KR20230016653A - 폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터의 오르가노이드의 제조 방법 - Google Patents

폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터의 오르가노이드의 제조 방법 Download PDF

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미츠루 모리모토
다카시 후지무라
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오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤
고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소
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Abstract

폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료를 배양 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터 오르가노이드를 제조하는 방법이며, 상기 배양 배지는, 0 내지 10％v/v의 세포외 매트릭스를 포함하고, 및 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 증식 인자(FGF) 10 및 간세포 성장 인자(HGF)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종과, 뼈 형성 단백질(BMP) 저해제와, TGFβ 저해제의 조합을 포함하고, 그리고 상기 배양 배지는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는, 방법.

Description

폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터의 오르가노이드의 제조 방법
본 발명은, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 폐암 세포 유래의 오르가노이드의 제조 방법에도 관한 것이다. 본 발명은 또한, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드를 포함하는 재생 의료용 조성물, 및 폐암을 처치하기 위한 물질을 스크리닝하는 방법에도 관한 것이다.
조직 줄기 세포는 생리적 평형 하에 있어서, 분화 세포의 적절한 턴오버에 기여한다. 조직 줄기 세포는, 장기가 손상을 받은 경우, 분화 세포를 공급함으로써, 손상으로부터의 재생에 중심적인 역할을 담당한다. 폐에는, 복수의 조직 줄기 세포가 존재한다. 각종 조직 줄기 세포에 관한 오르가노이드 배양 방법이 확립되어, 줄기 세포 연구 및 재생 의료를 목표로 한 응용 연구에 이용되고 있다. 오르가노이드 배양 방법으로서는, 피더 세포를 사용한 배양 방법이 널리 사용되고 있다(특허문헌 1). 근년, 피더 세포를 사용하지 않는, 오르가노이드 배양 방법에 대해서도 검토가 진행되고 있다(특허문헌 2, 비특허문헌 1).
일본 특허 공표 2016-513469 일본 특허 공표 2018-503360
Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 515, Issue 4, 6 August 2019, Pages 579-585
본 개시는, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드의 신규 제조 방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.
본 개시는, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터 오르가노이드를 제조하는 방법이며, 상기 방법은, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료를 배양 배지 중에서 배양하는 것을 포함하고, 상기 배양 배지는, 0 내지 10％v/v의 세포외 매트릭스를 포함하고, 및 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 증식 인자(FGF) 10 및 간세포 성장 인자(HGF)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종과, 뼈 형성 단백질(BMP) 저해제와, TGFβ 저해제의 조합을 포함하고, 그리고 상기 배양 배지는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는, 방법을 제공한다.
본 개시는 또한, 상기 방법으로 제조된 폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드를 제공한다. 본 개시는, 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함하는, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드를 제공한다.
본 개시는 또한, 상기 방법으로 제조된 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드를 포함하는, 재생 의료용 조성물을 제공한다.
본 개시는 또한, 폐암을 처치하기 위한 물질을 스크리닝하는 방법이며, 상기 방법으로 제조된 폐암 세포 유래의 오르가노이드와, 피험 물질을 접촉시키는 것, 상기 피험 물질과의 접촉 후의 오르가노이드를 측정하는 것, 및 상기 피험 물질과의 접촉 후의 오르가노이드의 측정값과 대조값을 비교하는 것을 포함하는, 방법을 제공한다.
본 개시는 또한, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료를 배양 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터 오르가노이드를 제조하는 방법이며, 상기 배양 배지는, 0 내지 10％v/v의 세포외 매트릭스를 포함하고, 및 이하의 조합: Wnt 시그널 활성화제와, 뼈 형성 단백질(BMP) 저해제와, TGFβ 저해제와, 간세포 성장 인자(HGF)를 포함하는 조합; 케라티노사이트 성장 인자(KGF) 및 섬유아세포 증식 인자(FGF) 10 중 어느 한쪽 또는 양쪽과, BMP 저해제와, TGFβ 저해제와, HGF를 포함하는 조합; 또는 KGF 및 FGF10 중 어느 한쪽 또는 양쪽과, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제와, HGF를 포함하는 조합을 포함하고, 상기 배양 배지는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는, 방법을 제공한다.
본 개시는, 하기 발명을 제공한다:
[항 1] 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료를 배양 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터 오르가노이드를 제조하는 방법이며, 상기 배양 배지는, 0 내지 10％v/v의 세포외 매트릭스를 포함하고, 및 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 증식 인자(FGF) 10 및 간세포 성장 인자(HGF)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종과, 뼈 형성 단백질(BMP) 저해제와, TGFβ 저해제의 조합을 포함하고, 그리고 상기 배양 배지는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는, 방법.
[항 2] 상기 조합이, Wnt 시그널 활성화제 및 Rho-키나아제(ROCK) 저해제 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 더 포함하는, 항 1에 기재된 방법.
[항 3] 상기 조합이, KGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; KGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; FGF10과, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; FGF10과, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; HGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; HGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; KGF와, FGF10과, HGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; KGF와, FGF10과, HGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; ROCK 저해제와, KGF와, FGF10과, HGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; 또는 ROCK 저해제와, KGF와, FGF10과, HGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합인, 항 2에 기재된 방법.
[항 4] 상기 BMP 저해제가 노긴(Noggin)이며, 및/또는 상기 TGFβ 저해제가 SB431542인, 항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[항 5] 상기 Wnt 시그널 활성화제가 CHIR99021이며, 및/또는 상기 ROCK 저해제가 Y-27632인, 항 2 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[항 6] 상기 시료에 포함되는 폐 상피 줄기 세포가, 기저 세포, 클럽 세포, 기관지 폐포 상피 줄기 세포 및 폐포 상피 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 세포종을 포함하는, 항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[항 7] 상기 시료에 포함되는 폐 상피 세포가, 2형 폐포 상피 세포(이하 「AT2 세포」라고도 함)로 본질적으로 이루어지거나; 클럽 세포로 본질적으로 이루어지거나; 또는 기저 세포 및 클럽 세포의 조합으로 본질적으로 이루어지는, 항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[항 8] 상기 시료에 포함되는 폐 상피 세포가, 2형 폐포 상피 세포로 본질적으로 이루어지거나; 또는 클럽 세포로 본질적으로 이루어지는, 항 1 내지 5 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[항 9] 상기 시료를 상기 배양 배지 중에서 배양하기 전에, 클럽 세포-I, AT2 세포 및 클럽 세포-II 각각에 대하여 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종에 기초하여, 상기 시료로부터 클럽 세포-I, AT2 세포 또는 클럽 세포-II를 선택하는 것을 포함하는, 항 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 방법:
Figure pct00001
[항 10] 상기 조합을 포함하는 상기 배양 배지 중에서 배양한 상기 세포를, 상기 조합을 포함하지 않는 배양 배지에서 더 배양하는 것을 포함하는, 항 1 내지 9 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[항 11] 항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드.
[항 12] 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함하는, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드이며, 상기 폐 상피 세포가 폐포 세포이며, 상기 세포층이, AT2 세포로 본질적으로 이루어지거나; AT2 세포와, AT2 세포 마커 및 기관지 상피 마커를 발현하는 세포의 조합으로 본질적으로 이루어지거나; 또는 기관지 상피 마커를 발현하는 세포로 본질적으로 이루어지거나; 혹은 상기 폐 상피 세포가 기도 세포이며, 상기 세포층이 기저 세포와, 기저 세포 마커 및 기관지 상피 마커를 발현하는 세포의 조합으로 본질적으로 이루어지는, 오르가노이드.
[항 13] 상기 폐 상피 세포가 폐포 세포이며, 상기 세포층이 AT2 세포로 본질적으로 이루어지고; 상기 AT2 세포가 HT2-280 및 SFTPC 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 발현하고, 및 상기 HT2-280이 상기 AT2 세포에 있어서 상기 내강에 면하는 세포막에 혹은 그 근방에 국재하고 있는, 항 12에 기재된 오르가노이드.
[항 14] 상기 AT2 세포 마커가 HT2-280 및 SFTPC 중 어느 한쪽 또는 양쪽이며, 상기 기관지 상피 마커가 SOX2이며, 및/또는 상기 기저 세포 마커가 KRT5인, 항 12에 기재된 오르가노이드.
[항 15] 항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드, 항 12 내지 14 중 어느 한 항에 기재된 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드, 및/또는 상기 오르가노이드의 세포를 포함하는, 재생 의료용 조성물.
[항 16] 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종을 발현하는 클럽 세포-I, AT2 세포 또는 클럽 세포-II로 본질적으로 이루어지는 폐 상피 세포를 포함하는, 재생 의료용 조성물:
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[항 17] 폐암을 처치하기 위한 물질을 스크리닝하는 방법이며, 항 1 내지 10 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 폐암 세포 유래의 오르가노이드와, 피험 물질을 접촉시키는 것, 상기 피험 물질과의 접촉 후의 오르가노이드를 측정하는 것, 및 상기 피험 물질과의 접촉 후의 오르가노이드의 측정값과 대조값을 비교하는 것을 포함하는, 방법.
[항 18] 클럽 세포-II에 대하여 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종에 기초하여, 폐 상피 세포를 포함하는 시료로부터 선택된 클럽 세포-II로 본질적으로 이루어지는 폐 상피 세포, 및 폐 손상 혹은 폐 질환을 처치하기 위한 약제를 포함하는, 의약 조성물.
도 1은, SFTPC-GFP 마우스 유래의 폐 상피 줄기 세포로부터의 녹색 형광 단백질(GFP) 형광 강도에 기초하는, 상기 폐 상피 줄기 세포의 산포도이다.
도 2는, 스캐폴드로서 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, GFPhi 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 형성 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 3은, 스캐폴드로서 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, GFPhi 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 긴 직경을 나타내는 막대 그래프이다.
도 4는, 스캐폴드로서 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, GFPlo 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 형성 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 5는, 스캐폴드로서 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, GFPlo 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 긴 직경을 나타내는 막대 그래프이다.
도 6은, 분산 성분으로서 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 형성 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 7은, 폐암 세포 유래의 오르가노이드의 형성 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 8은, SFTPC-GFP 마우스 유래의 폐 상피 줄기 세포에서의 GFP 형광 강도에 기초하는, 상기 폐 상피 줄기 세포의 산포도이다.
도 9는, 각 GFP 분획에 있어서의 각 마커 유전자의 발현량을 나타내는 막대 그래프이다.
도 10은, GFPneg 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 형광 화상이다.
도 11은, GFPlo 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 형광 화상이다.
도 12는, GFPhi 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 형광 화상이다.
도 13의 A는, 스캐폴드로서의 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, GFPhi 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 형성 비율을 나타내는 막대 그래프이다. 도 13의 B는, 스캐폴드로서 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, GFPhi 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 긴 직경을 나타내는 그래프이다.
도 14의 A는, 스캐폴드로서의 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, GFPlo 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 형성 비율을 나타내는 막대 그래프이다. 도 14의 B는, 스캐폴드로서 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, GFPlo 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 긴 직경을 나타내는 그래프이다.
도 15의 A는, 스캐폴드로서의 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, GFPneg 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 형성 비율을 나타내는 막대 그래프이다. 도 15의 B는, 스캐폴드로서 세포외 매트릭스를 포함하는 배양 배지 중에서 형성된, GFPneg 분획 중의 폐 상피 줄기 세포 유래의 오르가노이드의 긴 직경을 나타내는 그래프이다.
도 16의 A는, 실시예 3에서 사용한 도너 마우스 및 레시피언트 마우스의 모식도이다. 도 16의 B는, 실시예 3의 스킴도이다. 도 16의 C는, 오르가노이드 유래의 세포를 투여된 마우스의 폐의 동결 절편의 형광 화상이다. 도 16의 D는, 도 16의 C의 백색 사각으로 둘러싼 영역을 확대한 형광 화상이다.
도 17의 A는, 인간 폐포 세포로 형성된 오르가노이드의 현미경 화상이다. 도 17의 B는, 인간 기도 세포로 형성된 오르가노이드의 현미경 화상이다.
도 18의 A는, 인간 폐포 세포로 형성된 폐포 타입의 오르가노이드의 형광 화상이다. 도 18의 B는, 인간 폐포 세포로 형성된 기관지 폐포 타입의 오르가노이드의 형광 화상이다. 도 18의 C는, 인간 폐포 세포로 형성된 기관지 타입의 오르가노이드의 형광 화상이다.
도 19의 A는, 세포 집단으로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 면적을 나타내는 그래프이다. 도 19의 B는, 세포 집단으로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 주위의 길이를 나타내는 그래프이다. 도 19의 C는, 세포 집단으로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 긴 직경을 나타내는 그래프이다. 도 19의 D는, 세포 집단으로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 짧은 직경을 나타내는 그래프이다. 도 19의 E는, 세포 집단으로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 진구도를 나타내는 그래프이다. 도 19의 F는, 세포 집단으로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 그레이값(평균)을 나타내는 그래프이다. 도 19의 G는, 세포 집단으로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 그레이값(최빈값)을 나타내는 그래프이다. 도 19의 H는, 세포 집단으로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 중심(重心)을 나타내는 그래프이다.
도 20의 A는, 1 세포로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 면적을 나타내는 그래프이다. 도 20의 B는, 1 세포로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 주위의 길이를 나타내는 그래프이다. 도 20의 C는, 1 세포로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 긴 직경을 나타내는 그래프이다. 도 20의 D는, 1 세포로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 짧은 직경을 나타내는 그래프이다. 도 20의 E는, 1 세포로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 진구도를 나타내는 그래프이다. 도 20의 F는, 1 세포로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 그레이값(평균)을 나타내는 그래프이다. 도 20의 G는, 1 세포로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 그레이값(최빈값)을 나타내는 그래프이다. 도 20의 H는, 1 세포로 배양한 경우의, 오르가노이드를 형성한 세포의 중심을 나타내는 그래프이다.
도 21의 A는, 각 클러스터에 있어서의 Scgb1a1의 발현 레벨을 나타내는 산포도이다. 도 21의 B는, 각 클러스터에 있어서의 Sftpc의 발현 레벨을 나타내는 산포도이다. 도 21의 C는, 각 클러스터의 세포종을 나타내는 산포도이다. 도 21의 D는, 각 클러스터의 면적을 나타내는 그래프이다.
도 22는, 클러스터 2에 대응하는 세포에서 강하게 발현되는 9종의 세포 표면 마커를 나타내는 그래프이다.
도 23의 A는, CD14+/- 세포에 있어서의 마커 유전자의 발현 레벨을 나타내는 막대 그래프이다. 도 23의 B는, CD14+/- 세포의 면적을 나타내는 그래프이다.
도 24의 A는, 배양 9일째의 CD14+/- 세포를 나타내는 현미경 화상이다. 도 24의 B는, CD14+/- 세포 유래의 오르가노이드의 형성 비율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 25는, CD14+/- 세포 유래의 오르가노이드에 있어서의 마커 유전자의 발현량을 나타내는 막대 그래프이다.
도 26의 A는, CD14+ 세포의 배양 9일째의 오르가노이드에 있어서의 면역 염색의 형광 화상이다. 도 26의 B는, CD14+ 세포의 배양 12일째의 오르가노이드에 있어서의 면역 염색의 형광 화상이다.
도 27의 A는, CD14+/- 세포가 투여된 폐에서 관찰된 클러스터의 수를 나타내는 막대 그래프이다. 도 27의 B는, CD14+/- 세포가 투여된 폐에서 관찰된 클러스터에 포함되는 세포수를 나타내는 그래프이다.
도 28은, 블레오마이신 상해를 받은 폐에 투여된 CD14+ 세포가 1형 폐포 상피 세포(이하 「AT1 세포」라고도 함) 또는 2형 폐포 상피 세포(이하 「AT2 세포」라고도 함)로 분화된 것을 나타내는 형광 화상이다.
도 29는, 블레오마이신 상해를 받은 폐에 투여된 CD14+ 세포가 섬모 세포로 분화된 것을 나타내는 형광 화상이다.
[폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터의 오르가노이드의 제조 방법]
본 개시의 하나의 양태는, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터 오르가노이드를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료를 배양 배지 중에서 배양하는 것을 포함하고, 상기 배양 배지는, 0 내지 10％v/v의 세포외 매트릭스를 포함하고, 및 본 개시에 관한 첨가제를 포함하고, 상기 배양 배지는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는다.
본 명세서에 있어서의 용어 「오르가노이드」는, 시험관내(in vitro)에서 형성된 3차원적인 생체 조직 유사의 세포 집합체를 의미한다. 오르가노이드의 문맥에 있어서, 「생체 조직 유사」 또는 「생체 조직에 유사하다」는, 오르가노이드의 해부학적 구조와 생체 조직의 해부학적 구조가 유사한 것을 의미한다. 오르가노이드를 구성하는 세포는, 예를 들어 그 대부분이 분화능 및 증식능을 갖는 세포이다. 오르가노이드를 구성하는 배양 세포는, 공지된 방법에 따라서 각종 세포 타입으로 분화시킬 수 있다. 오르가노이드를 구성하는 배양 세포는, 예를 들어 배양 배지에 첨가제를 포함하거나 또는 제거함으로써, 복수의 세포 타입으로 분화시킬 수 있다. 오르가노이드를 구성하는 배양 세포는, 예를 들어 본 개시에 관한 첨가제를 포함하지 않는 배양 배지 중에서 배양함으로써, 분화 유도될 수 있다. 오르가노이드는, 분화된 세포 또는 분화능을 갖지 않는 세포를 일부에 포함하고 있어도 된다. 오르가노이드는, 예를 들어 공지된 세포 배양 방법에 따라서 제조할 수 있다. 오르가노이드는, 예를 들어 본 개시에 관한 첨가제를 포함하는 배양 배지 중의 소정의 세포를, 세포 배양 장치 중에서 유지함으로써 제조할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 오르가노이드는, 폐 상피 줄기 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드이다.
하나의 실시 형태에 있어서, 오르가노이드는, 현미경 하에서 관찰한 경우에, 그 직경이 적어도 50㎛인 배양 세포의 집합체이다. 배양 세포의 집합체가 타원형인 경우, 직경은 긴 변의 길이이다. 배양 세포의 집합체가 복잡한 형상인 경우, 직경은 상기 세포 집합체의 외접원의 직경이다. 오르가노이드의 형성 효율(CFE: Colony Forming Efficiency)은, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료를 배양 배지 중에서 6일간 배양한 후의 배양물 중의 직경 50㎛ 이상의 세포괴의 수를, 상기 배양 배지에 포함한 폐 상피 세포 또는 폐암 세포의 세포수로 제산하여 얻어진 비율[％]로 나타내진다.
본 명세서에 있어서의 용어 「줄기 세포」는, 스스로 증식하는 능력(「증식능」이라고도 함)과, 특정한 세포 타입으로 분화되는 능력(「분화능」이라고도 함)을 갖는 세포를 의미한다. 줄기 세포는, 예를 들어 상피 줄기 세포로 분화할 수 있다. 줄기 세포는, 예를 들어 공지된 방법에 따라서 그 분화능을 유지시킨 채, 증식시킬 수 있다. 줄기 세포는 또한, 공지된 방법에 따라서 특정한 세포 타입으로 분화시키면서 증식시킬 수 있다.
본 명세서에 있어서의 용어 「폐 상피 세포」는, 폐의 상피 조직을 구성하는 세포를 의미한다. 폐 상피 세포는, 예를 들어 클럽 세포(Club cell), 섬모 세포(Ciliated cell), 신경내분비 세포, 기저 세포(Basal cell), 배세포, 또는 폐포 상피 세포, 혹은 상기 세포로 분화되는 능력을 구비한 폐 상피 줄기 세포이면 된다. 폐포 상피 세포는, 예를 들어 1형 폐포 상피 세포(Type II 폐포 상피 세포(alveolar epithelial cell): AT1 세포) 및 2형 폐포 상피 세포(AT2 세포) 중 어느 한쪽 또는 양쪽이면 된다. 본 명세서에 있어서의 용어 「폐 상피 줄기 세포」는, 폐 조직 중에 존재하고, 증식능과, 특정한 폐 상피 세포로 분화되는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 폐 조직은, 예를 들어 기관, 기관지, 세기관지 및 폐포를 포함한다.
폐 상피 줄기 세포는, 예를 들어 기저 세포, 클럽 세포 및 2형 폐포 상피 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 세포종으로 분화되는 능력을 갖는다. 폐 상피 줄기 세포는, 예를 들어 기관지 폐포 상피 줄기 세포(Bronchioalveolar stem cell: BASCs)이면 된다. 폐 상피 줄기 세포는, 공지된 방법(예를 들어, 특허문헌 2에 기재된 방법)에 따라서 조제할 수 있다.
기저 세포는 생리적 평형 하, 기관 상해 재생 시에 클럽 세포 및 섬모 세포로 분화되는 능력을 갖는다. 클럽 세포는 생리적 평형 하, 기관지 상해 재생 시에 있어서는 섬모 세포로 분화되는 능력을 갖지만, 중증의 폐포 상해 시에는, AT2 세포 및 AT1 세포로 분화된다. AT2 세포는 생리적 평형 하, 폐포 상해 시에 있어서 AT1 세포로 분화되는 능력을 갖는다.
본 명세서에 있어서의 용어 「폐포 세포」는, 폐포 조직으로부터 얻어지는 세포를 의미한다. 폐포 세포는 공지된 방법에 따라서 폐포 조직으로 조제할 수 있다. 폐포 세포는 상업적으로 입수 가능하다. 폐포 세포는, 예를 들어 폐포 상피 세포를 포함한다. 하나의 예에 있어서, 폐포 세포는, AT1 세포 및 AT2 세포 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 포함한다. 본 명세서에 있어서의 용어 「기도 세포」는, 기도 조직으로부터 얻어지는 세포를 의미한다. 기도 세포는 공지된 방법에 따라서 기도 조직으로 조제할 수 있다. 기도 세포는 상업적으로 입수 가능하다.
본 명세서에 있어서의 용어 「폐 상피 세포를 포함하는 시료」는, 예를 들어 포유 동물의 폐 조직으로 조제할 수 있다. 폐 상피 세포를 포함하는 시료는, 예를 들어 포유 동물의 폐 조직으로, 소정의 세포 마커(예를 들어, 세포막 표면 상의 특정한 단백질)를 지표로 하여 조제할 수 있다. 소정의 세포 마커는, 예를 들어 EPCAM이면 된다. 또한, 폐 상피 세포를 포함하는 시료로부터, 원하는 폐 상피 세포종을 포함하는 시료를 조제해도 된다. 원하는 폐 상피 세포종을 포함하는 시료를 제조할 때, 기저 세포는, 예를 들어 신경 성장 인자 수용체(NGFR)를 세포 마커로 해도 되고(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.106(31): 12771-12775, 2009), AT2 세포는, 예를 들어 AT2-280을 세포 마커로 해도 된다(Journal of Histochemistry & Cytochemistry, vol.58(10): 891-901, 2010). 소정의 세포 마커는, 생세포 내에 존재하는 특정한 RNA 표적이면 된다. RNA 표적은, 예를 들어 EPCAM, Sftpc, KRT-5 또는 Scgb1a1이면 된다.
소정의 세포 마커로서 세포막 표면 상의 특정한 단백질을 이용하는 경우, 상기 단백질에 대한 형광 물질이 결합된 항체를 사용하고, 그 형광 물질로부터의 형광을 지표로 해도 된다. 세포 마커를 지표로 한 세포의 조제 위해서, 공지된 장치(예를 들어, FACS)를 사용할 수 있다. 또한, 소정의 세포 마커로서 RNA 표적을 이용하는 경우, 폐 상피 세포를 포함하는 시료를, 특정한 조건 하에서, FACS에 의해 분획하고, 얻어진 각 분획의 부분 표본에 포함되는 세포종을 RNA 표적(예를 들어 RT-PCR)에 기초하여 특정하는 것을 포함해도 된다.
폐 상피 세포를 포함하는 시료는, 예를 들어 포유 동물의 폐 조직을 조각내서, 상기 폐 조직편을 프로테아제(예를 들어, 콜라게나아제, 디스파아제, 엘라스타아제 또는 트립신)로 처리한 후, 소정의 용액(예를 들어, 기본 배지)에 옮겨, 현탁시킴으로써 조제할 수 있다. 상기와 같이 조제한 세포 현탁액을 여과 및/또는 원심 분리를 행하여, 조직편 등의 협잡물을 제거해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 폐 상피 세포를 포함하는 시료는, 포유 동물의 성체, 유체, 신생아 또는 소아의 폐 조직으로 조제할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 폐 상피 세포를 포함하는 시료는, 포유 동물의 폐 조직으로 조제한 후에, 원하는 특징을 갖도록 유전자 개변(단, 다능성을 부여하는 개변은 포함하지 않음)이 실시된 폐 상피 세포를 포함해도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 상기 시료에 포함되는 폐 상피 세포는, 기저 세포, 클럽 세포, 기관지 폐포 상피 줄기 세포 및 폐포 상피 세포(예를 들어 AT1 세포 및 AT2 세포 중 어느 한쪽 또는 양쪽)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 세포종을 포함한다. 폐 상피 세포를 포함하는 시료는, 상업적으로 입수할 수 있다. 폐 상피 세포를 포함하는 시료는, 예를 들어 인간 폐포 세포를 포함하는 시료, 또는 인간 기도 세포를 포함하는 시료이면 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 시료에 포함되는 폐 상피 세포는, 기저 세포, 클럽 세포, 기관지폐 상피 줄기 세포 및 폐포 상피 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 적어도 2종 또는 적어도 3종의 세포로 본질적으로 이루어진다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 시료에 포함되는 폐 상피 세포는, 2형 폐포 상피 세포로 본질적으로 이루어진다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 시료에 포함되는 폐 상피 세포는, 클럽 세포로 본질적으로 이루어진다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 시료에 포함되는 폐 상피 세포는, 기저 세포 및 클럽 세포의 조합으로 본질적으로 이루어진다. 폐 상피 세포의 문맥에 있어서의 「로 본질적으로 이루어진다」는, 「만을 포함한다」를 배제하지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 시료에 포함되는 폐 상피 세포는, 특정한 세포종만을 포함한다. 상기 시료에 포함되는 폐 상피 세포는, 예를 들어 특정한 세포종을 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상 포함한다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 형태에 관한 방법은, 포유 동물의 폐 조직으로, 상기 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료를 조제하는 것을 더 포함한다. 상기 시료의 조제는 본 명세서에 개시한 방법 또는 공지된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 본 명세서에 있어서의 용어 「폐암 세포」는, 예를 들어 폐의 종양에서 유래하는 종양 세포이다. 폐암 세포는, 예를 들어 혈액 중을 순환하고 있는 종양 세포이면 되고, 또는 순환하고 있지 않은 종양 세포이면 된다. 폐암 세포는, 예를 들어 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 종양 세포를 포함하는 폐 조직으로부터 공지된 방법에 따라서 조제할 수 있다. 폐암 세포는, 예를 들어 폐선암 세포이다.
본 명세서에 있어서의 용어 「폐암 세포를 포함하는 시료」는, 예를 들어 폐암을 앓고 있는 포유 동물의 폐 조직으로부터, 폐암 세포 마커를 지표로 하여 분취할 수 있다. 폐암 세포 마커는, 예를 들어 SOX2, CD24, CD44, CD133, CD166 및 ESA 중 어느 것 또는 그들의 조합이면 된다. 폐암 세포는, 예를 들어 폐암 세포 마커를 지표로 하여, FACS를 이용하여 분취할 수 있다. 폐암 세포를 포함하는 시료는, 예를 들어 상업적으로 입수한 폐암 세포를 배양하여 증식시킨 세포를, 소정의 용액 중에 현탁시킴으로써 조제할 수 있다. 폐암 세포를 포함하는 시료는, 예를 들어 폐 상피 세포를 포함하는 시료에 대하여 설명한 방법에 따라서 조제할 수 있다. 폐암 세포를 포함하는 시료는, 예를 들어 정상적인 폐 상피 세포를 포함하고 있어도 된다.
본 명세서에 있어서의 용어 「포유 동물」은, 예를 들어 인간, 인간 이외의 포유 동물이다. 인간 이외의 포유 동물은, 예를 들어 마우스, 래트, 모르모트, 햄스터 등의 설치류, 침팬지 등의 비인간 영장류, 소, 염소, 양 등의 우제목, 말 등의 기제목, 토끼, 개, 고양이 등의 애완 동물이면 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 포유 동물은 설치류 또는 비인간 영장류이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 포유 동물은 인간이다.
본 명세서에 있어서의 용어 「폐 상피 세포 유래의 오르가노이드」 또는 「폐암 세포 유래의 오르가노이드」는, 시험관내(in vitro)에서 형성된 폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 3차원적인 생체 조직 유사체를 의미한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드는, 본 개시에 관한 첨가제를 포함하는 배양 배지 중에서 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 배양함으로써 형성된 오르가노이드이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드는, 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함한다.
본 명세서에 있어서의 용어 「배양 배지」는, 세포 배양에 필요한 성분을 포함하는 액체를 의미한다. 배양 배지는, 예를 들어 기본 배지 및 본 개시에 관한 첨가제를 포함한다. 배양 배지는, 예를 들어 기본 배지와, 본 개시에 관한 첨가제를 조합함으로써 조제할 수 있다. 배양 배지는, 예를 들어 기본 배지를 조제하기 위한 소정량 각 성분(고체)과, 소정량의 본 개시에 관한 첨가제(고체)를 혼합한 혼합물과, 소정 농도가 되는 양의 순수를 혼합함으로써 조제할 수 있다. 배양 배지는, 세포외 매트릭스 및 줄기 세포의 증식을 보조하는 피더 세포 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 더 포함해도 된다. 배양 배지는, 예를 들어 기본 배지와, 본 개시에 관한 첨가제를 혼합한 혼합물에, 세포외 매트릭스 및 줄기 세포의 증식을 보조하는 피더 세포 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 첨가함으로써 조제할 수 있다.
본 명세서에 있어서의 용어 「기본 배지」는, 공지된 세포 배양용 배지이면 되고, 예를 들어 둘베코 변법 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지(MEM), 기본 배지 이글(BME) 또는 DMEM/F12이면 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 기본 배지는 DMEM/F12이다.
본 개시에 관한 「첨가제」는, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드 형성의 효율에 영향을 미치는 2종 이상의 물질 조합을 의미한다. 첨가제는, 예를 들어 폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드 형성의 효율을 향상시키는 2종 이상의 물질 조합이면 된다. 첨가제는, 예를 들어 형성되는 오르가노이드를 구성하는 세포의 분화능을 유지하거나 또는 특정한 세포종으로의 분화를 유도하는 물질을 포함해도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 첨가제는, 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 간세포 성장 인자(HGF) 및 섬유아세포 증식 인자(FGF) 10으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나와, 뼈 형성 단백질(BMP) 저해제(예를 들어 노긴)와, TGFβ 저해제(예를 들어 SB431542)를 포함하는 조합 또는 이루어지는 조합이면 된다. AT2의 오르가노이드의 효율적인 형성의 관점에서, 상기 조합은, Wnt 시그널 활성화제(예를 들어 CHIR99021)를 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 조합은 Rock 저해제(예를 들어 Y-27632)를 더 포함해도 된다.
효율적인 오르가노이드 형성의 관점에서, 첨가제는, Wnt 시그널 활성화제(예를 들어 CHIR99021)와, BMP 저해제(예를 들어 노긴)와, TGFβ 저해제(예를 들어 SB431542)와, HGF를 포함하는 조합 또는 이루어지는 조합이다. 상기 조합은 Rock 저해제를 더 포함해도 된다.
보다 효율적인 오르가노이드 형성의 관점에서, 첨가제는, KGF 및 FGF10 중 어느 한쪽 또는 양쪽과, BMP 저해제(예를 들어 노긴)와, TGFβ 저해제(예를 들어 SB431542)와, HGF를 포함하는 조합 또는 이루어지는 조합이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 첨가제는, KGF와, FGF10과, BMP 저해제(예를 들어 노긴)와, TGFβ 저해제(예를 들어 SB431542)와, HGF를 포함하는 조합 또는 이루어지는 조합이다. AT2의 오르가노이드의 효율적인 형성의 관점에서, 상기 조합은, Wnt 시그널 활성화제(예를 들어 CHIR99021)를 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 조합은 Rock 저해제를 더 포함해도 된다.
더욱 효율적인 오르가노이드 형성의 관점에서, 첨가제는, KGF와, FGF10과, Wnt 시그널 활성화제(예를 들어 CHIR99021)와, BMP 저해제(예를 들어 노긴)와, TGFβ 저해제(예를 들어 SB431542)와, HGF와, FGF10을 포함하는 조합 또는 이루어지는 조합이다. 첨가제는, 예를 들어 KGF와, FGF10과, Wnt 시그널 활성화제(예를 들어 CHIR99021)와, BMP 저해제(예를 들어 노긴)와, TGFβ 저해제(예를 들어 SB431542)와, HGF와, FGF10과, Rock 저해제를 포함하는 조합 또는 이루어지는 조합이다.
본 명세서에 있어서의 용어 「케라티노사이트 성장 인자(KGF)」는, 피부 표면, 구강, 위 및 장관 등의 점막을 구성하는 상피 세포의 증식을 자극하는 물질을 의미한다. KGF는, 예를 들어 상업적으로 입수 가능하다. KGF는, 배양 배지 중에 존재하는 경우, 예를 들어 10 내지 250ng/mL, 20 내지 100ng/mL, 30 내지 70ng/mL, 바람직하게는 50ng/mL의 농도이다. KGF는 본 명세서에 있어서 「K」라고 약칭되는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서의 용어 「간세포 성장 인자(HGF)」는, 간세포의 가장 강력한 증식 인자로서 알려져 있는 사이토카인을 의미한다. HGF는, 일반적으로 분자량 약 6만의 중쇄와 약 3.5만의 경쇄가 디술피드 결합한 헤테로다이머의 구조를 갖는다. HGF는, 예를 들어 상업적으로 입수 가능하다. HGF는, 배양 배지 중에 존재하는 경우, 예를 들어 5 내지 150ng/mL, 10 내지 75ng/mL, 20 내지 40ng/mL, 바람직하게는 30ng/mL의 농도이다. HGF는 본 명세서에 있어서 「H」라고 약칭되는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서의 용어 「섬유아세포 성장 인자(FGF) 10」은, 상피 세포의 증식, 이동 및 분화를 자극함으로써, 손상을 받은 피부 또는 점막 조직의 수복을 촉진시키는 시그널 인자를 의미한다. FGF10은, 예를 들어 상업적으로 입수 가능하다. FGF10은, 배양 배지 중에 존재하는 경우, 예를 들어 10 내지 250ng/mL, 20 내지 100ng/mL, 30 내지 70ng/mL, 바람직하게는 50ng/mL의 농도이다. FGF10은 본 명세서에 있어서 「F10」이라고 약칭되는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서의 용어 「Wnt 시그널 활성화제」는, 세포내에서 T 세포 전사 인자(TCF/LEF)를 통한 전사를 활성화하는 물질을 의미한다. Wnt 시그널 활성화제는 Wnt 아고니스트라고도 칭해진다. Wnt 시그널 활성화제는, 예를 들어 세린과 트레오닌의 아미노산 잔기에의 인산 분자의 부가를 매개하는 세린·트레오닌 프로테인 키나아제인 GSK-3의 작용을 저해하는 물질(「GSK-3 저해제」라고도 함), Wnt 패밀리 단백질, 또는 β-카테닌 분해 저해제이면 되고, 또는 이들 2종 이상의 조합이면 된다. Wnt 시그널 활성화제는, 예를 들어 상업적으로 입수 가능하다.
Wnt 시그널 활성화제는, 예를 들어 GSK-3 저해제이면 된다. GSK-3 저해제는, 예를 들어 SB216763(Chemscene사), CHIR-98014(Abcam), TWS119(Cayman Chemical사), 또는 CHIR99021(SIGMA)이면 되고, 또는 이들 2종 이상의 조합이면 된다. Wnt 시그널 활성화제는, 예를 들어 Wnt 패밀리 단백질(「Wnt 리간드」라고도 칭해짐)이면 된다. Wnt 패밀리 단백질은, 예를 들어 당해 분야에서 공지된 19종류의 Wnt 유전자 유래의 단백질 중 어느 1종 또는 2종 이상의 조합이면 된다. Wnt 패밀리 단백질은, 예를 들어 Wnt1, 2, 3a, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 10a 또는 16이면 되고, 또는 이들 2종 이상의 조합이면 된다. Wnt 패밀리 단백질은, 예를 들어 Wnt1이면 된다. Wnt 시그널 활성화제는, 예를 들어 β-카테닌 분해 저해제이면 된다. β-카테닌 분해 저해제는, 예를 들어 β-카테닌의 인산화를 저해하는 물질(예를 들어 UBE1-41)이면 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, Wnt 시그널 활성화제는 GSK-3 저해제이다. GSK-3 저해제는, 바람직하게는 CHIR99021이다. Wnt 시그널 활성화제는, 배양 배지 중에 존재하는 경우, 예를 들어 0.5 내지 15μM, 1 내지 7μM, 2 내지 5μM, 바람직하게는 3μM의 CHIR99021이 나타내는 저해 작용에 상당하는 저해 작용을 나타내는 양이다. CHIR99021은 본 명세서에 있어서 「C」라고 약칭되는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서의 용어 「BMP 저해제」는, BMP 분자에 결합하여 복합체를 형성하는 물질을 의미한다. BMP 저해제는, 예를 들어 저분자 화합물, 단백질(예를 들어 항체), DNA, RNA, 저분자 간섭 RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이면 된다. BMP 저해제는, 예를 들어 상업적으로 입수 가능하다. BMP 저해제는, 예를 들어 노긴(Bmp 저해제(inhibitor)), 코딘 혹은 그 도메인을 포함하는 코딘 유사 단백질(R&D systems), 폴리스타틴 혹은 그 도메인을 포함하는 폴리스타틴 관련 단백질(R&D systems), DAN 혹은 DAN 시스테인-knot 도메인을 포함하는 DAN 유사 단백질(R&D systems), 스클레로스틴/SOST(R&D systems), 데코린(R&D systems), 또는 α-2매크로글로불린(R&D systems)이면 되고, 또는 이들 2종 이상의 조합이면 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, BMP 저해제는 노긴이다. BMP 저해제는, 배양 배지 중에 존재하는 경우, 예를 들어 20 내지 500ng/ml, 40 내지 250ng/ml, 80 내지 125ng/ml, 바람직하게는 100ng/ml의 노긴이 나타내는 저해 작용에 상당하는 저해 작용을 나타내는 양이다. 노긴은 본 명세서에 있어서 「N」이라고 약칭되는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서의 용어 「TGFβ 저해제」는, TGFβ 시그널 전달을 저해하는 물질을 의미한다. TGFβ 저해제는, 예를 들어 TGFβ가 결합하여 활성화한 타입 I 수용체(ALK5)의 세린·트레오닌 키나아제에 의한, Smad2/3 단백질의 인산화를 통한 세포내 시그널 전달을 저해하는 물질을 의미한다. TGF-β 저해제는, 예를 들어 저분자 화합물, 단백질(예를 들어 항체), DNA, RNA, 저분자 간섭 RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이면 된다. TGF-β 저해제는, A83-01(Abcam), SB-431542(Calbiochem), SB-505124(R&D systems), SB-525334(Chemscene LLC), LY364947(Sigma-Aldrich), SD-208(Sigma-Aldrich) 또는 SJN2511(R&D systems)이면 되고, 또는 이들 2종 이상의 조합이면 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, TGFβ 저해제는 SB431542이다. TGFβ 저해제는, 배양 배지 중에 존재하는 경우, 예를 들어 2 내지 50μM, 4 내지 25μM, 8 내지 12μM, 바람직하게는 10μM의 SB431542가 나타내는 저해 작용에 상당하는 저해 작용을 나타내는 양이다. SB431542는 본 명세서에 있어서 「S」라고 약칭되는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서의 용어 「상피 세포 성장 인자(EGF)」는, 세포 표면에 존재하는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하여, 세포의 성장 및 증식의 조절을 담당하는 단백질을 의미한다. EGF는, 일반적으로 53 아미노산 잔기 및 3개의 분자 내 디술피드 결합을 갖는 약 6,000달톤의 분자량을 갖는다. EGF는, 예를 들어 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어, Corning사). EGF는, 배양 배지 중에 존재하는 경우, 예를 들어 5 내지 125ng/ml, 10 내지 60ng/ml, 20 내지 30ng/ml, 바람직하게는 25ng/ml이다. EGF는 본 명세서에 있어서 「E」라고 약칭되는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서의 용어 「Rho-키나아제(ROCK) 저해제」는, 예를 들어 R-(+)-trans-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드2염산염1수화물(Y-27632, Sigma-Aldrich), 5-(1,4-디아제판-1-일술포닐)이소퀴놀린(파스딜 또는 HA1077, Cayman Chemical사), 또는 (S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐]-헥사히드로-1H-1,4-디아제핀2염산염(H-1152, Tocris Bioscience)이다. ROCK 저해제는, 예를 들어 상업적으로 입수 가능하다. 하나의 양태에 있어서, ROCK 저해제는 Y-27632이다. Rock 저해제는, 배양 배지 중에 존재하는 경우, 예를 들어 2 내지 50μM, 4 내지 25μM, 8 내지 12μM, 바람직하게는 10μM의 Y-27632가 나타내는 저해 작용에 상당하는 저해 작용을 나타내는 양이다. Y-27632는 본 명세서에 있어서 「Y」라고 약칭되는 경우가 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시에 관한 첨가제는, KGF, FGF10 및 HGF로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종과, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합이어도 된다. 상기 첨가제는, Wnt 시그널 활성화제 및 ROCK 저해제 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 더 포함해도 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 첨가제는, 예를 들어 KGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; KGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; FGF10과, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; FGF10과, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; HGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; HGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; KGF와, FGF10과, HGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; KGF와, FGF10과, HGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; ROCK 저해제와, KGF와, FGF10과, HGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; 또는 ROCK 저해제와, KGF와, FGF10과, HGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합이어도 된다. 상기한 첨가제에 있어서, 상기 BMP 저해제는 노긴이면 되고, 상기 TGFβ 저해제는 SB431542이면 되고, 상기 Wnt 시그널 활성화제는 CHIR99021이면 되고, 및/또는 상기 ROCK 저해제는 Y-27632이면 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 배양 배지는 「세포외 매트릭스」를 포함한다. 세포외 매트릭스(ECM)는 한정되는 것은 아니지만, 물, 다당, 엘라스틴, 인테그린 및 당단백질을 포함한다. 당단백질은, 예를 들어 콜라겐, 엔탁틴(나이도겐), 피브로넥틴 및 라미닌을 포함한다. ECM은, 예를 들어 시험관내에서 ECM 산생 세포(예를 들어, 상피 세포, 내피 세포, 벽내 배엽 유사 세포, 또는 섬유아세포)를 배양한 후에, 상기 ECM 세포를 제거함으로써 조제할 수 있다. ECM 산생 세포는, 예를 들어 주로 콜라겐 및 프로테오글리칸을 산생하는 연골 세포, 주로 IV형 콜라겐, 라미닌, 간질 프로콜라겐 및 피브로넥틴을 산생하는 섬유아세포, 그리고 주로 콜라겐(I형, III형 및 V형), 콘드로이틴황산 프로테오글리칸, 히알루론산, 피브로넥틴 및 테네이신-C를 산생하는 결장 근섬유아세포이면 된다. ECM은 상업적으로 입수 가능하다. 상업적으로 입수할 수 있는 세포외 매트릭스는, 예를 들어 세포외 매트릭스 단백질(Invitrogen), Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 마우스 육종 세포로부터의 기저막 조제물(예를 들어, Cultrex(등록 상표) 기저막 추출물(Basement Membrane Extract)(Trevigen, Inc.), 또는 Matrigel(등록 상표)(corning사))이면 된다. ECM은 합성 세포외 매트릭스(예를 들어, ProNectin(Sigma Z378666))이면 된다. 세포외 매트릭스는 1종이어도 되고, 또는 2종 이상의 혼합물이면 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, ECM은 Matrigel이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 배양 배지는 세포외 매트릭스를 포함하지 않는다.
세포외 매트릭스는, 배양 배지 중에 존재하는 경우, 「분산 성분」으로서 존재할 수 있다. 분산 성분으로서의 세포외 매트릭스는, 한정되는 것은 아니지만, 세포외 매트릭스 성분이 배양 배지 중에 분산 또는 용해되어 있는 상태이다. 분산 성분으로서의 세포외 매트릭스는, 예를 들어 배양 배지의 용적당 상기 세포외 매트릭스가 10％v/v 이하, 7％v/v 이하, 5％v/v 이하, 예를 들어 2.5％v/v의 분량으로 존재한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 배양 배지는, 0 내지 10％v/v, 0 내지 7％v/v, 0 내지 5％v/v, 0.1 내지 10％v/v, 0.1 내지 7％v/v, 0.1 내지 5％v/v, 1 내지 10％v/v, 1 내지 7％v/v, 1 내지 5％v/v, 1 내지 2.5％v/v, 2 내지 10％v/v, 2 내지 7％v/v, 2 내지 5％v/v, 또는 2 내지 2.5％v/v의 분량으로 세포외 매트릭스를 포함한다. 세포외 매트릭스가 생체 유래의 생성물(예를 들어, 마우스 육종 세포로부터의 기저막 조제물)을 포함하는 경우, 배양 배지 중의 세포외 매트릭스의 함유 농도는, 제조하는 오르가노이드의 오염 방지 또는 저감의 관점에서, 저농도인 것이 바람직하다.
세포외 매트릭스는, 배양 배지 중에 존재하는 경우, 「스캐폴드」로서 존재할 수 있다. 스캐폴드로서의 세포외 매트릭스는, 한정되는 것은 아니지만, 세포가 천연에 존재하는 세포 니치를 적어도 부분적으로 모방하는 미소 환경을 제공하는 형태이다. 스캐폴드로서의 세포외 매트릭스는, 예를 들어 겔의 형태이면 된다. 스캐폴드로서의 세포외 매트릭스는, 예를 들어 10％v/v 초과, 20％v/v 이상, 30％v/v 이상, 50％v/v 이상, 또는 70％v/v 이상의 농도로 형성된 겔이면 된다.
본 명세서에 있어서의 용어 「피더 세포」는, 줄기 세포의 증식을 보조하기 위해 사용되는 세포종을 의미한다. 피더 세포는, 일반적으로 목적으로 하는 세포와 공배양되어, 목적으로 하는 세포의 증식을 보조하기에 적합한 표면을 제공하기 위해 사용된다. 피더 세포는, 특정한 세포종(예를 들어, 프라이머리 성수 마우스 섬유아세포, 마우스 섬유아세포주(MLg), 인간 태아 섬유아세포주: MRC-5) 그 자체, 또는 미리 죽지 않을 정도로 항생 물질을 투여하는 것, 또는 감마선을 조사함으로써 조제된다. 피더 세포의 사용은, 목적으로 하는 세포의 계대 조작을 복잡하게 하기 때문에, 바람직하지 않다. 하나의 실시 형태에 있어서, 배양 배지는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는다. 본 명세서에 있어서의 용어 「실질적으로 포함하지 않는다」는, 「완전히 포함하지 않는다」를 배제하지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 실질적으로 피더 세포를 포함하지 않는 배양 배지는, 피더 세포를 완전히 포함하지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 실질적으로 피더 세포를 포함하지 않는 배양 배지는, 배양하는 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 배양 세포의 수에 대하여, 3％ 미만, 2％ 미만, 1％ 미만, 또는 0.5％ 미만의 피더 세포를 포함해도 된다. 바람직하게는, 배양하는 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 배양 배지는, 피더 세포를 포함하지 않는다.
폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료를 배양 배지 중에서 「배양」하기 위한 방법으로서는, 특허문헌 2에 개시되는 방법을 사용할 수 있다. 상기 배양은, 예를 들어 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료를, 배양 용기 중의 배양 배지에 첨가하여, 상기 배양 배지를 37℃에서 5％ CO2 하에서 유지하는 것을 포함해도 된다. 배양하는 온도는 37℃로 한정되는 것은 아니며, 세포 배양 분야에 있어서 공지된 온도를 적절히 사용할 수 있다. CO2 농도는 5％로 한정되는 것은 아니며, 세포 배양 분야에 있어서 공지된 CO2 농도를 적절히 사용할 수 있다. 상기 배양 배지는 임의의 간격으로, 예를 들어 1 내지 14일마다, 2 내지 12일마다, 또는 3 내지 10일마다 새로운 배양 배지로 교환할 수 있다. 배양 배지는, 예를 들어 배양하는 세포가 폐 상피 세포인 경우, 3 내지 7일마다, 3 내지 5일마다, 또는 3일마다 교환해도 된다. 배양 배지는, 예를 들어 배양하는 세포가 폐암 상피 줄기 세포인 경우, 3 내지 14일마다, 5 내지 10일마다, 또는 10일마다 교환해도 된다.
상기 배양에 의해 형성된 「폐 상피 세포 유래의 오르가노이드」 또는 「폐암 세포 유래의 오르가노이드」는, 배양 배지 중에서 단리해도 된다. 단리는, 예를 들어 그 사이즈에 기초하여 세포를 분취하여, 세포괴를 형성하지 않은 세포와, 오르가노이드를 나누는 것을 포함해도 된다. 단리는, 예를 들어 CELL HANDLER(Yamaha사)를 사용하여 행하는 것이 가능하다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 형태에 관한 방법은, 포유 동물의 폐 조직으로 조제된 폐 상피 세포를 포함하는 시료를 본 개시에 관한 첨가제를 포함하는 배양 배지 중에서 배양하기 전에, 클럽 세포-I, AT2 세포 및 클럽 세포-II 각각에 대하여 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종에 기초하여, 상기 시료로부터 클럽 세포-I, AT2 세포 또는 클럽 세포-II를 선택하는 것을 포함한다:
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하나의 실시 형태에 있어서, 상기 방법은, 클럽 세포-I에 대하여 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종에 기초하여, 상기 시료에서 클럽 세포-I를 선택하는 것을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 방법은, AT2 세포에 대하여 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종에 기초하여, 상기 시료로부터 AT2 세포를 선택하는 것을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 방법은, 클럽 세포-II에 대하여 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종에 기초하여, 상기 시료에서 클럽 세포-II를 선택하는 것을 포함한다.
본 명세서에 있어서 용어 「클럽 세포-I」는, 클럽 세포이며, 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종을 발현하는 세포를 의미한다. 클럽 세포-I는, 예를 들어 본 개시에 관한 첨가제를 포함하는 배양 배지 중에서 오르가노이드를 형성한다. 클럽 세포-I는, 예를 들어 Cbr2, Hp, Cyp2f2, Prdx6, Scgb1a1, Ldhb, Ces1d, Cckar, Selenbp1, Gstm2, Scnn1b, Scgb1c1, Plpp3, Ephx1, Dcxr, Alas1, Retnla, Sec14l3, Ptgr1 및 Krtap17-1 그리고 그들의 호몰로그로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종 또는 적어도 4종의 세포 마커를 발현한다.
본 명세서에 있어서 용어 「클럽 세포-II」는, 클럽 세포이며, 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종을 발현하는 세포를 의미한다. 클럽 세포-II는, 예를 들어 본 개시에 관한 첨가제를 포함하는 배양 배지 중에서 오르가노이드를 형성한다. 클럽 세포-II는, 예를 들어 클럽 세포-I에 비해, 오르가노이드를 형성하는 경향이 높다. 클럽 세포-II는, 예를 들어 Tff2, Reg3g, Bpifb1, Muc5b, Sult1d1, Fxyd3, Scgb3a1, Lypd2, Chad, S100a6, Pglyrp1, Aldh3a1, Bpifa1, Gsto1, Lgals3, Pigr, Scgb3a2, Ltf, Qsox1, Cyp2a5, Cpd, Ly6a, Perp, Kcne3, Il13ra1, Slc15a2 및 Cd14 그리고 그들의 호몰로그로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종 또는 적어도 4종의 세포 마커를 발현한다. 클럽 세포-II는, 예를 들어 Fxyd3, Pigr, Cpd, Ly6a, Perp, Kcne3, Il13ra1, Slc15a2 및 Cd14 그리고 그들의 호몰로그로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종 또는 적어도 4종의 세포 마커를 발현한다.
세포 마커에 기초하여 소정의 세포를 선택하는 실시 형태에 있어서의 용어 「AT2 세포」 또는 「2형 폐포 상피 세포」는, 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종을 발현하는 AT2 세포를 의미한다. 상기 AT2 세포는, 예를 들어 본 개시에 관한 첨가제를 포함하는 배양 배지 중에서 오르가노이드를 형성한다. 상기 AT2 세포는, 예를 들어 Lamp3, Lyz2, Napsa, Slc34a2, Lyz1, Rnase4, Hc, Cd74, Scd1, Sftpc, Lgi3, Cldn18, Etv5, Cxcl15, S100g, Elovl1, Fas, H2-Aa, Fabp5 및 Rn4.5s 그리고 그들의 호몰로그로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종 또는 적어도 4종의 세포 마커를 발현한다.
본 명세서에 있어서 소정의 세포를 「선택한다」는, 복수종의 세포를 포함하는 시료로부터, 소정의 세포를 선택하는 것을 의미한다. 소정의 세포를 선택하는 것은, 예를 들어 각종 세포를 포함하는 시료로부터, 소정의 세포 마커(예를 들어, 표 A에 기재된 세포 마커)의 발현을 측정하고, 그 측정 결과에 기초하여 상기 소정의 세포 마커를 발현하는 세포를 소정의 세포로서 분취함으로써 실시할 수 있다. 소정의 세포의 선택은, 예를 들어 형광 활성화 셀 소팅(FACS)에 의해 실시할 수 있다. FACS는, 예를 들어 소정의 세포 마커에 결합하는 프로브(예를 들어 항체)에 형광 물질을 콘쥬게이팅한 형광 프로브를 사용하여, 상업적으로 입수 가능한 FACS 장치에서 실시할 수 있다. 하나의 예에 있어서, 피검 세포에 있어서의 소정의 세포 마커의 발현 레벨이, 음성 대조에 있어서의 상기 소정의 세포 마커의 발현 레벨보다도 높은 경우에, 상기 피검 세포를 소정의 세포로서 선택할 수 있다. 형광 물질은, 예를 들어 공지된 방법에 따라서 조제 가능하거나, 또는 상업적으로 입수 가능하다. 소정의 세포 마커에 결합하는 프로브, 예를 들어 항체는 공지된 방법에 따라서 조제 가능하거나, 또는 상업적으로 입수 가능하다. 상기 프로브에의 형광 물질의 콘쥬게이션은, 예를 들어 공지된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 소정의 폐 상피 세포의 선택은, 표 A에 기재된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종의 발현에 기초하여 실시할 수 있다.
본 명세서에 있어서 용어 「호몰로그」는, 동종 또는 이종의 생물간에 있어서, 그 서열 및 기능이 유사한 유전자 또는 단백질을 의미한다. 본 명세서에 있어서 호몰로그는, 오르톨로그, 파랄로그 및 제놀로그를 포함한다. 특정한 유전자 또는 단백질의 「호몰로그」는, 예를 들어 상기 특정한 유전자 또는 단백질의 서열에 대하여, 적어도 75％, 80％, 85％ 또는 90％의 상동성을 갖고, 바람직하게는 적어도 95％, 96％, 97％, 98％ 혹은 99％의 상동성을 갖는다. 상동성은, 당업자에게 주지된 얼라인먼트 알고리즘을 사용하여 2개의 유전자 또는 단백질의 서열을 정렬시킨 후에, 이들 2개의 서열간에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 비율을 의미한다. 상동성은, 예를 들어 공지된 방법 또는 공적으로 입수 가능한 컴퓨터 프로그램(예를 들어, BLAST 또는 FASTA)을 사용하여 실행할 수 있다.
본 명세서에 있어서 용어 「Cbr2」는 카르보닐 리덕타아제 2를 가리키고, NADPH의 합성에 관여한다.
본 명세서에 있어서 용어 「Hp」는, 합토글로빈을 가리키고, 헤모글로빈 결합 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Cyp2f2」는, 시토크롬 P450(CYP)2f2를 가리키고, 소포체막에 국재하는 마우스 특이적인 막 결합 단백질이다. 마우스 이외의 포유 동물에 있어서의 Cyp2f2의 호몰로그는 공지이며, 예를 들어 그 인간 호몰로그는 CYO2F1이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Prdx6」은, 퍼옥시레독신-6을 가리키고, 항산화 효소의 퍼옥시레독신 패밀리에 속하는 단백질이다. 인간에서는 PDRX6 유전자로 코딩되어 있다.
본 명세서에 있어서 용어 「Scgb1a1」은, 세크레토글로불린 패밀리 1A 멤버 1을 가리키고, 항염증성 기능을 갖는다.
본 명세서에 있어서 용어 「Ldhb」는, 유산 데히드로게나아제 B를 가리키고, LDHB 유전자로 코딩되어 있는 LDH 효소의 모노머이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Ces1d」는, 카르복실에스테라아제 1d를 가리킨다.
본 명세서에 있어서 용어 「Cckar」는, 콜레시스토키닌 A 수용체를 가리키고, Cckar는, 펩티드 호르몬에 결합하는 G 단백질 공액형 수용체의 2개의 다른 서브타입 중 서브 타입 A이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Selenbp1」은, 셀레늄 결합 단백질 1을 가리키고, 셀레늄 결합 단백질 패밀리에 속하는 단백질이다. Selenbp1은 인간에서는 SELENBP1 유전자로 코딩되어 있다.
본 명세서에 있어서 용어 「Gstm2」는, 글루타티온S-트랜스퍼라아제 Mu2를 가리키고, 인간에서는 GSTM2 유전자로 코딩되어 있는 효소이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Scnn1b」는, 나트륨 채널 서브유닛 베타 1을 가리키고, 인간에서는 SCN1B 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Scgb1c1」은, 세크레토글로빈 1C1을 가리키고, 리간드 결합 단백질 RYD5로서도 알려져 있다. Scgb1c1은 세크레토글로빈 1C1 유전자로 코딩되어 있다.
본 명세서에 있어서 용어 「Plpp3」은, 인지질 포스파타아제 3을 가리키고, 포스파티딘산 포스파타아제 2B형으로서도 알려져 있다. Plpp3은 인간에서는 제1 염색체 상의 PPAP2B 유전자로 코딩되어 있는 효소이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Ephx1」은, 에폭시드 가수 분해 효소 1을 가리키고, 인간에서는 EPHX1 유전자로 코딩되어 있는 효소이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Dcxr」는, 디카르보닐L-크실룰로오스 리덕타아제를 가리키고, 각종 생리학적 시스템에 있어서의 각종 단백질 상호 작용 프로세스에 관여하는 다기능 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Alas1」은, 델타아미노레브린산 신타아제 1로서도 알려져 있는 단백질이며, 인간에서는 ALAS1 유전자로 코딩되어 있다.
본 명세서에 있어서 용어 「Retnla」는, 레지스틴 유사 분자 알파(Resistin-like molecule alpha)를 가리키고, 스몰·시스테인 리치·분비 단백질의 패밀리에 속하는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Sec14l3」은, SEC14-like3을 가리키고, 토코페롤 관련 단백질 2로서도 알려져 있는, 골지 유래의 수송 소포의 생합성에 중요한 역할을 하는 포스파티딜이노시톨 전이 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Ptgr1」은, 프로스타글란딘 리덕타아제-1을 가리키고, 에이코사노이드의 이화 작용 및 4-히드록시노네날 등의 지방질 과산화에 관여하는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Krtap17-1」은, 케라틴 관련 단백질 17-1을 가리키고, 케라틴 관련 단백질(KAP) 패밀리에 속하는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Tff2」는, 트레이닝 포일·팩터 2를 가리키고, 인간에서는 TFF2 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Reg3g」는, 리제너레이팅 아일렛-유래(Regenerating islet-derived) 프로테인 3감마를 가리키고, 인간에서는 REG3G 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Bpifb1」은, BPI 폴드 함유(Fold Containing) 패밀리 B 멤버 1을 가리키고, 인간에서는 BPIFB1 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Muc5b」는, 뮤신 5 서브타입 B를 가리키고, 인간에서는 MUC5B 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Sult1d1」은, 술포트랜스퍼라아제 1D 멤버 1을 가리키고, 호르몬, 뉴로트랜스미터에 황산기를 전이한다. 인간의 경우에는 변이에 의해 위유전자화되어 있는 것이 알려져 있다.
본 명세서에 있어서 용어 「Fxyd3」은, FXYD 도메인 함유 이온 수송 레귤레이터 3을 가리키고, 인간에서는 FXYD3 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Scgb3a1」은, 세크레토글로빈 패밀리 3A 멤버 1을 가리키고, 인간에서는 SCGB3A1 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Lypd2」는, Ly6/PLAUR 도메인 함유 프로테인 2를 가리키고, 인간에서는 LYPD1 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Chad」는, 카드헤린을 가리키고, 동물 세포간의 접착에 관여하는 막 관통형 당단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「S100a6」은, S100 칼슘 결합 단백질 A6을 가리키고, 인간에서는 S100A6 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Pglyrp1」은, 펩티드 글리칸 인식 단백질 1을 가리키고, 인간에서는 PGLYRP1 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Aldh3a1」은, 알데히드데히드로게나아제 3 패밀리·멤버 A1을 가리키고, 인간에서는 ALDH3A1 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Bpifa1」은, 구개, 폐 및 코 상피 클론 단백질(Palate, lung, and nasal epithelium clone protein)(PLUNC)이라고도 칭해지고, BPIFA1(살균/투과성 증가 폴드 함유 패밀리 A1(Bactericidal/permeability-increasing fold-containing family A1)) 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Gsto1」은, 글루타티온S-트랜스퍼라아제 오메가-1을 가리키고, 인간에서는 GSTO1 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Lgals3」은, 갈렉틴-3을 가리키고, 인간에서는 LGALS3 유전자로 코딩되어 있는, 렉틴 패밀리에 속하는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Pigr」은, 고분자 면역 글로불린 수용체를 가리키고, 인간에서는 PIGR 유전자로 코딩되어 있는 막 관통 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Scgb3a2」는, 세크레토글로빈 패밀리 3A 멤버 2를 가리키고, 인간에서는 SCGB3A2 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Ltf」는, 락토페린을 가리키고, 포유 동물에서는 주로 유즙에 존재하는 철 결합성의 당단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Qsox1」은, 술프히드릴옥시다아제 1을 가리키고, 인간에서는 QSOX1 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Cyp2a5」는, 시토크롬 P450(CYP)2A5를 가리키고, 마우스에서는 간장 및 비강의 후상피에서 발현하는 단백질이다. 마우스 이외의 포유 동물에 있어서의 Cyp2a5의 호몰로그 또는 오르톨로그는 공지이며, 예를 들어 그 인간 오르톨로그는 CYP2A6/13이며, 래트 오르톨로그는 CYP2A3이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Cpd」는, 카르복시펩티다아제 D를 가리키고, 인간에서는 CPD 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Ly6a」는, 림프구 항원 6 컴플렉스, 로쿠스 A를 가리키고, Sca-1라고도 칭해지는, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커형 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Perp」는, PMP-22에 관련되는 p53 아포토시스 이펙터를 가리키고, 인간에서는 PERP 유전자로 코딩되는 막 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Kcne3」은, 칼륨·볼티지·게이트 채널, Isk 관련 패밀리, 멤버 3을 가리키고, MinK 관련 펩티드 2(MiRP2)라고도 칭해진다. Kcne3은 인간에서는 KCNE3 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Il13ra1」은, 인터류킨 13 수용체 서브유닛 알파 1을 가리키고, 인터류킨 4 수용체 알파와 헤테로다이머를 구성함으로써, 인터류킨 13의 수용체로서 작용한다.
본 명세서에 있어서 용어 「Slc15a2」는, 솔루트·캐리어·패밀리 15, 멤버 2를 가리키고, 프로톤 결합 펩티드 트랜스포터로서 기능한다.
본 명세서에 있어서 용어 「Cd14」는, CD14 단백질을 가리키고, 자연 면역계의 구성 용도로서 기능한다. CD14는, 예를 들어 막 결합형 단백질인 mCD14이면 되고, 또는 가용성 단백질인 sCD14이면 된다. 클럽 세포-II 세포를 선택하는 문맥에 있어서, CD14는, 예를 들어 mCD14이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Lamp3」은, 리조솜 관련 막 당단백질 3을 가리키고, 인간에서는 LAMP3 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Lyz2」는, 리소자임 C-2를 가리킨다.
본 명세서에 있어서 용어 「Napsa」는, 납신 A를 가리키고, 인간에서는 NAPSA 유전자로 코딩되어 있는 아스파르트산 프로테이나아제이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Slc34a2」는, 나트륨 의존성 인산 수송 단백질 2B(NaPi2b)를 가리키고, 인간에서는 SLC34A2 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Lyz1」은, 리소자임 C-1을 가리킨다.
본 명세서에 있어서 용어 「Rnase4」는, 리보뉴클레아제 4를 가리키고, 인간에서는 RNASE4 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Hc」는, 용혈성 보체(Hemolytic complement)를 가리킨다. 자연 면역에 있어서의 보체 시스템의 구성 요소이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Cd74」는, HLA 클래스 II 조직적 합성 항원 감마쇄를 가리키고, 인간에서는 CD74 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Scd1」은, 스테아로일-CoA 데세츄라아제-1을 가리키고, 지방산 대사에 중요한 효소이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Sftpc」는, 서팩턴트 프로테인 C(SP-C)를 가리키고, 폐 서팩턴트 프로테인의 하나이다. Sftpc는 인간에서는 SFTPC 유전자로 코딩되어 있다.
본 명세서에 있어서 용어 「Lgi3」은, 류신 리치·글리오마·인액티베이티드 3을 가리키고, LGI 패밀리에 속하는 척추 동물에 있어서의 분비 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Cldn18」은, 클라우딘 18을 가리키고, 인간에서는 CLDN18 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Etv5」는, Ets 배리언트 5를 가리키고, ERM 전사 인자라고도 칭해진다. Etv5는 인간에서는 ETV5 유전자로 코딩되어 있는 전사 인자이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Cxcl15」는, 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 15를 가리키고, CXC 케모카인 패밀리에 속하는 사이토카인이다.
본 명세서에 있어서 용어 「S100g」는, S100 칼슘 결합 단백질 G를 가리키고, 인간에서는 S100G 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Elovl1」은, 지방산 신장 효소 1을 가리키고, 포화 및 1가 불포화 극장쇄 지방산의 산생에 있어서 중요한 역할을 하는 효소이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Fas」는, 지방산 신타아제를 가리키고, 인간에서는 FASN 유전자로 코딩되어 있는 효소이다.
본 명세서에 있어서 용어 「H2-Aa」는, 히스톤 H2A 타입 1-A를 가리키고, 인간에서는 HIST1H2AA 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Fabp5」는, 표피형 지방산 결합 단백질을 가리키고, 인간에서는 FABP5 유전자로 코딩되어 있는 단백질이다.
본 명세서에 있어서 용어 「Rn4.5s」는 4.5S RNA를 가리킨다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 형태에 관한 방법은, 본 개시에 관한 첨가제를 포함하는 배양 배지 중에서 배양한 폐 상피 세포를, 상기 첨가제를 포함하지 않은 배양 배지에서 더 배양하는 것을 포함한다. 이 실시 형태에 있어서, 배양 배지 중에서 배양한 상기 폐 상피 세포는, 오르가노이드를 형성하고 있어도 되고, 또는 직경이 50㎛ 미만인 세포 집합체이면 된다. 배양 배지 중에서 배양한 염기 폐 상피 세포는, 바람직하게는 오르가노이드를 형성하고 있다. 본 개시에 관한 첨가제를 포함하는 배양 배지 중에서 배양한 폐 상피 세포를, 상기 첨가제를 포함하지 않는 배양 배지에서 더 배양함으로써, 배양된 폐 상피 세포의 분화, 예를 들어 클럽 세포로부터 폐포 세포(예를 들어 AT2 세포, AT1 세포)로의 분화가 유도될 수 있다.
본 개시에 관한 첨가제를 포함하지 않는 배양 배지는, 예를 들어 기본 배지이면 된다. 상기 첨가제를 포함하는 배양 배지에서의 상기 세포의 배양은, 예를 들어 배양한 세포를 계대한 것을 포함해도 된다. 상기 첨가제를 포함하지 않는 배양 배지에서의 상기 세포의 배양은, 예를 들어 배양한 세포를 계대한 것을 포함해도 된다. 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 일수는 특별히 한정되지 않는다. 배양 배지에서의 상기 세포의 배양은, 예를 들어 1 내지 30일, 1 내지 25일, 또는 1 내지 20일이어도 된다.
폐 상피 세포 유래의 오르가노이드는, 예를 들어 폐 상피 조직의 기본적인 생리 기능을 모방할 수 있다. 이 때문에, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드는, 재생 의료에 있어서 유용하다. 또한, 폐암 세포 유래의 오르가노이드는, 폐암을 처치하기 위한 물질의 스크리닝에 유용하다(NATURE COMMUNICATIONS 2019 103991).
[폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드]
본 개시의 하나의 양태는, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드를 제공한다. 상기 오르가노이드는, 본 개시에 관한 오르가노이드의 제조 방법에 따라서, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료로부터 제조할 수 있다. 제조된 폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드는, 예를 들어 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함한다.
하나의 실시 형태에 있어서, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드는, 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함한다. 상기 오르가노이드는, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드이면 되고, 또는 기도 세포 유래의 오르가노이드이면 된다. 하나의 예에 있어서, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드는, 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함하고, 상기 세포층은 AT2 세포로 본질적으로 이루어진다. 상기 예에 있어서, AT2 세포는, 예를 들어 HT2-280 및 SFTPC 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 발현하고, 및 상기 HT2-280이 상기 AT2 세포에 있어서 상기 내강에 면하는 세포막에 혹은 그 근방에 국재되어 있다.
다른 예에 있어서, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드는, 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함하고, 상기 세포층은, AT2 세포와, AT2 세포 마커 및 기관지 상피 마커를 발현하는 세포의 조합으로 본질적으로 이루어진다. 다른 예에 있어서, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드는, 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함하고, 상기 세포층은, 기관지 상피 마커를 발현하는 세포로 본질적으로 이루어진다. 하나의 예에 있어서, 기도 세포 유래의 오르가노이드는, 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함하고, 상기 세포층은, 기저 세포와, 기저 세포 마커 및 기관지 상피 마커를 발현하는 세포의 조합으로 본질적으로 이루어진다.
상기 AT2 세포 마커는 특별히 한정되지 않고, 공지된 AT2 세포 마커를 사용할 수 있다. AT2 세포 마커는, 예를 들어 HT2-280 및 SFTPC 중 어느 한쪽 또는 양쪽이면 된다. 상기 기관지 상피 마커는 특별히 한정되지 않고, 공지된 기관지 상피 마커를 사용할 수 있다. 기관지 상피 마커는, 예를 들어 SOX2이면 된다. 상기 기저 세포 마커는 특별히 한정되지 않고, 공지된 상기 기저 세포 마커를 사용할 수 있다. 기저 세포 마커는, 예를 들어 KRT5이면 된다.
본 명세서에 있어서의 용어 「HT2-280」은, 2형 폐포 상피 세포에 발현되는 280 내지 300kDa의 단백질이다. 본 명세서에 있어서의 용어 「SFTPC」는, 폐 서팩턴트 단백질 C를 의미한다. SFTPC는, 26개의 아미노산을 포함하는 소수성의 α헬릭스 구조에 9개의 친수성 아미노산이 연결된 구조를 갖는다. 본 명세서에 있어서의 용어 「SOX2」는, SRY-박스 함유 유전자(box containing gene) 2를 의미한다. SOX2는, DNA 결합 부위인 HMG(고이동성 군(high mobility group)) 도메인과 그 C 말단측의 전사 활성화 도메인으로 구성된다. HMG 도메인은 2개의 핵 이행 시그널 서열을 포함하기 때문에, SOX2는 주로 핵 내에 국재한다. 본 명세서에 있어서의 용어 「KRT5」는, 중간경 필라멘트 단백질이며, 인간에서는 KRT5 유전자에 의해 코딩된다.
[재생 의료용 조성물]
본 개시의 하나의 양태는, 재생 의료용 조성물을 제공한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 재생 의료용 조성물은, 본 개시에 관한 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드, 및/또는 상기 오르가노이드의 세포를 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 재생 의료용 조성물은, 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종을 발현하는 클럽 세포-I, AT2 세포 또는 클럽 세포-II로 본질적으로 이루어지는 폐 상피 세포를 포함한다:
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재생 의료용 조성물은, 예를 들어 폐 손상 또는 폐 질환을 수복하기 위한 의약 조성물이면 된다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기한 적어도 1종의 세포 마커를 발현하는 클럽 세포-I, AT2 세포 또는 클럽 세포-II로 본질적으로 이루어지는 폐 상피 세포를 포함하는 재생 의료용 조성물은, 본 개시에 관한 첨가제를 포함한다. 하나의 예에 있어서, 클럽 세포-I를 포함하거나 또는 로 본질적으로 이루어지는 폐 상피 세포를 포함하는 재생 의료용 조성물은, 상기 클럽 세포-I이 송달된 폐에서 염증 등의 악영향을 야기하지 않고, 오르가노이드를 형성하는 능력을 갖고, 그리고 폐포 및 기관지 계통의 세포로 분화되는 능력을 가질 수 있기 때문에, 폐 손상 또는 폐 질환을 수복하기 위한 재생 의료용 조성물로서 유용하다. 하나의 예에 있어서, 클럽 세포-II를 포함하거나 또는 로 본질적으로 이루어지는 폐 상피 세포를 포함하는 재생 의료용 조성물은, 상기 클럽 세포-II가 송달된 폐에서 효율적으로 오르가노이드를 형성하는 능력을 갖고, 그리고 폐포 및 기관지 계통의 세포로 분화되는 능력을 갖기 때문에, 폐 손상 또는 폐 질환을 수복하기 위한 재생 의료용 조성물로서 유용하다.
하나의 예에 있어서, 클럽 세포-II를 포함하거나 또는 로 본질적으로 이루어지는 폐 상피 세포를 포함하는 재생 의료용 조성물은, 클럽 세포-II를 손상시킨 폐 또는 질환으로 이환된 폐를 처치하기 위한 약제(예를 들어, 유기 화합물, 유전자 또는 단백질)를 운반하기 위한 캐리어로서 사용함으로써, 폐 손상 또는 폐 질환을 처치하기 위한 의약 조성물로서 유용하다. 따라서, 본 발명에 관한 하나의 양태는, 클럽 세포-II에 대하여 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종에 기초하여, 포유 동물의 폐 조직으로 조제된 폐 상피 세포를 포함하는 시료에서 선택된 클럽 세포-II로 본질적으로 이루어지는 폐 상피 세포, 및 폐 손상 혹은 폐 질환을 처치하기 위한 약제를 포함하는, 의약 조성물을 제공한다.
재생 의료용 조성물은, 예를 들어 의약상 허용되는 담체를 적절히 포함해도 된다. 재생 의료용 조성물은 공지된 방법에 따라서 적절히 제조할 수 있다. 재생 의료용 조성물은, 예를 들어 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드 및/또는 상기 오르가노이드의 세포와, 의약상 허용되는 담체를 혼합함으로써 제조할 수 있다. 「의약상 허용되는 담체」는, 포유 동물에 있어서 안전성이 높고, 알레르기 반응성이 작은, 본 개시에 관한 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드 이외의 임의의 성분을 의미한다. 의약상 허용되는 담체는, 예를 들어 의약 투여에 적합한 수성 혹은 비수성 용매, 용액(예를 들어 생리 식염수, 기본 배지 또는 세포 현탁 보존액), 동결 방지제(예를 들어 글리세롤), 수용성 고분자(예를 들어 덱스트란), 또는 완충제(예를 들어 인산 완충액)를 포함한다.
상기 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드는 본 개시의 제조 방법을 따라서 조제할 수 있다. 상기 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드는, 예를 들어 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함한다. 「폐 상피 세포 유래의 오르가노이드 세포」는, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드를 구성하는 세포괴의 형태이면 되고, 및/또는 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드로부터 분리된 개개의 세포 형태이면 된다. 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드로부터 분리된 개개의 상태의 세포는, 예를 들어 상기 오르가노이드를, 프로테아제(예를 들어, 콜라게나아제, 디스파아제, 엘라스타아제 또는 트립신)로 처리한 후, 소정의 용액(예를 들어, 기본 배지)에 현탁시킴으로써 조제할 수 있다. 재생 의료용 조성물이, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드의 세포괴 형태의 세포를 포함하는 경우, 상기 재생 의료용 조성물 중의 세포괴는, 예를 들어 그 필요가 있는 포유 동물에의 투여 전에, 개개의 상태의 세포로 하기 위해 처리되어도 된다.
재생 의료용 조성물은, 예를 들어 외과적 방법에 의해 소정의 부위에 이식함으로써, 또는 주사에 의해 소정의 부위에 주입함으로써, 그 필요가 있는 포유 동물에 투여된다. 재생 의료용 조성물이 투여되는 포유 동물과, 당해 오르가노이드의 폐 상피 세포를 제공한 포유 동물은, 이식편 거절 반응의 경감의 관점에서, 동일종인 것이 바람직하고, 동일 개체인 것이 더욱 바람직하다. 재생 의료용 조성물의 문맥에 있어서, 포유 동물은, 예를 들어 인간이다.
본 명세서에 있어서의 용어 「폐 손상」 또는 「폐 질환」은, 예를 들어 병원성 질환, 폐암(예를 들어 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암(예를 들어, 선암, 편평 세포암 혹은 대세포암)), 간질성 폐 질환, 폐렴(예를 들어 기질화 폐렴), 결핵, 낭포 섬유증, 기관지염, 폐섬유증, 유육종증, II형 과형성, 만성 폐색성 폐 질환, 기종, 천식, 폐부종, 급성 호흡 촉박 증후군, 천명, 기관지 확장증, 한타 바이러스 폐 증후군, 중동 호흡기 증후군(MERS), 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 및 진폐를 들 수 있다. 병원성 질환은, 예를 들어 아데노 바이러스, 코로나 바이러스(예를 들어, COVID-19, SARS-CoV, SARS-CoV-2 또는 MERS-CoV, 혹은 그들의 변이주), 사람 메타뉴모 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 라이노 바이러스, 한타 바이러스, 엔테로 바이러스(예를 들어, 엔테로 바이러스 D68: EV-D68), 백일해균, 클라미도필라·뉴모니아에, 디프테리아균, 콕시엘라·브루네티, 인플루엔자균, 레지오넬라·뉴모필라, 모락셀라·카타랄리스, 결핵균, 폐렴 마이코플라스마, 황색 포도 구균, 폐렴 연쇄 구균 또는 화농성 연쇄 구균에 의해 야기되는 질환이면 된다.
[폐암을 처치하기 위한 물질의 스크리닝 방법]
본 개시의 하나의 양태는, 폐암을 처치하기 위한 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 스크리닝 방법은, 본 개시에 의해 제조된 폐암 세포 유래의 오르가노이드와 피험 물질을 접촉시키는 것, 상기 피험 물질과의 접촉 후의 오르가노이드를 측정하는 것, 및 상기 피험 물질과의 접촉 후의 오르가노이드의 측정값과 대조값을 비교하는 것을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 상기 방법은, 비교의 결과에 기초하여, 상기 피험 물질이, 폐암을 처치할 수 있는 물질인지를 판정하는 것을 포함한다.
본 명세서에 있어서의 용어 「폐암」은, 한정되는 것은 아니지만, 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암(예를 들어, 선암, 편평 세포암 혹은 대세포암)이면 된다.
본 명세서에 있어서의 용어 「피험 물질」은, 예를 들어 저분자 화합물, 단백질(예를 들어 항체), DNA, RNA, 저분자 간섭 RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이면 된다. 피험 물질은, 예를 들어 폐암 이외의 질환 또는 암을 치료하기 위한 약제이면 된다. 피험 물질은, 예를 들어 1종이어도 되고, 또는 2종 이상의 혼합물이어도 된다. 피험 물질은, 바람직하게는 1종류의 물질이다.
본 개시에 관한 폐암 세포 유래의 오르가노이드와 피험 물질을 「접촉시킨다」는 것은, 상기 오르가노이드와, 피험 물질을 접촉 가능한 상황 하에 두는 것을 의미한다. 상기 오르가노이드와 피험 물질의 접촉은, 예를 들어 상기 오르가노이드를 포함하는 용액 중에, 피험 물질을 첨가하는 것이면 된다.
본 명세서에 있어서의 용어 「오르가노이드를 측정한다」는, 예를 들어 오르가노이드의 사이즈를 측정하는 것, 또는 오르가노이드를 구성하는 세포의 마커 단백질의 발현을 측정하는 것이면 된다. 오르가노이드의 사이즈는, 예를 들어 공지된 장치(예를 들어 현미경 또는 FACS)를 사용하여 측정할 수 있다. 오르가노이드를 구성하는 세포의 마커 단백질의 발현은, 공지된 장치(예를 들어 현미경 또는 FACS) 및 공지된 시약(예를 들어 형광 물질로 표지화된 항체)을 사용하여 측정할 수 있다. 오르가노이드의 사이즈는, 예를 들어 오르가노이드 주위의 길이, 직경(예를 들어 긴 직경 및 짧은 직경) 또는 면적이면 된다. 오르가노이드를 구성하는 세포의 마커 단백질의 발현은, 예를 들어 오르가노이드의 면적당의, 마커 단백질의 발현량에 대응하는 형광 강도이면 된다. 측정하는 마커 단백질은 1종이어도 되고, 또는 2종 이상의 조합이어도 된다. 측정하는 마커 단백질은, 바람직하게는 2종 이상의 조합이다.
본 명세서에 있어서의 용어 「오르가노이드의 측정값」은, 예를 들어 1회 측정의 하나의 측정값이어도 되고, 복수회 측정의 평균값이어도 되고, 복수의 오르가노이드의 측정값의 평균값이면 된다. 오르가노이드의 측정값은, 예를 들어 피험 물질을 접촉시키는 전후의 변화의 값(예를 들어 차분 또는 배수)이어도 된다.
본 명세서에 있어서의 용어 「대조값」은, 예를 들어 폐암 세포를 처치용의 약제를 대조 물질로서 사용한 경우의 측정값이면 된다. 대조값은, 예를 들어 피험 물질을 접촉시킨 후의 값을 오르가노이드의 측정값으로 하는 경우, 상기 피험 물질을 접촉시키기 전 또는 상기 피험 물질을 접촉시키지 않은 대조 오르가노이드의 측정값을 대조값으로 해도 된다.
피험 물질이, 폐암을 처치할 수 있는 물질인지의 「판정」은, 예를 들어 측정값이 오르가노이드의 사이즈인 경우, 대조값보다도, 피험 물질을 접촉시킨 오르가노이드의 사이즈의 측정값이 작은 경우(즉, 오르가노이드 사이즈의 증가의 정도가 저하, 또는 사이즈가 축소된 경우), 상기 피험 물질을, 폐암을 처치할 수 있는 물질로 판정하는 것을 포함해도 된다.
[배양 배지]
본 개시의 하나의 양태는, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터 오르가노이드를 제조하기 위한 배양 배지를 제공한다. 상기 배양 배지는 0 내지 10％v/v의 세포외 매트릭스를 포함하고, 및 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 증식 인자(FGF) 10 및 간세포 성장 인자(HGF)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종과, 뼈 형성 단백질(BMP) 저해제와, TGFβ 저해제의 조합을 포함한다.
상기 배양 배지는, 예를 들어 각 성분이 원하는 농도가 되도록 배합된 액체의 형태이면 된다. 상기 배양 배지는, 예를 들어 소정량의 순수를 혼합함으로써, 각 성분이 원하는 농도가 되도록 배합된 고체의 형태이면 된다.
본 개시에 의해 제공되는 용어 및 실시 형태의 설명은, 특별히 언급이 없는 한, 본 개시에 의해 제공하는 양태 및 실시 형태 사이에 적절히 적용된다.
이하, 구체적인 실시예를 기재하지만, 그들은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내는 것이며, 첨부하는 특허 청구 범위에 기재된 발명을 어떻게 한정하는 것은 아니다.
실시예
[조제예 1]
(폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액의 조제)
인간 폐 서팩턴트 단백질 C(SFTPC) 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 유전자를 갖고, Sftpc의 발현에 따라서 GFP를 발현하는 SFTPC-GFP 마우스(J Immunol 2008; 180: 881-888 및 Rapid Communications: L349-L356)를 준비하였다. SFTPC-GFP 마우스의 폐 말초 영역의 조직 절편에 있어서, Sftpc 및 Scgb1a1(별명 CC10 또는 CCSP)에 대한 면역 염색을 행하였다.
Scgb1a1은, 클럽 세포의 세포 마커로서 알려져 있다. 상기 면역 염색은, 폐포 영역에 Sftpc와 GFP를 발현하는 AT2 세포가 존재하는 것, 그리고 기관지의 말초에 Sftpc와 GFP와 Scgb1a1을 발현하는 기관지 폐포 상피 줄기 세포(BASCs) 및 Sftpc와 GFP를 약하게 발현하고, 또한 Scgb1a1을 발현하는 클럽 세포(별명 배리언트 클럽 세포(variant club cell))가 존재하는 것을 나타냈다. 폐 말초 영역에 있어서의 GFP의 발현 패턴은, STEM CELLS 2012;30: 1948-1960에 있어서 보고된 발현 패턴과 마찬가지였다. 이 면역 염색의 결과는, 그 발현이 SFTPC 프로모터의 제어 하에 있는 GFP를 지표로 함으로써, SFTPC-GFP 마우스의 폐 조직에 포함되는 각종 세포 중에서 폐 상피 줄기 세포인 AT2 세포, BASCs 및 클럽 세포를 식별할 수 있는 것을 시사한다.
이산화탄소에 의해 SFTPC-GFP 마우스를 안락사시켜, 혈액을 제거하였다. 흉골을 제거하고, 폐 및 기관을 노출시켰다. 기관으로부터 서플로우를 삽입하고, 그것을 통하여 상기 폐 및 기관에 1.5mL의 프로테아제 용액을 주입하였다. 폐를 SFTPC-GFP 마우스로부터 잘라내고, 2.5mL의 프로테아제 용액을 주입한 샤알레에 옮겼다. 잘라낸 폐를 상기 샤알레 중에서 조각을 내고, 피펫팅 조작에 의해 폐 조직 현탁액을 얻었다. 상기 폐 조직 현탁액을 4℃의 원심 분리(400g×5분)에 걸어, 침전물과 상청으로 분리시키고, 상기 상청을 파기하였다. 상기 침전물에, 3％ FBS를 함유하는 PBS를 첨가하여 현탁시키고, 폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액을 얻었다.
상기 폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액에, 형광 물질로 표지화한 항EpCAM 항체를 첨가하였다. EpCAM(상피 세포 접착 분자(Epithelial cell adhesion molecule))는, 상피 세포에 특이적인 세포간 세포 접착 분자로서 알려져 있는 I형 막 관통 당단백질이다. FACS Aria II(BD사)를 사용하고, 항EpCAM 항체에서 유래하는 형광 강도에 기초하여, 폐 상피 줄기 세포를 특정하였다. 또한, GFP 유래의 형광 강도에 기초하여, 특정된 폐 상피 줄기 세포를 3개의 분획(P17, P18, P19)으로 나누었다(도 1).
[시험예 1]
마커 유전자의 발현 패턴을 조사함으로써, 각 분획에 포함되는 세포종을 특정하였다. 마커 유전자의 발현 패턴은, qPCR에 의해 각 마커 유전자를 증폭시켜 조사하였다. 그 결과, P17 분획은 클럽 세포, 섬모 세포, AT1 세포(Type I 폐포 상피 세포) 및 기저 세포를 주로 포함하는 것이 나타내졌다. 마찬가지로, P18 분획은 배리언트·클럽(말단 클럽(distal club)) 세포를, P19 분획은 AT2 세포 및 BASCs를 포함하는 것이 나타내졌다.
(기본 배지)
도 1 중의 P19 분획의 폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액, P18 분획의 폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액, 및 P17 분획의 폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액을, 피더(Feeder) 세포를 사용하지 않고 배양하고, 오르가노이드를 형성시켰다. 배양에는, MTEC/B27을 기본 배지로서 사용하였다. MTEC/B27의 성분을 이하에 나타낸다.
Figure pct00005
(첨가제)
상기 기본 배지에 이하의 첨가제를 적절히 조합하여, 배양 배지로 하였다.
Figure pct00006
(폐 상피 줄기 세포의 오르가노이드 형성)
폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액을, 원심 분리(400g, 10분, 4℃)에 걸어, 침전물을 MTEC/B27에 현탁시켰다. 소정수의 폐 상피 줄기 세포를, 50％ 또는 75％의 Matrigel(등록 상표)(Matrigel Matrix basement membrane growth factor reduced(Corning사))과 혼합하였다. 얻어진 혼합액 20μL를, 37℃로 가온한 48well plate의 각 웰에 적하하고, 상기 플레이트를 37℃에서 20분간 유지하여, 각 웰에 겔을 형성시켰다. Hgf와, Fgf10과, KGF와, 노긴과, SB431542의 조합을 상기 기본 배지에 첨가한 배양 배지 250μL를, 형성한 겔 위에 적용하고, 상기 플레이트를 37℃, 5％ CO2 하에서 6일간 배양을 행하였다. 배양 배지는 3일에 한번 교환하였다.
P17 분획 내지 P19 분획의 폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액을 각각 상기와 같이 배양한 결과, 현미경 하에서 직경 50㎛ 이상의 세포괴가 관찰되었다. 배양물에 대하여 면역 조직 염색을 행하였다. 면역 조직 염색은, P19 분획에 있어서 관찰된 세포괴가, AT2 세포를 주로 하는 Sftpc를 발현하는 오르가노이드인 것을 나타냈다. P18 분획에 있어서 관찰된 세포괴는, 배리언트·클럽 세포와 같이 Sftpc와 Scgb1a1을 발현하는 세포를 주로 하는 오르가노이드인 것이 나타내졌다. P17 분획에 있어서 관찰된 세포괴는, 클럽 세포에서 유래한다고 생각되는 Scgb1a1을 강하게 발현하는 오르가노이드와 기저 세포에서 유래한다고 생각되는 Krt5를 발현하는 오르가노이드가 각각 형성되는 것이 나타내졌다.
[시험예 2]
조제예 1에서 기재한 바와 같이, 6마리의 SFTPC-GFP 마우스로부터, 폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액을 각각 조제하였다(n=6). 도 1에서 나타내지는 GFP 형광 강도에 기초한, 폐 상피 줄기 세포의 산포도에 있어서, P19 분획에 상당하는 분획을, 이하, GFPhi 분획이라고 칭한다. 마찬가지로, P19 분획에 대응하는 GFP 강도보다도 낮은 GFP 형광 강도에 대응하는 P18 분획에 상당하는 분획을, GFPlo 분획이라고 칭하고, P18 분획에 대응하는 GFP 강도보다도 낮은 GFP 형광 강도에 대응하는 P17 분획에 상당하는 분획을, GFPneg 분획이라고 칭한다.
(GFPhi 분획)
GFPhi 분획의 폐 상피 줄기 세포의 현탁액을 시험예 1과 마찬가지로 배양하였다. 단, 시험예 2에서는, 시험예 1과는 달리, 배양 배지에는 이하의 첨가제의 조합을 첨가하고, 1개의 폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액을 4웰에서, 1웰당 5,000 세포가 되도록 하여 배양하였다.
Figure pct00007
+: 첨가제로서 사용하였다
-: 첨가제로서 사용하지 않았다
6일간의 배양 후, 현미경을 사용하여 배양물을 촬상하고, 소프트웨어를 사용하여 직경 50㎛ 이상의 세포괴를 계수하였다. 각 웰 중의 세포괴의 수를, 첨가한 세포수로 제산하여 얻어진 비율인 CFE[％]를, 오르가노이드 형성의 효율의 지표로서 사용하였다. CFE(n=6)의 평균값 및 그 표준 편차는, 6마리의 마우스에서 얻어진 CFE로부터 산출하였다(도 2). 또한, 긴 직경 [㎛](n=6)의 평균 및 그 표준 편차는, 6마리의 마우스에서 얻어진 오르가노이드의 긴 직경으로부터 산출하였다(도 3).
·4종의 첨가제의 조합
도 2 및 도 3은, 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」가, 약 0.18％의 CFE, 및 약 136㎛의 긴 직경이었던 것을 각각 나타낸다. KCNS에 있어서의 첨가제 K를 H로 치환한 첨가제의 조합 「HCNS」를 사용한 경우의 CFE 및 긴 직경은, KCNS를 사용한 경우의 CFE 및 긴 직경과 각각 동등하였다. 이 결과는, 4종의 첨가제의 조합 KCNS에 있어서, 첨가제 「K」와 「H」가, 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 대체 가능한 것을 나타낸다.
「KCNS」에 있어서의 첨가제 K를 F10으로 치환한 첨가제의 조합 「F10CNS」의 CFE 및 긴 직경은, 「KCNS」의 CFE 및 긴 직경과 각각 동등하였다. 이 결과는, 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」에 있어서, 첨가제 「K」와 「F10」이, 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 대체 가능한 것을 나타낸다. 「KCNS」에 있어서의 첨가제 「K」를 「E」로 치환한 첨가제의 조합 「ECNS」의 CFE는, 「KCNS」의 CFE보다도 유의하게 작았다(Tukey 검정, *: P<0.05).
·3종의 첨가제의 조합
4종의 첨가제의 조합 「KCNS」에 있어서, 첨가제 「H」 또는 「F10」과 대체 가능한 첨가제 「K」를 제외한 3종의 첨가제의 효율적인 오르가노이드 형성(높은 CFE) 및 긴 직경에 있어서의 중요성을 검토한다. 「KCNS」로부터 첨가제 「N」을 제외한 첨가제의 조합 「KCS」의 CFE 및 긴 직경은, 「KCNS」의 CFE 및 긴 직경보다도 각각 유의하게 작았다(Tukey 검정, *: P<0.05). 「KCNS」로부터 첨가제 「S」를 제외한 첨가제의 조합 「KCN」의 CFE는, 「KCNS」의 CFE보다도 우위차는 없었지만 낮은 경향이 있었다. 이들 결과는, 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」에 있어서, 첨가제 「N」 및 「S」가 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 중요한 것을 나타낸다.
「KCNS」로부터 첨가제 「C」를 제외한 첨가제의 조합 「KNS」의 CFE는, 「KCNS」의 CFE 및 긴 직경과 유의차가 없었다. 이 결과는, 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」에 있어서, 첨가제 「C」는 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 중요하지 않은 것을 나타낸다. 그러나, 시험예 3에서 설명한 바와 같이, 첨가제 「C」는, 세포괴를 구성하는 폐 상피 줄기 세포의 분화 전환을 야기하는 것이 시사된다.
·6종의 첨가제의 조합
도 2 및 도 3은, 6종의 첨가제의 조합 「KF10HCNS」가 약 0.87％의 CFE, 및 약 113㎛의 긴 직경이었던 것을 각각 나타낸다. 「KF10HCNS」의 CFE는, 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」 및 「F10CNS」보다도 유의하게 컸다(Tukey 검정, *: P<0.05). 「KF10HCNS」를 사용한 경우의 긴 직경은, 4종의 첨가제의 조합 중에서, 가장 큰 긴 직경을 나타낸 「KCNS」와 동등하였다. 이 결과는, 6종의 첨가제의 조합 「KF10HCNS」가, 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 바람직한 것을 나타낸다.
·5종의 첨가제의 조합
6종의 첨가제의 조합 「KF10HCNS」에 있어서의 첨가제 「C」는, 상술한 바와 같이, 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 중요하지 않은 것이 나타내졌다. 따라서, 「KF10HCNS」에 있어서 첨가제 「C」를 제외한 5종의 첨가제의 조합 「HF10KNS」가, 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 바람직한 것이 시사된다.
(GFPlo 분획)
상기한 GFPhi 분획의 폐 상피 줄기 세포의 현탁액과 마찬가지로, GFPlo 분획의 폐 상피 줄기 세포의 현탁액에 대해서도, 시험예 1과 마찬가지로 배양하여, CFE[％]를 산출하였다. 단, GFPhi 분획과는 달리, 1웰당 150 세포가 되도록 하여 배양하였다. CFE(n=6)의 평균값 및 표준 편차를 산출하였다(도 4). 또한 오르가노이드의 긴 직경(n=6)의 평균값 및 표준 편차를 산출하였다(도 5)
·4종의 첨가제의 조합
도 4 및 도 5는, 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」가 약 8.0％의 CFE, 약 127㎛의 긴 직경이었던 것을 각각 나타낸다. 「KCNS」에 있어서의 첨가제 「K」를, 「H」 또는 「F10」으로 치환한 첨가제의 조합 「HCNS」 또는 「F10CNS」의 CFE 및 긴 직경은, 「KCNS」의 CFE와 유의차는 없었다. 이 결과는, 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」에 있어서, 첨가제 「K」와 「H」 또는 「F10」이, 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 대체 가능한 것을 나타낸다. 「KCNS」에 있어서의 첨가제 「K」를 「E」로 치환한 첨가제의 조합 「ECNS」의 CFE는, 「KCNS」의 CFE보다도 유의하게 작았다(Tukey 검정, *: P<0.05).
·3종류의 첨가제의 조합
GFPhi 분획에 대해 행한 것과 같이, GFPlo 분획에 대해서도, 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」로부터 첨가제 「C」, 「N」 또는 「H」를 제외한 3종류의 첨가제의 조합 「KNS」, 「KCS」 또는 「KCN」의 CFE 및 긴 직경을 조사하였다. 「KCS」는, 「KCNS」의 CFE 및 긴 직경보다도 유의하게 작았다(Tukey 검정, *: P<0.05). 「KNS」의 CFE는 「KCNS」의 CFE 및 긴 직경과 유의차는 없지만, 낮은 경향을 나타냈다. 「KCNS」로부터 첨가제 「C」를 제외한 첨가제의 조합 「KNS」의 CFE 및 긴 직경은, 「KCNS」의 CFE와 유의차가 없었다. 이들 결과는, GFPhi 분획에 대한 결과와 동일하였다.
·6종의 첨가제의 조합, 및 5종류의 첨가제의 조합
도 4 및 도 5는, 6종의 첨가제의 조합 「KF10HCNS」가, 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서, 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」와 유의차는 없지만, 큰 경향이 있었던 것을 나타낸다. 「KF10HCNS」는, 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서, 4종의 첨가제의 조합 「HCNS」 및 「F10CNS」와 유의차는 없었다. 6종의 첨가제의 조합 「KF10HCNS」에 있어서의 첨가제 「C」는, 상술한 바와 같이, 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 중요하지 않기 때문에, 5종의 첨가제의 조합 「HF10KNS」는, GFPlo 분획에 있어서도 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서, 바람직한 첨가제의 조합인 것이 시사된다.
(GFPneg 분획)
상기한 GFPhi 분획의 폐 상피 줄기 세포의 현탁액과 마찬가지로, GFPneg 분획의 폐 상피 줄기 세포의 현탁액에 대해서도, CFE[％]를 산출하였다. 3종류의 첨가제의 조합 「KNS」의 CFE는, 0.75％였다.
시험예 2는, 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서, 첨가제 KGF(K), HGF(H) 및 FGF10(F10)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나와, 노긴(N) 등의 BMP 저해제와, SB431542(S) 등의 TGFβ 저해제를 포함하는 조합이 바람직하고, 보다 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서는, CHIR99021(C)와 「N」과 「S」와 「H」를 포함하는 조합이 보다 바람직하고, 「K」와 「N」과 「S」와 「H」와 「F10」을 포함하는 조합 또는 「K」와 「C」와 「N」과 「S」와 「H」와 「F10」을 포함하는 조합이 더욱 바람직한 것을 시사하였다. AT2의 오르가노이드의 효율적인 형성에 대해서는, 시험예 3에서 나타내는 바와 같이, 「C」를 포함하는 것이 바람직하다.
[시험예 3]
시험예 2는, CHIR99021(Wnt 시그널 활성화제)을 첨가해도, 오르가노이드 형성의 효율에 변화가 없는 것을 나타냈다. 시험예 3은, CHIR99021(C)에 의한 폐 상피 줄기 세포의 분화 전환에 대한 영향을 검토한다. 표준(Canonical) Wnt 저해제인 XAV939(X)를 사용하였다. GFPhi 분획 및 GFPlo 분획의 폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액을, 시험예 2와 마찬가지로 하여 배양하여, 오르가노이드를 형성시켰다. 4종류의 첨가제의 조합 「KCNS」 또는 「KXNS」를 기본 배지 MTEC/B27에 첨가하여, 배양 배지로 하였다. 배양 후, 형성된 오르가노이드의 파라핀 절편을 제작하였다. 상기 파라핀 절편 중의 오르가노이드에 대해서, Sftpc에 대한 항체 및 기관지 상피 세포 마커인 Sox2에 대한 항체를 사용한 조직 면역 염색을 행하였다.
GFPhi 분획에 관하여, 오르가노이드에 있어서의 Sox2의 발현은, Wnt 시그널 활성화제인 CHIR99021(C)를 포함하는 첨가제의 조합 KCNS에서는 일부의 오르가노이드에 약하게 발현이 확인되었다. Wnt/β 카테닌 저해제인 10μM의 XAV939(X)를 포함하는 첨가제의 조합 「KXNS」에서는, 일부의 오르가노이드에 있어서 Sox2의 발현이 강하게 확인되었다. Sftpc의 발현은, 첨가제의 조합 「KCNS」에서는, 첨가제의 조합 「KXNS」와 비교하여, 강한 경향이 있었다. 시험예 1에서 나타내진 바와 같이, GFPhi 분획에는, 주로 AT2를 포함하고, 일부에 BASCs를 포함한다. 따라서, 이들 결과는, GFPhi 분획의 현탁액 중에 일부 존재하는 BASCs가, Wnt 시그널 활성화제의 존재 하에서, AT2로 분화 전환되고, 그 결과, AT2의 오르가노이드가 형성된 것, 및 Wnt 저해제의 존재 하에서는, 일부 존재한 BASCs의 오르가노이드와, 주로 존재한 AT2의 오르가노이드를 포함하는 적어도 2종류의 오르가노이드가 형성되었다고 추정되었다.
GFPlo 분획에 관하여, 오르가노이드에 있어서의 Sox2의 발현은, Wnt 시그널 활성화제를 포함하는 첨가제의 조합 「KCNS」에서는 약했던 것에 비해, Wnt 저해제를 포함하는 첨가제의 조합 「KXNS」에서는, Sox2의 발현은 강하였다. Sftpc의 발현은, 「KCNS」에서는, 「KXNS」와 비교하여, 강한 경향이 있었다. GFPlo 분획에 있어서의 결과는, GFPhi 분획에 있어서의 결과와 마찬가지의 경향을 나타냈다.
시험예 3은, Wnt 시그널 활성화제(예를 들어 CHIR99021)의 존재 하에서, 폐 상피 줄기 세포의 오르가노이드를 형성시키면, AT2 세포 이외의 세포종으로부터 AT2의 오르가노이드 형성을 유도할 수 있는 것을 시사한다.
[실시예 1] 폐 상피 줄기 세포로의 오르가노이드 형성
GFPhi 분획의 폐 상피 줄기 세포를, 96웰의 초저흡착 플레이트(cell repellant 96 well plate)에, 1웰당 2,500 세포가 되게 파종하였다. 빙상에서 냉각시킨 기본 배지 MTEC/B27에 7종류의 첨가제 Y-27632(Y)와 HGF(H)와 Fgf10(F10)과 KGF(K)와 CHIR99021(C)와 CHIR99021(N)과 SB431542(S)의 조합을 첨가한 배양 배지에, 2.5％의 Matrigel을 첨가한 배양 배지를 사용하여, 시험예 2와 마찬가지로, 6일간 배양하여 CFE를 산출하였다(도 6). 상기 마찬가지로, GFPlo 분획의 폐 상피 줄기 세포를, 1웰당 200 세포가 되게 파종하고, 6일간 배양한 후, CFE를 산출하였다(도 6).
도 6은, 2.5％라는 저농도의 Matrigel을 포함하는 배양 배지 중에서, 폐 상피 줄기 세포를 배양함으로써, 폐 상피 줄기 세포의 오르가노이드가 형성되는 것, 그리고 그 오르가노이드 형성의 효율은, GFPhi 분획에서 약 1.4％이며, GFPlo 분획에서 약 6.4％였던 것을 나타낸다. 이 결과는, 50％ 또는 75％ Matrigel에 의한 겔을 포함하는 배양 배지 중에서의 폐 상피 줄기 세포의 오르가노이드 형성의 효율은, GFPhi 분획에서의 0.86％ 및 GFPlo 분획에서의 12％로 동일한 정도였던 것을 나타낸다.
실시예 1은, 본 개시에 관한 첨가제의 존재 하라면, 스캐폴드로서의 세포외 매트릭스의 겔(예를 들어, 50％ 또는 75％ Matrigel)을 포함하는 배양 배지 중에서의 배양이어도, 분산 성분으로서 세포외 매트릭스(예를 들어, 2.5％ Matrigel)를 포함하는 배양 배지 중에서의 배양이어도, 폐 상피 줄기 세포의 오르가노이드를 형성 가능한 것을 나타낸다.
[시험예 4]
형성한 오르가노이드가 분화능을 가지는지를 조사하였다. GFPhi 분획의 폐 상피 줄기 세포를, 시험예 2와 마찬가지로 하여, 기본 배지 MTEC/B27에 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」를 첨가한 배양 배지 중에서 8일간 배양하였다. 2개의 배양물 중 하나는, 상기 배양 배지 중에서 4일간 더 배양하였다. 또 하나는, 기본 배지 중에서 4일간 더 배양하였다. 배양 12일째에, 기본 배지에서의 배양으로 형성된 오르가노이드에 있어서, 폐포의 분화 세포인 AT1 세포의 세포 마커인 Hopx가 강하게 발현되고 있는 것이 나타내졌다. 시험예 4는, 본 개시에 관한 첨가제의 존재 하에서 형성되는 오르가노이드가, 분화능을 갖는 것을 나타낸다.
[조제예 2]
(폐선암 세포를 포함하는 현탁액의 조제)
마우스 B6.129S-Sftpctm1(cre/ERT2)Blh/J(이하 「Sftpc-CreERT2」)(Jackson Lab, StockNo.028054)과, 마우스 B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato, -EGFP)Luo/J(이하 「Rosa26-mTmG」)(Jackson Lab, StockNo.007676)와, 마우스 B6N.Cg-Krastm4Tyj/CjDswJ(이하 KrasLSLG12D)(Jackson Lab, StockNo.019104)의 3종의 마우스를 교배시킨, Sftpc-CreERT2; KRASLSLG12D; Rosa26-mTmG 마우스를 준비하였다. Sftpc-CreERT2; KRASLSLG12D; Rosa26-mTmG 마우스에 있어서, Kras가 활성화된 세포는, 세포막이 EGFP에서 유래하는 녹색 형광을 발한다.
Sftpc-CreERT2에서는, 타목시펜(tamoxifen)의 투여없이, Cre 유전자 재조합 효소가 활성화되고, 약 5-10％의 세포에 재조합이 발생한다(Barkauskas CE. et al., J Clin Invest. 2013; 123(7): 3025-36.). Sftpc-CreERT2; KRASLSLG12D; Rosa26-mTmG 마우스의 폐에 있어서, 다수의 노듈이 확인되어, 암화된 세포가 상기 마우스의 폐에 존재하는 것이 시사되었다.
조제예 1과 마찬가지로 하여, Sftpc-CreERT2; KRASLSLG12D; Rosa26-mTmG 마우스로부터, 폐 상피 세포를 포함하는 현탁액을 조제하였다. 조제예 1과 마찬가지로, 조제한 폐 상피 세포를 포함하는 현탁액으로부터, 형광 물질로 표지화한 항EpCAM 항체 유래의 형광, 및 GFP 유래의 형광에 기초하여, Kras가 활성화된 폐선암 세포를 포함하는 현탁액을 얻었다.
[실시예 2] 폐선암 세포로부터의 오르가노이드 형성
상기에서 얻어진 폐선암 세포를, 96웰의 초저흡착 플레이트(cell repellant 96 well plate)에, 1웰당 2,500 세포가 되게 파종하였다. 빙상에서 냉각시킨 기본 배지 MTEC/B27에 7종류의 첨가제 Y-27632(Y)와 HGF(H)와 Fgf10(F10)과 KGF(K)와 CHIR99021(C)와 CHIR99021(N)과 SB431542(S)의 조합을 첨가한 배양 배지에, 2.5％의 Matrigel을 첨가한 배양 배지를 사용하여, 시험예 2와 마찬가지로, 6일간 배양하여 CFE를 산출하였다(도 7). 상기 마찬가지로, 상기에서 얻어진 폐선암 세포를, 기본 배지 MTEC/B27과 2.5％의 Matrigel을 포함하는 배양 배지 중에서 6일간 배양한 후, CFE를 산출하였다(도 7).
도 7에 나타나는 바와 같이, 상기 첨가제의 존재 하(도 7 중 「+」), 폐선암 세포를 배양함으로써, 오르가노이드가 형성되고, 그 CFE는 약 1.7％였다. 상기 첨가제가 존재하지 않는 경우(도 7 중 「-」), 폐선암 세포의 오르가노이드 형성은 관찰되지 않았다.
실시예 2는, 본 개시에 관한 첨가제의 존재 하라면, 스캐폴드를 사용하지 않은 배양 배지 중에서의 배양이어도, 폐선암 세포의 오르가노이드를 형성시킬 수 있는 것을 나타낸다.
[조제예 3]
조제예 1과 마찬가지로 하여, SFTPC-GFP 마우스의 폐로부터, 폐 상피 줄기 세포를 포함하는 현탁액을 얻고, FACS Aria II(BD사)를 사용하고, GFP 유래의 형광 강도에 기초하여, 특정된 폐 상피 줄기 세포를 3개의 분획(GFPhi, GFPlo 및 GFPneg)으로 나누었다(도 8). GFPhi 분획은 시험예 2의 P19 분획에 상당한다. GFPlo 분획은 시험예 2의 P18 분획에 상당한다. GFPneg 분획은 시험예 2의 P17 분획에 상당한다.
[시험예 5]
시험예 1과 마찬가지로 하여, 마커 유전자의 발현 패턴을 qPCR에 의해 각 마커 유전자를 증폭시켜 조사하고, 그 발현 패턴으로부터 각 분획에 포함되는 세포종을 추정하였다(도 9). 그 결과, GFPneg 분획은, Krt5 양성 세포인 기저 세포와, Scgb1a1 및 Scgb3a2가 양성의 클럽 세포를 주로 하여 포함하는 것이 나타내졌다. GFPneg 분획은 시험예 1의 P17 분획과 마찬가지로, 섬모 세포 및 AT1 세포도 포함하였다. GFPlo 분획은, Scgb1a1 및 Scgb3a2가 양성인 클럽 세포를 주로 하여 포함하는 것이 나타내졌다. GFPhi 분획은, Sftpc 및 Abca3이 양성인 AT2 세포를 주로 하여 포함하는 것이 나타내지고, 일부 BASC를 포함하는 것이 시사되었다.
[시험예 6]
GFPhi 분획, GFPlo 분획 및 GFPneg 분획의 세포를 각각, 기본 배지 MTEC/B27에 HGF(H), FGF10(F10), KGF(K), 노긴(N), SB431542(S) 및 CHIR99021(C)를 표 2에 기재된 최종 농도가 되게 첨가한 증식 배지(50％ Matrigel을 포함함) 중에서, 피더 세포를 사용하지 않고 배양하였다. 기본 배지에 첨가한 CHIR99021(C)는 오르가노이드 형성에 필수는 아니지만, 클럽 세포의 AT2 세포로의 분화에 관여하고 있을 가능성이 있기 때문에 첨가하였다. 배양 9일째에, 상기 증식 배지를 기본 배지 MTEC/B27로 교환하고, 또한 3일간 배양하고, 분화를 촉진된 오르가노이드를 형성시켰다.
분화 촉진 전후에 형성된 오르가노이드에 있어서의 마커 단백질의 발현을, 이하의 시약을 사용한 면역 염색에 의해 조사하였다.
Figure pct00008
GFPneg 분획의 세포를 배양함으로써, 적어도 2종류의 오르가노이드가 형성되었다(도 10). 1종의 오르가노이드는, 분화 전(d9)에는 Krt5 양성(기저 세포 마커)의 기저 세포 및 SCGB1A1 양성(클럽 세포 마커)의 클럽 세포를 포함하는 세포 집단으로 구성되었다. 시험예 6의 분화 조건에서 형성된 상기 오르가노이드를 구성하는 세포는, 섬모 세포까지 분화되지 않았다. 이미 1종의 오르가노이드는, 분화 전(d9)에는 SCGB1A1 양성(클럽 세포 마커)의 클럽 세포를 포함하는 세포 집단으로 구성되고, 분화 후(d12)에는 ACTUB 양성(섬모 세포 마커)이 된 클럽 세포를 포함하는 세포 집단으로 구성되었다.
GFPlo 분획의 세포를 배양함으로써, 적어도 2종류의 오르가노이드가 형성되었다(도 11). 1종의 오르가노이드는, 분화 전(d9)에는 SCGB1A1 양성(클럽 세포 마커)의 클럽 세포, SOX2 양성(기관지 상피 마커)의 세포 및 SFTPC 양성(AT2 세포 마커)의 세포를 포함하는 세포 집단으로 구성되고, 분화 후(d12)에는 AGER 양성(AT1 세포 마커)이 된 폐포 계통(lineage)의 세포를 포함하는 세포 집단으로 구성되었다. 다른 1종의 오르가노이드는, 분화 전(d9)에는 SOX2 양성(기관지 상피 마커)이며, 또한 SFTPC 양성(AT2 세포 마커)의 세포 집단으로 구성되고, 분화 후(d12)에는 AGER 양성(AT1 세포 마커)이 된 폐포 계통의 세포를 포함하는 세포 집단으로 구성되었다.
GFPhi 분획의 세포를 배양함으로써, 적어도 1종의 오르가노이드가 형성되었다(도 12). 상기 오르가노이드는, 분화 전(d9)에는 SFTPC 양성(AT2 세포 마커)의 세포를 포함하는 세포 집단으로 구성되고, 분화 후(d12)에는 AGER 양성(AT1 세포 마커)의 AT2 세포를 포함하는 세포 집단으로 구성되었다.
[시험예 7]
SFTPC-GFP 마우스 유래의 GFPhi 분획, GFPlo 분획 및 GFPneg 분획의 세포를 대상 세포로서 사용하여, 효율적인 오르가노이드 형성에 유용한 첨가제의 조합을 검토한다. 50％ 또는 75％의 Matrigel(등록 상표)을 사용하고, 시험예 2와 마찬가지로 하여, 상기 세포를 포함하는 겔을 형성시켜, 배양을 행하였다. 오르가노이드 형성의 효율은, CFE[％] 및 오르가노이드의 긴 직경값에 기초하여 평가하였다. 시험예 7에서는, 6마리의 SFTPC-GFP 마우스를 사용하여, GFPhi 분획, GFPlo 분획 및 GFPneg 분획의 세포를 합계로 각각 120,000 세포, 3,600 세포 및 24,000 세포를 사용하였다(n=6).
(GFPhi 분획)
GFPhi 분획의 폐 상피 줄기 세포를, 이하의 첨가제의 조합을 첨가한 배양 배지 중에서, 시험예 2와 마찬가지로 하여, 배양하여 오르가노이드를 형성시켰다. 상기 배양에서는, 1웰당 5,000 세포가 되게 파종하여 배양하였다. 시험예 2와 마찬가지의 방법으로, CFE[％] 및 긴 직경[㎛]을 측정하였다(도 13).
Figure pct00009
+: 첨가제로서 사용하였다
-: 첨가제로서 사용하지 않았다
3종의 첨가제의 조합 「CNS」의 CFE에 비해, 「KCNS」, 「KNS」, 「F10CNS」, 「HCNS」 또는 「KF10HCNS」의 CFE는, 큰 값을 나타냈다(도 13의 A). 어느 첨가제의 조합을 사용한 경우에도, 오르가노이드의 긴 직경에 유의차는 보이지 않았다(도 13의 B).
·6종의 첨가제의 조합
6종의 첨가제의 조합 「KF10HCNS」를 사용한 경우에, 시험예 2의 결과와 마찬가지로, 가장 큰 CFE가 얻어졌다(도 13의 A). 예를 들어, 「KF10HCNS」를 사용한 경우의 CFE는, 3종의 첨가제의 조합 「CNS」, 상기 3종의 첨가제의 조합의 1종의 리셉터 트로신 키나아제(Receptor tyrosine kinase) 활성화 인자를 더 조합한 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」, 「ECNS」 또는 「F10CNS」를 사용한 경우의 CFE보다도 유의하게 컸다.
·4종의 첨가제의 조합
4종의 첨가제의 조합 「HCNS」의 CFE는, 「CNS」 또는 「ECNS」의 CFE에 의해서도 유의하게 컸다(도 13의 A). 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」, 「F10CNS」 및 「HCNS」가 각각, 동등한 CFE가 얻어졌다(도 13의 A). 이 결과는, 시험예 2의 결과와 마찬가지로, 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서, 첨가제 「K」와 「F10」과 「H」가 대체 가능한 것을 나타낸다.
·3종의 첨가제의 조합
4종의 첨가제의 조합 「KCNS」로부터, 첨가제 「N」을 제외한 3종의 첨가제의 조합 「KCS」 또는 첨가제 S를 제외한 3종의 첨가제의 조합 「KCN」의 CFE는 각각, 「KCNS」의 CFE에 비해 낮은 경향이 있었다.(도 13의 A) 이 결과는, 시험예 2의 결과와 마찬가지로, 4종의 첨가제 「KCNS」에 있어서, 첨가제 「N」 및 「S」가 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 중요한 것을 나타낸다.
KCNS로부터 첨가제 C를 제외한 첨가제의 조합 「KNS」의 CFE는, 「KCNS」의 CFE와 유의차가 없었다(도 13의 A). 이 결과는, 시험예 2의 결과와 마찬가지로, 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서, 첨가제 「C」는 중요하지 않은 것을 나타낸다. 그러나, 시험예 3에서 나타내는 바와 같이, 첨가제 「C」는, 세포괴를 구성하는 폐 상피 줄기 세포의 분화 전환을 야기하는 것이 시사된다.
(GFPlo 분획)
GFPlo 분획의 폐 상피 줄기 세포에 대해서도, 상기한 GFPhi 분획의 폐 상피 줄기 세포와 마찬가지로 하여, CFE[％]를 산출하였다. 단, GFPhi 분획과는 달리, 1웰당 150 세포가 되도록 하여 배양하였다. CFE(n=6)의 평균값 및 표준 편차를 산출하였다(도 14의 A). 또한 오르가노이드의 긴 직경(n=6)의 평균값 및 표준 편차를 산출하였다(도 14의 B).
3종의 첨가제의 조합 「CNS」의 CFE에 비해, 「KCNS」, 「KNS」, 「F10CNS」, 「HCNS」 또는 「KF10HCNS」의 CFE는, 큰 값을 나타냈다(도 14의 A).
·6종의 첨가제의 조합
6종의 첨가제의 조합 「KF10HCNS」를 사용한 경우, 시험예 2의 결과와 마찬가지로, 가장 큰 CFE 및 긴 직경이 얻어졌다(도 14의 A 및 B). 예를 들어, 「KF10HCNS」의 CFE는, 3종의 첨가제의 조합 「CNS」의 CFE, 또는 상기 3종의 첨가제의 조합에 EGF(E)를 더 조합한 4종의 첨가제의 조합 「ECNS」의 CFE보다도 유의하게 컸다(도 14의 A). 「KF10HCNS」에 있어서의 긴 직경은, 「ECNS」에 있어서의 긴 직경보다도 유의하게 컸다(도 14의 B).
·4종의 첨가제의 조합
4종의 첨가제의 조합 「F10CNS」 또는 「HCNS」의 CFE는, 3종의 첨가제의 조합 「CNS」의 CFE보다도 유의하게 컸다(도 14의 A). 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」, 「F10CNS」 및 「HCNS」가 각각, 동등한 CFE를 나타냈다(도 14의 A). 이 결과는, 시험예 2의 결과와 마찬가지로, 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서, 첨가제 「K」와 「F10」과 「H」가 대체 가능한 것을 나타낸다. 「KCNS」에 있어서의 첨가제 「K] 대신에 첨가제 「E]를 사용한 4종의 첨가제의 조합 「ECNS」는, KCNS보다도 유의하게 작은 CFE 및 긴 직경을 나타냈다(도 14의 A 및 B). 이들 결과는, 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서, 첨가제 「E」는, 첨가제 「K」, 「F10」 또는 「H」로 대체할 수 없는 것을 나타낸다.
·3종의 첨가제의 조합
4종의 첨가제의 조합 「KCNS」로부터, 첨가제 「N」 또는 「K」를 제외한 3종의 첨가제의 조합 「KCS」 또는 「CNS」의 CFE는 각각, 「KCNS」의 CFE에 비해 유의하게 낮았다(도 14의 A). 「KCNS」를 사용한 경우의 긴 직경은, 「KCS」를 사용한 경우의 긴 직경보다도 유의하게 작았다(도 14의 B). 또한, 「KCNS」로부터, 첨가제 S를 제외한 3종의 첨가제의 조합 「KCN」의 CFE는, 「KCNS」의 CFE에 비해 낮은 경향이 있었다(도 14의 A). 이들 결과는, 시험예 2의 결과와 마찬가지로, 4종의 첨가제 「KCNS」에 있어서, 첨가제 「N」 및 「S」가 효율적인 오르가노이드 형성에 관하여 중요한 것을 나타낸다.
「KCNS」로부터 첨가제 「C」를 제외한 첨가제의 조합 「KNS」의 CFE는, 「KCNS」의 CFE와 유의차가 없었다(도 14의 A). 이 결과는, 시험예 2의 결과와 마찬가지로, 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서, 첨가제 「C」는 중요하지 않은 것을 나타낸다.
(GFPneg 분획)
GFPneg 분획의 폐 상피 줄기 세포에 대해서도, 상기한 GFPhi 분획의 폐 상피 줄기 세포와 마찬가지로 하여, CFE[％]를 산출하였다. 단, GFPhi 분획과는 달리, 1웰당 1,000 세포가 되도록 하여 배양하였다. CFE(n=6)의 평균값 및 표준 편차를 산출하였다(도 15의 A). 또한 오르가노이드의 긴 직경(n=6)의 평균값 및 표준 편차를 산출하였다(도 15의 B).
3종의 첨가제의 조합 「CNS」의 CFE에 비해, 「KCNS」, 「KNS」, 「F10CNS」, 「HCNS」 또는 「KF10HCNS」의 CFE는, 큰 값을 나타냈다(도 15의 A). 이들 첨가제의 조합은, 「N」 및 「C」를 포함하고, 또한 「K」, 「H」 및 「F10」으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함한다.
·6종의 첨가제의 조합
6종의 첨가제의 조합 「KF10HCNS」를 사용한 경우, 가장 큰 CFE 및 긴 직경이 얻어졌다(도 15의 A 및 B). 예를 들어, 「KF10HCNS」의 CFE는, 리셉터 트로신 키나아제 활성화 인자를 포함하지 않는 3종의 첨가제의 조합 「CNS」의 CFE보다도 유의하게 컸다(도 15의 A).
3종의 첨가제의 조합 CNS에 1종의 리셉터 트로신 키나아제 활성화 인자를 더 조합한 4종의 첨가제의 조합 「KCNS」, 「ECNS」, 「F10CNS」 또는 「HCNS」를 사용한 경우의 긴 직경은, 상기 3종의 첨가제의 조합 CNS를 사용한 경우의 긴 직경의 유의하게 컸다(도 15의 B). 이 결과는, 오르가노이드 형성에 대해서, 4종의 리셉터 트로신 키나아제 활성화 인자 「K」, 「E], 「F10」 및 「H」 중 어느 1종을, 3종의 첨가제의 조합 「CNS」에 조합하는 것이 중요한 것을 나타낸다.
오르가노이드 형성에 대해서, GFPneg 분획의 세포에서는, GFPhi/lo 분획의 세포와는 달리, ECNS를 사용한 경우에도, CNS를 사용한 경우보다도 유의한 차가 보였다(도 13의 A, 도 14의 A 및 도 15의 B). 이 결과는, 피더 세포를 사용하지 않고 기저 세포를 배양할 때에 EGF가 사용되는 것과 일치한다(Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Aug 4; 106(31): 12771-5).
시험예 7은, 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서, 첨가제 KGF(K), HGF(H) 및 FGF10(F10)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나와, 노긴(N) 등의 BMP 저해제와, SB431542(S) 등의 TGFβ 저해제를 포함하는 조합이 바람직하고, 보다 효율적인 오르가노이드 형성에 대해서는, CHIR99021(C)와 「N」과 「S」와 「H」를 포함하는 조합이 보다 바람직하고, 「K」와 「N」과 「S」와 「H」와 「F10」을 포함하는 조합 또는 「K」와 「C」와 「N」과 「S」와 「H」와 「F10」을 포함하는 조합이 더욱 바람직한 것을 시사하였다.
[실시예 3] 클럽 세포 유래 오르가노이드의 폐 상해 마우스에의 이식
유전자 재조합 마우스 rShh-Cre; Rosa26-CAG-LSL-H2B-mCherry; SFTPC-GFP 마우스를 준비하였다(도 16의 A, 도너 마우스). 상기 유전자 재조합 마우스는, 마우스 B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J(본 명세서 중 「Shh-Cre」라고 약칭함)(Jackson Lab. Stock No.005602)와, 마우스 B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1Ksvo/J(본 명세서 중 「ROSA26-mCherry」라고 약칭함)(Jackson Lab. Stock No.023139)와, SFTPC-GFP 마우스의 3종의 마우스를 교배하여 작출되었다.
상기 유전자 재조합 마우스로부터, 조제예 1과 마찬가지의 방법으로, GFPlo의 세포 집단(클럽 세포)을 취득하였다. 취득된 세포의 핵은, mCherry에 의해 염색된다. 상기 세포가 AT2 세포가 되었을 경우, GFP가 강하게 발현된다.
상기 유전자 재조합 마우스로부터 취득한 상기 세포로, 이하의 방법에 따라서, 오르가노이드를 형성시켜, 상기 오르가노이드 유래의 세포를 폐 상해 마우스에 투여하였다(도 16의 B). 상기 유전자 재조합 마우스로부터 취득한 상기 세포를 배지(MTEC/B27+YHF10KCNS+2.5％ Matrigel 2mL) 중에 포함하는 세포 현탁액을, 6웰 플레이트에 1웰당 1×104 세포가 되게 파종하였다. 3일에 한번 Matrigel을 포함하지 않는 상기 배지 1mL를 상기 웰에 첨가하고, 계 9일간 배양하였다. 배양 9일째에 오르가노이드를 포함하는 배양액을 원심 분리에 걸어(400G, 3분, 4℃), 오르가노이드를 회수하였다. 회수한 오르가노이드에, 미리 37℃로 따뜻하게 한 프로테아제 용액 10mL(아큐타아제, 콜라게나아제 타입 I(Collagenase type I)(450U/mL, Worthington), DNase(0.1mg/mL, SIGMA))를 첨가하고, 37℃에서 20분간, 로테이터를 사용하여 온화하게 교반하였다. 상기 용액을 피펫팅하여 세포 현탁액을 얻고, 그것을 원심 분리에 걸어(400G, 5분, 4℃), 세포괴를 회수하였다. 회수한 세포괴에 0.25％ 트립신 5mL(Gibco, 0.1mg/mL의 DNase를 포함함)를 첨가하고, 37℃에서 10분간, 로테이터를 사용하여 온화하게 교반하였다. 상기 용액을 피펫팅하여 세포 현탁액을 얻고, 프로테아제의 반응을 정지시키기 위해 상기 세포 현탁액에 DMEM/F12 10mL(10％ FBS 함유)를 첨가하였다. 상기 세포 현탁액을 원심 분리에 걸어(400G, 5분, 4℃), 회수한 세포를, 배지 75μL당 생세포 4×105가 되게, 90μL의 배지(MTEC/B27+「YHF10KNS」) 중에 현탁시켰다.
폐 상해 마우스는, 오르가노이드 유래의 상기 세포를 투여하기 9일 전에, 누드 마우스를 이소플루란(화이자)로 마취하고, 3mg/Kg 용량의 블레오마이신 용액(닛폰 가야쿠)을 경비적으로 투여함으로써, 조제하였다.
오르가노이드 유래의 상기 세포를 투여하는 날에, 상기 폐 상해 마우스를 이소플루란(화이자)으로 마취하고, 상기 마우스에 이상에서 조제한 세포 현탁액을 기관으로부터 투여하였다. 세포 투여의 2주일 후에, 상기 폐 상해 마우스를 해부하여, 폐의 동결 절편을 제작하였다. 상기 동결 절편에 있어서의 mCherry 및 GFP 유래의 형광을 형광 현미경으로 촬영하고, 투여한 상기 세포의 폐 조직에의 접착 및 생존을 조사하였다(도 16의 C 및 D).
폐 절편에, 핵으로부터 mCherry 유래의 형광을 발하는 세포가 관찰되었다(도 16의 C). 이 결과는, 도너인 유전자 재조합 마우스로부터 취득한 클럽 세포로부터 오르가노이드를 형성시킨 후에 얻어진 클럽 세포가, 레시피언트인 폐 상해 마우스의 폐 조직에 접착 및 생존한 것을 나타낸다. 핵으로부터 mCherry 유래의 형광을 발하는 세포 중, 몇개의 세포가 GFP 유래의 형광을 발하고 있었다(도 16의 D). 이 결과는, 클럽 세포로부터 AT2 세포로 분화된 세포가 폐 상해 마우스의 폐 조직에 접착 및 생존하고 있었던 것을 나타낸다.
[실시예 4] 인간 초대 세포로부터의 오르가노이드 형성
이하의 인간 폐포 세포(Human Pulmonary Alveolar Epithelial Cells: HPAEpiC) 및 인간 기도 세포(Human Small Airway Epithelial Cells: HPSAEpiC)를 구입하였다.
Figure pct00010
구입한 동결 인간 초대 세포를 37℃에서 융해시키고, 융해액 100μl를 배양 배지(MTEC/B27+「YHF10KCNS」+5％ Matrigel) 2mL 중에 현탁시키고, 세포 현탁액을 6웰의 발수 플레이트(repellent plate)에 파종하였다. HPAEpiC는 1웰당 1.44×105 세포가 되게 파종하였다. HPSAEpiC는 1웰당 5.6×104 세포가 되게 파종하였다. 배양 3일째에 상기 배양 배지 1ml를 첨가하였다. 배양 6일째에, 배양 세포를 1웰당 2×105 세포가 되게 계대하였다. 이후 12일마다 배양 세포를 계대하였다.
인간 초대 세포의 배양 6일째에 계대한 세포의 배양 12일째에, 배양 세포를 관찰하였다(도 17). 인간 폐포 세포 및 인간 기도 세포를 배양한 웰에 있어서 오르가노이드가 각각 관찰되었다(도 17의 A 및 B). 형성된 오르가노이드에 있어서의 마커 단백질의 발현을, 시험예 6의 표 4에 나타낸 시약을 사용한 면역 염색에 의해 조사하였다(도 18). 면역 염색은, 오르가노이드의 파라핀 절편을 사용하여 행하였다. 그 결과, 인간 폐포 세포로 3개 타입의 오르가노이드가 형성된 것(도 18의 A 내지 C), 그리고 인간 기도 세포로부터는 1개 타입의 오르가노이드가 형성된 것이 나타내졌다(도 18의 D).
도 18의 A는, 인간 폐포 세포로 형성된 오르가노이드가 인간 특이적 AT2 세포 마커(HT2-280) 및 마우스와 공통된 AT2 세포 마커(SFTPC)를 발현하는 폐포 타입인 것을 나타낸다. 도 18의 B는, 인간 폐포 세포로 형성된 오르가노이드가, 상기한 2개의 마커 단백질 HT2-280 및 SFTPC를 발현하고, 또한 기관지 상피 마커인 SOX2를 발현하는 기관지 폐포 타입인 것을 나타낸다. 도 18의 C는, 인간 폐포 세포로 형성된 오르가노이드가 기관지 상피 마커인 SOX2만을 발현하는 기관지 타입인 것을 나타낸다. 실시예 4에서는, 인간 폐포 세포로 3개 타입의 오르가노이드가 형성되었다. 이 결과는, 구입한 인간 폐포 세포에 말초 기도의 세포가 혼입되어 있었던 것이 하나의 원인으로 생각된다.
도 18의 D는, 인간 기도 세포로 형성된 오르가노이드가, 기저 세포 마커(KRT5) 및 기관지 상피 마커(SOX2)를 발현하는 기저 세포로 형성된 것을 나타낸다.
실시예 4는, 본 명세서에 개시한 첨가제의 조합을 포함하는 배양 배지 중에서, 인간 폐 초대 세포를 배양함으로써 오르가노이드를 형성시킬 수 있는 것을 나타낸다.
[실시예 5] 세포 집단 배양에서의 오르가노이드 형성의 이미징
폐 상피 세포를, 유전자 재조합 마우스 Scgb1a1-CreER; Rosa26-mTmG로부터 조제하였다. 상기 유전자 재조합 마우스에 타목시펜을 투여하면, Scgb1a1이 Cre 리콤비나아제에 의해 Rosa26 유전자좌에 도입된다. 그 결과, Scgb1a1의 발현이 세포막 국재형 GFP(mGFP) 유래의 형광에 의해 검출할 수 있게 된다.
상기 유전자 재조합 마우스에 타목시펜을 5회 투여하였다. 타목시펜을 투여한 3주일 후에, 기관을 절제한 폐를 적출하였다. 적출한 폐로부터, 조제예 1과 마찬가지로 하여, 세포 현탁액을 조제하였다. 상기 세포 현탁액에 다음 항체: 항EPCAM-PE-Cy7(#25-5791-80, eBioscience), 항CD24-APC(#25-0242-80, Invitrogen), 항CD45-비오틴(#13-0451, eBioscience), 항CD31-비오틴(#13-0311, eBioscience)을 첨가하고, 20분간 빙상에서 반응시켰다. 상기 반응액을, 500μL의 DPBS(-)/3％ FBS에 현탁시킨 후, 원심 분리에 걸어(400g, 3분, 4℃), 침전 세포를 100μL의 DPBS(-)/3％ FBS 중에 재현탁시켰다. 세포 현탁액에 1×106 세포당 0.25μL의 스트렙트아비딘 APC-Cy7을 첨가하고, 10분간 빙상에서 반응시켰다. 상기 세포를 500μL의 DPBS(-)/3％ FBS에 현탁시킨 후, 원심 분리에 걸어(400g, 3분, 4℃), 침전 세포를 500μL의 DPBS(-)/3％ FBS 중에 재현탁시켰다. 세포 현탁액에 1×106 세포당 5μL의 7-아미노-액티노마이신 D(7-AAD)를 첨가하고, 20분간 빙상에서 반응시켰다. 상기 반응액으로부터, 40㎛의 셀 스트레이너를 사용하여 세포괴를 제거한 후, FACS에 제공하였다.
FACS를 행함으로써, 조제한 상기 세포 현탁액으로부터 7-AAD로 염색된 사세포를 제거하고, 항CD31로 염색된 내피 세포를 제거하고, 또한 항CD45 항체로 염색된 혈구계 세포를 제거하였다. 남은 세포 집단으로부터 항EPCAM 항체로 염색된 상피 세포를 모으고, GFP 유래의 형광을 발하는 Scgb1a1 양성 세포(주로 클럽 세포)를 모으고, 또한 항CD24 항체로 염색된 조직 줄기 세포/간(progenitor) 세포를 모았다(CD24lo). 얻어진 세포를 원심 분리에 걸어(400g, 5분, 4℃), 침전 세포를 배양 배지(MTEC/B27+5％ FBS+「YHF10KNS」) 중에 현탁시킨 후, 배양 배지(MTEC/B27+5％ FBS+「YHF10KNS」+2.5％ Matrigel)를 첨가하여 250μL당 300 세포를 포함하는 세포 현탁액을 조제하였다. 상기 세포 현탁액을, 초저흡착 96웰 플레이트(CELLSTAR, #655970, Greiner)에 파종하고, 상기 96웰 플레이트를 인큐베이터 일체형 현미경인 Celldiscoverer7(Zeiss)에 설치하였다. 상기 세포를 10일간 배양하면서, 소정의 간격으로 명시야에서 배양 세포를 촬영하였다. 첫날(0일째)은 4시간마다 촬영하고, 1 내지 10일째는 1일 1회의 간격으로 촬영하였다. 대물 렌즈의 배율은 10배를 사용하였다. Z폭 45㎛로 17장 촬영을 행하였다. 따라서, 촬영한 화상 파일은, 각 타이밍에서 Z축 방향으로 17장의 화상 데이터를 포함하였다.
(화상 해석 방법)
촬영한 화상 파일을, 화상 해석 소프트웨어 ZEN3.0(blue edition)을 사용하여 Tiff 파일로 변환하고, 이어서 화상 해석 소프트웨어 ImageJ(ver.1.52n)를 사용하여 해석하였다. 0일째로부터 10일째까지의 화상 파일을 통해서, 1 세포로부터 오르가노이드가 형성될 때까지의 과정을 추적하였다. 세포괴의 긴 직경이 50㎛ 이상이 되었을 경우에, 오르가노이드가 형성되었다고 판단하였다. 오르가노이드 형성의 추적에 있어서, 포커스가 벗어나 있는 세포, 타일링의 단부에 위치하여 전체상이 보이지 않는 세포, 다른 세포와 접촉하고 있는 세포, 및 어떠한 이유로 배양 6일째까지 추적이 불가능해진 세포(예를 들어 성장한 오르가노이드와 겹쳐진 세포)는 해석으로부터 제외하였다. 0일째의 화상 데이터에 있어서 1 세포로부터 오르가노이드 형성의 과정을 관찰할 수 있었던 세포를 포함하는 영역을 오려낸 화상 파일을 제작하였다. 오려내진 화상 파일의 Z축 방향의 화상 데이터를, ImageJ의 plugin인 StackReg(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)를 사용하여 통합하였다. 통합한 화상 데이터에 있어서의 삼차원 구축된 세포의 형태를 계측하였다. 형태 계측은, 면적(Area), 주위의 길이(Perimeter), 긴 직경(Major axis), 짧은 직경(Minor axis), 진구값(Circularity), 그레이값(Gray value) 및 중심(Centroid)의 항목에 대하여 행하였다.
(결과)
3마리의 마우스로부터 얻어진 세포 현탁액 중의 1,056 세포의 세포 집단을 배양하고, 그 세포 집단 내의 개개의 세포에 관한 오르가노이드 형성의 과정을 관찰하였다. 1,056 세포 중, 235 세포가 오르가노이드를 형성하고, 821 세포는 오르가노이드를 형성하지 않았다. 오르가노이드를 형성한 세포 및 오르가노이드를 형성하지 않은 세포 각각의 형태를 계측하였다(도 19). 도 19의 A는, 오르가노이드를 형성한 세포는 오르가노이드를 형성하지 않은 세포에 비해, 면적이 유의하게 컸던 것을 나타낸다. 도 19의 B 내지 도 19의 D는, 오르가노이드를 형성한 세포는 오르가노이드를 형성하지 않은 세포와 비교하여, 주위의 길이, 긴 직경 및 짧은 직경이 유의하게 컸던 것을 각각 나타낸다. 도 19의 E 내지 도 19의 H는, 진구도, 그레이값(평균, 최빈값) 및 중심에는, 오르가노이드를 형성한 세포와 오르가노이드를 형성하지 않은 세포 사이에 유의한 차가 없었던 것을 나타낸다.
실시예 5는, 마우스로부터 얻어진 폐 상피 세포 중에서, 비교적 큰 세포, 구체적으로는 그 면적, 주위의 길이, 긴 직경, 및/또는 짧은 직경이 큰 세포가, 오르가노이드를 형성하는 경향이 높은 것을 나타낸다.
[실시예 6] 1 세포 배양에서의 오르가노이드 형성의 이미징
실시예 5와 같이, 세포를 집단으로 배양하고, 그 집단 내의 개개의 세포의 배양 경과를 관찰한 경우, 시간 경과에 수반하여 어느 세포가 다른 세포와 하나가 되어 세포괴를 형성하거나 하여, 그 세포의 오르가노이드 형성 과정을 추적할 수 없게 되는 경우가 있었다. 실시예 6에서는, 1웰에 1 세포를 파종하여 배양함으로써, 보다 정확하게, 오르가노이드를 형성하기 쉬운 세포의 형태적 특징을 조사하였다.
실시예 5와 마찬가지로 하여, 마우스로부터 폐 상피 세포의 세포 현탁액을 조제하고, 이어서 상기 세포 현탁액을 FACS에 제공하여 클럽 세포를 모았다. 상기 클럽 세포를 배양 배지(MTEC/B27+5％ FBS+「YHF10KNS」) 중에 현탁시키고, 배양 배지 1ml당 2,500 내지 5,000 세포를 포함하는 세포 현탁액을 조제하였다. 상기 세포 현탁액 2ml를, Biosurfine AWP-MRH(6％aq)(도요 고세이)를 사용하여 비접착화한 Elplasia 6웰 플레이트(Corning 4444)에 파종하고, 상기 플레이트를 30분간 정치하였다. 그 후, 세포 픽킹&이미징 시스템인 Cellhandler(Yamaha)를 사용하여, 상기 플레이트의 웰의 명시야(BF)의 화상 및 요오드화프로피듐(PI, #130-093-233, Miltenyi Biotec)의 형광 화상을 취득하고, PI 음성이었던 생세포를 1개씩, 384 셀·플레이트(CELLSTAR, #655892, Greiner)의 1웰 중의 50μL의 배양액(MTEC/B27+5％ FBS+「YHF10KNS」+2.5％ Matrigel)에 첨가하였다. 각 웰 중의 세포를 37℃, 5％ CO2 하에서 10일간 배양하여 오르가노이드를 형성시켰다. 세포괴의 긴 직경이 50㎛ 이상이 되었을 경우에, 오르가노이드가 형성되었다고 판단하였다. 실시예 5와 마찬가지의 시간 간격으로, 1 세포로부터의 오르가노이드 형성 과정을 촬영하였다. 취득한 화상 데이터는, ImageJ(ver.1.52n)를 사용하여, 실시예 5와 마찬가지로 하여, 세포 형태의 항목을 계측하였다.
(결과)
3마리의 마우스로부터 얻어진 1,053 세포를 각각 개별의 웰 중에서 배양하고, 1 세포로부터 오르가노이드를 형성하는 과정을 관찰하였다. 1,053 세포 중, 307 세포가 오르가노이드를 형성하고, 746 세포는 오르가노이드를 형성하지 않았다. 오르가노이드를 형성한 세포 및 오르가노이드를 형성하지 않은 세포 각각의 형태를 계측하였다(도 20). 오르가노이드를 형성한 세포는, 오르가노이드를 형성하지 않은 세포에 비해, 면적, 주위의 길이, 긴 직경 및 짧은 직경이 유의하게 컸다(도 20의 A 내지 도 20의 D). 진구도, 그레이값(평균, 최빈값) 및 중심에는, 오르가노이드를 형성한 세포와 오르가노이드를 형성하지 않은 세포 사이에 유의한 차가 없었다(도 20의 E 내지 도 20의 H).
실시예 6은, 실시예 5와 마찬가지로, 마우스로부터 얻어진 폐 상피 세포 중에서, 비교적 큰 세포, 구체적으로는 그 면적, 주위의 길이, 긴 직경, 및/또는 짧은 직경이 큰 세포가, 오르가노이드를 형성하는 경향이 높은 것을 나타낸다.
[실시예 7] 1 세포에서의 세포 형태의 계측 및 RNA 서열 결정의 조합
실시예 5 및 6에서 나타내진 형태적 특징을 갖는 세포에 있어서의 유전자 발현 패턴을 조사하기 위해서, 1분자의 세포의 형태 계측 데이터와 1분자 RNA 서열 결정 데이터를 조합하여 분석한다.
실시예 6과 마찬가지로 하여, 마우스로부터 얻어진 폐 상피 세포에서 클럽 세포를 회수하고, 상기 클럽 세포를 배양 배지(MTEC/B27+5％ FBS+「Y」) 중에 현탁하여 배양 배지 1ml 2,500 내지 5,000 세포를 포함하는 세포 현탁액을 조제하였다. 상기 세포 현탁액 2ml를, Biosurfine AWP-MRH(6％aq)(도요 고세이)를 사용하여 비접착화한 Elplasia 6웰 플레이트(Corning 4444)에 파종하고, 상기 플레이트를 30분간 정치하였다. 그 후, Cellhandler(Yamaha)를 사용하여, 상기 플레이트의 웰 BF 화상 및 PI 화상을 취득하고, PI 음성이었던 생세포를 1개씩, 96웰의 PCR 플레이트의 1개의 웰 중의 RNase 인히비터 용액 2μL(RNAsin plus 0.2μL, 5xMaxima H-버퍼(buffer) 0.4μL, 무RNase 워터(RNase free water) 1.4μL)에 첨가하였다. 상기한 각 세포에 대하여 RNA 서열 결정을 행하고, 1 세포 RNA 서열 결정 데이터를 취득하였다. 또한, ImageJ(ver.1.52n)를 사용하여, 실시예 5와 마찬가지로 하여, 각 세포에 관한 화상 데이터로부터 세포 형태의 항목을 계측하였다. 계측한 세포 형태에 관한 화상 해석 데이터와 1 세포 RNA 서열 결정 데이터를, 해석 소프트웨어 Seurat(ver.3)를 사용하여 통합하였다.
(결과)
1 세포에서의 세포 형태에 관한 화상 해석 데이터와 1 세포 RNA 서열 결정 데이터를 조합하여, 클러스터링 해석을 행한 결과, 측정한 세포가 주로 3개의 클러스터로 분류되었다(도 21). 도 21의 A 내지 C에 있어서, 우측 상단에 나타내지는 클러스터를 「클러스터 0」이라고 칭하고, 우측 하단에 나타내지는 클러스터를 「클러스터 1」이라고 칭하며, 또한 좌측 하단에 나타내지는 클러스터를 「클러스터 2」라고 칭한다. 도 21의 A는, 각 클러스터에 있어서의 클럽 세포 마커인 Scgb1a1의 발현 레벨을 나타내고, 클러스터 0 및 2가 Scgb1a1을 강하게 발현하고 있었던 것을 나타낸다. 이 결과는, 클러스터 0 및 2에 대응하는 세포가 클럽 세포인 것을 시사한다(도 21의 C). 도 21의 B는, 각 클러스터에 있어서의 AT2 세포 마커인 Sftpc의 발현 레벨을 나타내고, 클러스터 1이 Sftpc를 강하게 발현하고 있었던 것을 나타낸다. 이 결과는, 클러스터 1에 대응하는 세포가 AT2 세포인 것을 나타낸다(도 21의 C).
도 21의 D는, 각 클러스터에 대응하는 세포의 면적을 나타낸다. 도 21의 D는, 클러스터 2에 대응하는 클럽 세포가(도 21의 D의 우측), 클러스터 0에 대응하는 클럽 세포보다도((도 21의 D의 좌측), 세포의 면적이 큰 것을 나타낸다. 실시예 4 및 5의 결과를 고려하면, 클러스터 2에 대응하는 비교적 큰 클럽 세포가, 오르가노이드를 형성하는 경향이 높은 세포인 것이 시사된다.
세포 형태에 관한 화상 해석 데이터와 1 세포 RNA 서열 결정 데이터를 통합함으로써, 각 클러스터에 대응하는 세포가 특정한 유전자를 강하게 발현하는 것이 명백해졌다. 이하의 표는, 각 클러스터에서 강하게 발현된 유전자의 상위 20의 유전자를 각각 나타낸다.
Figure pct00011
다른 클러스터에 대응하는 세포에 비해, 클러스터 2에 대응하는 세포에서 강하게 발현하는 세포 표면 단백질에 대응하는 유전자의 전사 레벨을 조사하였다(도 22). 그 결과, Fxyd3, Pigr, Cpd, Ly6a, Perp, Kcne3, Il13ra1, Slc15a2 및 Cd14가, 클러스터 2에서 비교적 강하게 발현되는 것이 명백해졌다.
실시예 5 내지 7은, 실시예 7에서 찾아내진 마커를 발현하는 폐 상피 세포를 선택함으로써, 오르가노이드를 형성하는 경향이 높은 폐 상피 세포를 선택할 수 있는 것을 나타낸다.
[실시예 8] CD14+의 클럽 세포의 오르가노이드 형성
실시예 7에서 찾아내진 마커 중 CD14를 사용하여, 폐 상피 세포로부터 CD14를 발현하는 CD14+ 세포(클러스터 2에 대응하는 세포)를 분취하고, CD14+ 세포가 오르가노이드를 형성하는 경향이 높은지를 조사하였다.
다음의 항체: 항CD14-APC(#17-1401-81, invitrogen), 항MHC class2-eFluoro450(#48-5321, eBioscience), 항CD24-PEcy7(#25-0242-80, invitrogen), 항CD45-비오틴(#13-0451, eBioscience), 항CD31-비오틴(#13-0311, eBioscience)을 사용한 것을 제외하고, 실시예 5와 마찬가지로 하여, FACS에 제공하기 위한 세포 현탁액을 조제하였다.
(CD14+ 세포의 분취)
FACS를 행함으로써, 조제한 세포 현탁액으로부터 7-AAD로 염색된 사세포를 제거하고, 항CD31로 염색된 내피 세포를 제거하고, 항CD45 항체로 염색된 혈구계 세포를 제거하고, 또한 항MHC class2 항체로 염색된 AT2 세포(클러스터 1에 대응하는 세포)를 제거하였다. 남은 세포 집단으로부터 GFP 유래의 형광을 발하는 Scgb1a1 양성 세포(주로 클럽 세포)를 모으고, 항CD24 항체로 염색된 조직 줄기 세포/간(progenitor) 세포를 모았다(CD24lo). 이에 의해, 클러스터 0 및 클러스터 2에 대한 세포가 선택된다. 이어서, 항CD14 항체로 염색된 CD14+ 세포와 염색되지 않은 CD14- 세포를 각각 분취하였다. FACS에 의한 CD14+ 세포와 CD14- 세포의 분취는, 이하와 같이 행하였다. 먼저, 아이소타입 항체를 사용한 세포 현탁액을 FACS에 제공하고, 얻어진 세포 분포가 수렴되게 게이트를 설정하였다. 이어서, 항CD14 항체를 사용한 세포 현탁액을 FACS에 제공하고, 얻어진 세포 분포 중, 설정한 게이트 범위를 초과한 세포를 CD14+ 세포로서 분취하고, 그 게이트 내의 세포를 CD14- 세포로서 분취하였다.
CD14+ 세포가, 클러스터 2에 대응하는 클럽 세포인지를 조사하기 위해서, 클러스터 2에 대응하는 세포에서 강하게 발현되는 것이 찾아내진 유전자, Muc5b, Scgb3a1 및 Tff2의 발현 레벨을 qPCR에 의해 조사하였다(도 23의 A). 도 23의 A는, CD14+ 세포에서는, 클러스터 2에 대응하는 세포에서 강하게 발현되는 마커 유전자인 Muc5b, Scgb3a1 및 Tff2의 발현 레벨이 높았던 것을 나타낸다. 이 결과는, CD14+ 세포가, 클러스터 2에 대응하는 클럽 세포인 것을 시사한다.
또한, CD14+ 세포가, 오르가노이드를 형성하는 경향이 높은 비교적 큰 세포인지를 조사하였다(도 23의 B). 상기한 바와 같이 얻어진 CD14+/- 세포를 원심 분리에 걸어(400G, 5분, 4℃), 250μL의 기본 배지 중에 재현탁하고, 5μL의 PI를 첨가하여, 흑색의 유리 보텀 96웰 플레이트(Sensoplate, Greiner #655892)에 분주하고, 상기 96웰 플레이트를 30분 정치하였다. 그 후, 상기 웰의 각 웰에 대하여 명시야(BF) 화상 및 GFP/PI의 형광 화상을 취득하였다. PI로 염색된 사세포를 이후의 해석으로부터 제외하였다. 또한, 포커스가 맞지 않은 세포, 타일링의 단부에 위치하여 전체상이 보이지 않는 세포, 다른 세포와 접촉하고 있는 세포에 대해서도, 이후의 해석으로부터 제외하였다. GFP 유래의 형광을 발하는 Club 세포에 대해서, 세포 형태를 계측하였다. 세포 형태의 계측은, BF 화상 데이터에 대하여 실시예 5와 마찬가지로, ImageJ를 사용하여 행하였다(도 23의 B). 도 23의 B는, CD14+ 세포가 CD14- 세포에 비해, 세포의 면적이 유의하게 큰 것을 나타낸다.
이들 결과는, 클러스터 2를 선택하기 위한 상기한 세포 마커 중 적어도 1종(예를 들어 CD14+)에 기초하여 세포를 선택함으로써, 세포 면적이 비교적 큰 클러스터 2에 대응하는 세포를 얻을 수 있는 것을 나타낸다.
(CD14+ 세포의 오르가노이드를 형성)
상기와 같이 하여 얻어진 CD14+ 세포가 오르가노이드를 형성하는 경향이 높은지를 조사하였다. CD14+/- 세포를, 실시예 3과 마찬가지로 하여, 배양 배지(MTEC/B27+「YHF10KNS」+2.5％ Matrigel 2mL) 중에 포함하는 세포 현탁액을, 1웰당 300 세포가 되게 파종하여 9일간 배양하고, 오르가노이드를 형성시켰다(도 24의 A). 도 24의 A는, CD14- 세포에 비해, CD14+ 세포가 보다 큰 오르가노이드를 보다 많이 형성한 것을 나타낸다. CD14+/- 세포를 배양하여 형성되는 세포괴의 비율(CFE[％])도 CD14- 세포에 비해, CD14+ 세포가 유의하게 오르가노이드를 형성하는 경향이 높은 것을 뒷받침하고 있다(도 24의 B).
배양 9일째의 CD14+/- 세포 유래의 오르가노이드에 있어서, 클러스터 2에 대응하는 클럽 세포가 어느 정도 분화되어 있는지를 조사하였다(도 25). 도 25는, CD14+ 세포 및 CD14- 세포가 모두 폐포(Alveolar) 계통의 마커 유전자, 구체적으로는 Sftpc, Ager 및 Hopx의 발현에 대하여 유의차가 없는 것을 나타냈다. 한편, 세기관지(Bronchiolar) 계통의 마커 유전자, 구체적으로는 Sox2(기관지 상피 세포 마커)의 발현에 대해서는, CD14+ 세포에 비해, CD14- 세포가 유의하게 작았다. 또한, Scgb1a1(클럽 세포 마커) 및 Foxj1(섬모 세포 마커)의 발현에 대해서는, CD14+ 세포에 비해, CD14- 세포가 작은 경향을 나타냈다. 이들 결과는, 클러스터 0에 대응하는 CD14- 세포가 클럽 세포로부터 폐포 세포로 분화되는 경향이 높은 것을 나타낸다.
상기한 CD14+/- 세포의 배양 9일째 및 12일째(분화를 유도하기 위해 배양 9일째에 배양 배지를 기본 배지로 치환하여, 3일간 배양함)의 오르가노이드에 대하여, 면역 염색을 행하였다(도 26). 도 26의 A는, 배양 9일째의 오르가노이드가, 클럽 세포 마커인 SCGB1A1 및 AT2 세포 마커인 SFTPC의 양쪽을 공발현하는 세포를 포함하는 것을 나타낸다. 도 26의 B는, 배양 9일째의 오르가노이드가 AT1 마커인 AGER 및 HOPX의 양쪽을 공발현하는 것을 나타낸다. 이들 결과는, 클러스터 2에 대응하는 CD14+ 세포가, 상기 세포에서 유래하는 오르가노이드에 있어서 폐포 계통의 세포로 분화되는 경향이 높은 것을 나타낸다.
[실시예 9] 초대 폐 상피 세포의 폐 상해 모델 마우스에의 이식
CD14+/- 세포가 폐 상해로부터의 회복 과정의 폐에서 증식 가능한지 또는 폐포 세포로 분화 가능한지를 조사하였다.
유전자 재조합 마우스 Scgb1a1-CreER; Rosa26-mTmG로부터, 실시예 8과 마찬가지로 하여, CD14+/- 세포를 회수하고, 상기 CD14- 세포 및 CD14+ 세포를 각각 배양 배지(MTEC/B27+5％ FBS+「YHF10KNS」) 중에 현탁시키고, 배양 배지 75μL당 7,000 세포를 포함하는 CD14+/- 세포 현탁액을 조제하였다. 상기 세포 현탁액을 투여하기 1주일 전에, 흉선 및 T 세포 기능이 결여된 누드 마우스 BALB/cSlc-nu/nu(10주령, 25g 이상)에 3mg/Kg이 되게 블레오마이신을 경비적으로 주입하고, 폐 상해 모델 마우스를 준비하였다. 상기 폐 상해 모델 마우스의 폐에, 상기 세포 현탁액을 기관을 통하여 투여하였다.
상기 세포 현탁액을 투여한 2주일 후에, 상기 폐 상해 모델 마우스를 해부하여, 투여한 상기 세포의 폐에서의 생존 및 증식을 조사하였다(도 27). 상기 조사에는 상기 마우스의 좌폐를 사용하였다. 좌폐를 사용하여 동결 블록을 제작하고, 상기 블록을 마이크로톰을 사용하여 두께 8㎛의 조직 절편으로 하였다. 조직 절편마다의 간격은 약 100㎛였다. 마우스 한마리당 40장의 조직 절편에 있어서, GFP 유래의 형광을 관찰하였다. 투여한 세포의 상기 폐에서의 생존 능력은, 상기 폐에서 확인되는 클러스터의 수(도 27의 A) 및 하나의 클러스터에 포함되는 세포의 수(도 27의 B)에 기초하여 평가하였다. 실시예 9에서는, GFP 유래의 형광을 발하는 세포간의 거리가 100㎛ 이하인 세포 집합을 하나의 클러스터로 정의하였다.
도 27의 A는, CD14+ 세포 및 CD14- 세포가 각각 블레오마이신 상해를 받은 폐에서 생존 가능했던 것을 나타낸다. 도 27의 A는, CD14- 세포에 비해, 유의하게 많은 CD14+ 세포가 상기 폐에서 생존하고 있었던 것을 나타낸다. 도 27의 B는, CD14- 세포 유래의 클러스터에 비해 CD14+ 세포 유래의 클러스터가 유의하게 많은 세포로 구성된 것을 나타낸다. CD14+ 세포를 투여한 마우스의 폐에서는, 염증에서 유래한다고 생각되는 섬유화가 관찰되었다. 한편, CD14- 세포를 투여한 마우스의 폐에서는, CD14+ 세포를 투여한 마우스의 폐에서 관찰된 섬유화에 비해, 경증의 섬유화가 관찰되었다.
투여한 세포의 상기 폐에서의 분화능은, 상기 폐에 있어서 GFP 유래의 형광을 발하는 세포에서의 세포 마커의 발현을 조사함으로써 행하였다. 상기 조사에는 상기 마우스의 우폐를 사용하였다. 동결된 우폐로부터 파라핀 블록을 제작하고, 상기 블록으로부터 두께 6㎛의 조직 절편을 조제하였다. 상기 조직 절편에 대하여 면역 염색을 행하였다. 상기 면역 염색은, CD14+ 세포를 투여한 폐에, GFP를 발현하고, 또한 AT2 세포 마커인 SFTPC를 발현하는 AT2 세포, 및 GFP를 발현하고, 또한 AT1 세포 마커인 PDPN을 발현하는 AT1 세포가 존재하는 것을 나타냈다. 상기 폐에는, 섬모 세포 마커인 AcTub를 발현하는 섬모 세포, 및 기저 세포 마커 AcTub를 발현하는 세포는 관찰되지 않았다. 이들 결과는, 투여한 CD14+ 세포(GFP 양성 세포)가 폐포 계통의 세포인 AT2 세포 및 AT1 세포로 분화된 것을 나타낸다(도 28). 또한, 상기 면역 염색은, CD14+ 세포를 투여한 폐에, GFP를 발현하고, 또한 클럽 세포 마커인 SCGB1A1을 발현하는 클럽 세포, 및 GFP를 발현하고, 또한 섬모 세포 마커인 AcTub를 발현하는 섬모 세포가 존재하는 것을 나타냈다. 이 결과는, 투여한 CD14+ 세포(GFP 양성 세포)가 클럽 세포 마커인 SCGB1A1과, 섬모 세포 마커인 AcTUB를 공발현하고 있었던 점에서, 기관지 계통의 세포인 섬모 세포로도 분화된 것을 나타낸다(도 29).
실시예 9는, 클러스터 0에 대응하는 세포(예를 들어 CD14- 세포)가 송달된 폐에서 염증 등의 악영향을 야기하지 않고, 오르가노이드를 형성하는 능력을 갖고, 그리고 폐포 및 기관지 계통의 세포로 분화되는 능력을 가질 수 있기 때문에, 폐 손상 또는 폐 질환을 수복하기 위한 재생 의료용 조성물로서 유용한 것을 시사한다. 또한, 실시예 9는, 클러스터 2에 대응하는 세포(예를 들어 CD14+ 세포)가 효율적으로 오르가노이드를 형성하는 능력을 갖고, 그리고 폐포 및 기관지 계통의 세포로 분화되는 능력을 갖기 때문에, 폐 손상 또는 폐 질환을 수복하기 위한 재생 의료용 조성물로서 유용한 것을 시사한다. 또한, 클러스터 2에 대응하는 세포(예를 들어 CD14+ 세포)는, 손상된 폐 또는 질환으로 이환된 폐를 수복하기 위한 약제(예를 들어, 유기 화합물, 유전자 또는 단백질)를 운반하기 위한 캐리어로서 유용한 것을 시사한다.

Claims (13)

  1. 폐 상피 세포 또는 폐암 세포를 포함하는 시료를 배양 배지 중에서 배양하는 것을 포함하는, 폐 상피 세포 또는 폐암 세포로부터 오르가노이드를 제조하는 방법이며,
    상기 배양 배지는, 0 내지 10％v/v의 세포외 매트릭스를 포함하고, 및
    케라티노사이트 성장 인자(KGF), 섬유아세포 증식 인자(FGF) 10 및 간세포 성장 인자(HGF)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종과, 뼈 형성 단백질(BMP) 저해제와, TGFβ 저해제의 조합을 포함하고, 그리고
    상기 배양 배지는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조합이, Wnt 시그널 활성화제 및 Rho-키나아제(ROCK) 저해제 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 더 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 조합이,
    KGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합;
    KGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합;
    FGF10과, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합;
    FGF10과, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합;
    HGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합;
    HGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합;
    KGF와, FGF10과, HGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합;
    KGF와, FGF10과, HGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합;
    ROCK 저해제와, KGF와, FGF10과, HGF와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합; 또는
    ROCK 저해제와, KGF와, FGF10과, HGF와, Wnt 시그널 활성화제와, BMP 저해제와, TGFβ 저해제의 조합인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 저해제가 노긴(Noggin)이며, 및/또는
    상기 TGFβ 저해제가 SB431542인, 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Wnt 시그널 활성화제가 CHIR99021이며, 및/또는
    상기 ROCK 저해제가 Y-27632인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료에 포함되는 폐 상피 줄기 세포가, 기저 세포, 클럽 세포, 기관지 폐포 상피 줄기 세포 및 폐포 상피 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 세포종을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료를 상기 배양 배지 중에서 배양하기 전에, 클럽 세포-I, AT2 세포 및 클럽 세포-II 각각에 대하여 표 A에 열기된 세포 마커 그리고 그들의 호몰로그 중 적어도 1종에 기초하여, 상기 시료로부터 클럽 세포-I, AT2 세포 또는 클럽 세포-II를 선택하는 것을 포함하는, 방법:
    Figure pct00012
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 폐 상피 세포 또는 폐암 세포 유래의 오르가노이드.
  9. 내강, 및 상기 내강에 면하는 세포층을 포함하는, 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드이며,
    상기 폐 상피 세포가 폐포 세포이며,
    상기 세포층이,
    AT2 세포로 본질적으로 이루어지거나;
    AT2 세포와, AT2 세포 마커 및 기관지 상피 마커를 발현하는 세포의 조합으로 본질적으로 이루어지거나; 또는
    기관지 상피 마커를 발현하는 세포로 본질적으로 이루어지거나; 혹은
    상기 폐 상피 세포가 기도 세포이며, 상기 세포층이 기저 세포와, 기저 세포 마커 및 기관지 상피 마커를 발현하는 세포의 조합으로 본질적으로 이루어지는, 오르가노이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폐 상피 세포가 폐포 세포이며, 상기 세포층이 AT2 세포로 본질적으로 이루어지고, 상기 AT2 세포가 HT2-280 및 SFTPC 중 어느 한쪽 또는 양쪽을 발현하고, 및 상기 HT2-280이 상기 AT2 세포에 있어서 상기 내강에 면하는 세포막에 혹은 그 근방에 국재하고 있는, 오르가노이드.
  11. 제9항에 있어서, 상기 AT2 세포 마커가 HT2-280 및 SFTPC 중 어느 한쪽 또는 양쪽이며,
    상기 기관지 상피 마커가 SOX2이며, 및/또는
    상기 기저 세포 마커가 KRT5인, 오르가노이드.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드, 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 폐 상피 세포 유래의 오르가노이드, 및/또는 상기 오르가노이드의 세포를 포함하는, 재생 의료용 조성물.
  13. 폐암을 처치하기 위한 물질을 스크리닝하는 방법이며,
    제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 폐암 세포 유래의 오르가노이드와, 피험 물질을 접촉시키는 것,
    상기 피험 물질과의 접촉 후의 오르가노이드를 측정하는 것, 및
    상기 피험 물질과의 접촉 후의 오르가노이드의 측정값과 대조값을 비교하는 것을 포함하는, 방법.
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