類器官之細胞之真球度的圖表。圖19F係表示以細胞集群進行培養之情形時之形成類器官之細胞之灰值(平均)的圖表。圖19G係表示以細胞集群進行培養之情形時之形成類器官之細胞之灰值(眾數)的圖表。圖19H係表示以細胞集群進行培養之情形時之形成類器官之細胞之重心的圖表。 圖20A係表示以單細胞進行培養之情形時之形成類器官之細胞之面積的圖表。圖20B係表示以單細胞進行培養之情形時之形成類器官之細胞之周圍長度的圖表。圖20C係表示以單細胞進行培養之情形時之形成類器官之細胞之長徑的圖表。圖20D係表示以單細胞進行培養之情形時之形成類器官之細胞之短徑的圖表。圖20E係表示以單細胞進行培養之情形時之形成類器官之細胞之真球度的圖表。圖20F係表示以單細胞進行培養之情形時之形成類器官之細胞之灰值(平均)的圖表。圖20G係表示以單細胞進行培養之情形時之形成類器官之細胞之灰值(眾數)的圖表。圖20H係表示以單細胞進行培養之情形時之形成類器官之細胞之重心的圖表。 圖21A係表示各叢集中之Scgb1a1之表現等級的散佈圖。圖21B係表示各叢集中之Sftpc之表現等級的散佈圖。圖21C係表示各叢集之細胞種之散佈圖。圖21D係表示各叢集之面積之圖表。 圖22係表示與叢集2對應之細胞中較強地表現之9種細胞表面標記物的圖表。 圖23A係表示CD14+/- 細胞中之標記基因之表現等級的條形圖。圖23B係表示CD14+/- 細胞之面積之圖表。 圖24A係表示培養第9天之CD14+/- 細胞之顯微鏡圖像。圖24B係表示源自CD14+/- 細胞之類器官之形成比率的條形圖。 圖25係表示源自CD14+/- 細胞之類器官中之標記基因之表現量的條形圖。 圖26A係CD14+ 細胞之培養第9天之類器官中之免疫染色的螢光圖像。圖26B係CD14+ 細胞之培養第12天之類器官中之免疫染色的螢光圖像。 圖27A係表示被投予了CD14+/- 細胞之肺中所觀察到之叢集之數量的條形圖。圖27B係表示被投予了CD14+/- 細胞之肺中所觀察到之叢集中所包含之細胞數的圖表。 圖28係表示對受到博萊黴素傷害之肺投予之CD14+ 細胞分化成1型肺泡上皮細胞(以下亦稱為「AT1細胞」)或2型肺泡上皮細胞(以下亦稱為「AT2細胞」)這一情況的螢光圖像。 圖29係表示對受到博萊黴素傷害之肺投予之CD14+ 細胞分化成纖毛細胞這一情況的螢光圖像。

Claims (13)

  1. 一種自肺上皮細胞或肺癌細胞製造類器官之方法，其包括於培養用培養基中培養包含肺上皮細胞或肺癌細胞之樣本之步驟， 上述培養用培養基包含0～10%v/v之細胞外基質，且 包含選自由角質細胞生長因子(KGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)10及肝細胞生長因子(HGF)所組成之群中之至少1種、骨形態生成蛋白(BMP)抑制劑、以及TGFβ抑制劑之組合，並且 上述培養用培養基實質上不包含餵養細胞。
  2. 如請求項1之方法，其中上述組合進而包含Wnt訊息活化劑及Rho-激酶(ROCK)抑制劑之任一者或兩者。
  3. 如請求項2之方法，其中上述組合為： KGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合； KGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合； FGF10、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合； FGF10、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合； HGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合； HGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合； KGF、FGF10、HGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合； KGF、FGF10、HGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合； ROCK抑制劑、KGF、FGF10、HGF、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合；或 ROCK抑制劑、KGF、FGF10、HGF、Wnt訊息活化劑、BMP抑制劑、及TGFβ抑制劑之組合。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述BMP抑制劑為Noggin，及/或 上述TGFβ抑制劑為SB431542。
  5. 如請求項2至4中任一項之方法，其中上述Wnt訊息活化劑為CHIR99021，及/或 上述ROCK抑制劑為Y-27632。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中上述樣本中所包含之肺上皮幹細胞包含選自由基底細胞、棒狀細胞、支氣管肺泡上皮幹細胞及肺泡上皮細胞所組成之群中之至少1種細胞種。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其包括以下步驟：於在上述培養用培養基中培養上述樣本之前，基於針對棒狀細胞-I、AT2細胞及棒狀細胞-II各者於表A中列舉之細胞標記物以及其等之同源物之至少1種，自上述樣本選擇棒狀細胞-I、AT2細胞或棒狀細胞-II， 表A       棒狀細胞-I AT2細胞 棒狀細胞-II Cbr2 Lamp3 Tff2 Hp Lyz2 Reg3g Cyp2f2 Napsa Bpifb1 Prdx6 Slc34a2 Muc5b Scgb1a1 Lyz1 Sult1d1 Ldhb Rnase4 Fxyd3 Ces1d Hc Scgb3a1 Cckar Cd74 Lypd2 Selenbp1 Scd1 Chad Gstm2 Sftpc S100a6 Scnn1b Lgi3 Pglyrp1 Scgb1c1 Cldn18 Aldh3a1 Plpp3 Etv5 Bpifa1 Ephx1 Cxcl15 Gsto1 Dcxr S100g Lgals3 Alas1 Elovl1 Pigr Retnla Fas Scgb3a2 Sec14l3 H2-Aa Ltf Ptgr1 Fabp5 Qsox1 Krtap17-1 Rn4.5s Cyp2a5       Cpd       Ly6a       Perp       Kcne3       Il13ra1       Slc15a2       Cd14
    。
  8. 一種源自肺上皮細胞或肺癌細胞之類器官，其係藉由如請求項1至7中任一項之方法所製造。
  9. 一種類器官，係源自肺上皮細胞，且包含內腔、及面對上述內腔之細胞層，且 上述肺上皮細胞為肺泡細胞， 上述細胞層 本質上由AT2細胞組成； 本質上由AT2細胞與表現出AT2細胞標記物及支氣管上皮標記物之細胞之組合組成；或 本質上由表現出支氣管上皮標記物之細胞組成；或者 上述肺上皮細胞為呼吸道細胞，上述細胞層本質上由基底細胞與表現出基底細胞標記物及支氣管上皮標記物之細胞之組合組成。
  10. 如請求項9之類器官，其中上述肺上皮細胞為肺泡細胞，上述細胞層本質上由AT2細胞組成，上述AT2細胞表現出HT2-280及SFTPC之任一者或兩者，且上述HT2-280於上述AT2細胞中局部存在於面對上述內腔之細胞膜或其附近。
  11. 如請求項9之類器官，其中上述AT2細胞標記物為HT2-280及SFTPC之任一者或兩者， 上述支氣管上皮標記物為SOX2，及/或 上述基底細胞標記物為KRT5。
  12. 一種再生醫療用組合物，其包含藉由如請求項1至7中任一項之方法所製造之源自肺上皮細胞之類器官、如請求項9至11中任一項之源自肺上皮細胞之類器官、及/或上述類器官之細胞。
  13. 一種篩選用於治療肺癌之物質之方法，其包括以下步驟： 使藉由如請求項1至7中任一項之方法所製造之源自肺癌細胞之類器官與試驗樣品接觸； 對與上述試驗樣品接觸後之類器官進行測定；及 將與上述試驗樣品接觸後之類器官之測定值與對照值進行比較。
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