CN115094022B - 肺癌成纤维细胞与肺癌类器官共培养模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

肺癌成纤维细胞与肺癌类器官共培养模型的构建方法，包括肺癌/肺成纤维细胞分离，肺癌/肺成纤维细胞的培养、传代和肺癌/肺成纤维细胞‑肺癌/肺类器官共培养三个步骤。主要解决的技术问题是通过分离肺癌患者来源的肺癌成纤维细胞和肿瘤细胞，或者正常肺组织来源的肺成纤维细胞和肺泡细胞，建立快速、简单、有效的肺癌成纤维细胞‑肺癌类器官共培养、肺成纤维细胞‑肺类器官共培养技术；该模型不仅能够更好地模拟患者真实的病理状态，还能为成纤维细胞和肿瘤细胞的相互作用提供研究平台，有利于肺癌/肺纤维化患者的病理机制、药物筛选和新药研发的体外研究。

Description

肺癌成纤维细胞与肺癌类器官共培养模型的构建方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及肺癌成纤维细胞与肺癌类器官共培养模型的构建方法。
背景技术
肺癌作为目前世界范围内公认的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均位居高位，该疾病早期缺乏典型症状，诊断即为晚期，导致其治疗难度增加。除了肿瘤细胞外，存在于肿瘤微环境中的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)也是影响肿瘤的发生、侵袭、转移和治疗抵抗的重要因素。CAFs是一种在肿瘤发生发展初期被异常激活的胞外基质细胞，该细胞主要来源于肿瘤周围组织间质中固有的成纤维细胞，也可以由上皮细胞、内皮细胞或MSC通过一系列信号转化形成。通过分泌多种细胞因子，如TGFβ，IL-6，VEGF等，CAFs不仅可以调控肿瘤的生长，调节微环境中免疫细胞的功能，还能够塑造肿瘤外基质，抑制治疗药物或免疫细胞向肿瘤组织的渗透，因而靶向CAFs的治疗正成为一种新的肿瘤治疗方向，然而由于CAFs的多种不同起源以及不同CAFs亚群存在的高度异质性，其促进肿瘤发生的功能和具体机制也存在巨大差异，这给靶向CAFs的治疗研究带来了巨大挑战。因此，加大对CAFs的细胞分型、相关基因以及通路的研究将为肺癌恶性肿瘤诊治提供一个新的契机。
除了肿瘤之外，成纤维细胞的过度增生还会导致各种不同的纤维化疾病(肝纤维化、肺纤维化)，其中肺纤维化(PF)作为一种慢性进行性肺间质疾病，严重影响着人们的健康和生活，近年来该疾病患病人数明显上升，发病率约为13～20人/10万人，平均生存期只有3～5年，5年生存期仅有30％，因而肺纤维化的危害不亚于肿瘤，甚至比某些肿瘤对生命的威胁程度还要高。目前肺纤维化和肺癌都缺乏有效的治疗手段，预后极差；且由肺纤维化发展为肺癌的患者屡见不鲜，随着肺纤维化患者的病程延长，肺癌的发生几率随之增高，如1年、5年、10年的特发性肺纤维化患者的肺癌发生率分别是3.3％、15.4％和54.7％，揭示了这两种疾病之间存在着密切的关联；尼达尼布(Nintedanib)作为一种最初用于癌症开发的酪氨酸激酶受体抑制剂，近几年也被批准用于治疗特发性肺纤维化(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)；且研究还发现抑癌基因PTEN的表达在a-SMA高表达的成纤维细胞灶中显著降低，这都提示肺纤维化和肺癌这两种疾病之间可能存在一定的联系，且其中成纤维细胞的异常激活就是一个关键因素，至于肺纤维化患者是如何发展为肺癌，其中的病理机制尚不清楚。
总之，成纤维细胞以及CAFs分别通过多种机制影响肺纤维化以及肺癌的发生发展，并对相关疾病的治疗和预后产生了重要的影响。然而到目前为止，关于肺纤维化中成纤维细胞和肺癌中CAFs的研究大多是基于细胞系水平或小鼠模型，细胞系模型缺乏多种细胞间的相互作用，和原组织的生理或病理结构存在巨大差异；基于动物模型的研究又不能完全反应出病人的病理特征和药物反应。因而目前我们对这些疾病中涉及的成纤维细胞以及CAFs的认识依然有限，以CAFs为直接靶点治疗肺癌的临床实验更是少之又少，且目前尚没有成功的临床转化研究；临床上多种耗竭成纤维细胞的新型制剂在肺癌患者的治疗中也是收效甚微。因此，建立新的能够模拟肺纤维化/肺癌患者病理的研究模型以深入解析成纤维细胞在肺纤维化/肺癌发展中的通路及作用机制，对于开发新的肺纤维化/肺癌治疗手段是非常有必要的。
将肺癌/肺成纤维细胞和肺癌/肺类器官进行共培养构建的肺癌或肺纤维化模型，不仅能够保留原始组织的主要细胞组成，而且能够重建细胞间的相互作用，形成一定的组织微环境，与传统的细胞系相比，这种3D共培养的类器官具备更高程度的复杂性、异质性；与动物模型相比，成纤维细胞与类器官共培养模型不仅可以消除不同物种带来的背景差异，还可以提高培养效率，降低培养时间、培养成本等，并且还具备遗传操作和可传代、可冻存的优点，是体外进行肺纤维化/肺癌研究的强有力工具。目前，关于肺癌患者来源的成纤维细胞分离以及肺癌类器官与成纤维细胞的共培养技术尚少见报道。
发明内容
本发明的目的是提供肺癌成纤维细胞与肺癌类器官共培养模型的构建方法，主要解决的技术问题是通过分离肺癌患者来源的肺癌成纤维细胞和肿瘤细胞，或者正常肺组织来源的肺成纤维细胞和肺泡细胞，建立快速、简单、有效的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官共培养、肺成纤维细胞-肺类器官共培养技术，该模型不仅能够更好地模拟来源组织真实的病理/生理状态，还能为成纤维细胞和肿瘤细胞的相互作用提供研究平台，有利于肺癌/肺纤维化患者的病理机制、药物筛选和新药研发的体外研究。
本发明的肺癌成纤维细胞与肺癌类器官共培养模型的构建方法包括肺癌/肺成纤维细胞分离，肺癌/肺成纤维细胞的培养、传代和肺癌/肺成纤维细胞-肺癌/肺类器官共培养三个步骤。
所述的肺癌/肺成纤维细胞分离的方法为：
去除肺癌组织中的的血管、脂肪和筋膜，制成处理组织；将处理组织用生理盐水中清洗3遍后，置于冰上，并将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态，当观察到明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；将获得的消化后物料用100um滤膜过滤，将过滤后的滤膜下物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得肺癌成纤维细胞；
或者为：将肺癌积液在800g条件下离心10min；离心后的物料去除上清液，剩余的浆料用PBS洗涤3次；洗涤完成后的物料进行红细胞裂解，裂解后的物料，去除上清液后用PBS重悬，获得肺癌成纤维细胞。
上述方法中，选用正常肺组织，获得肺成纤维细胞。
上述方法中，人肺癌组织/正常肺组织预先保存于组织保存液中。
上述方法中，用手术剪和镊子分离去除其中的血管、脂肪和筋膜。
上述方法中，消化液为质量浓度0.25％的trypsin消化液，或者为IV型胶原酶消化液。
上述方法中，剪成组织小块的尺寸为1～2mm3。
上述方法中，重悬组织的消化液用量根据剪切前组织的重量而定，1g组织的消化液用量为3～5ml。
上述方法中，加入HBSS时HBSS的加入量为消化液体积的3～4倍。
上述方法中，进行晃动孵育时，每隔30min用枪头吹散组织小块。
上述方法中，离心速度为1200rpm，离心时间3min。
上述方法中，用PBS洗涤是用PBS将细胞重悬，在300g条件下离心3min，收集细胞沉淀作为洗涤完成后的物料。
上述方法中，红细胞裂解时，采用的红细胞裂解液的用量按1g洗涤完成后的物料使用3～5ml，在室温消化3～5min。
所述的肺癌/肺成纤维细胞的培养和传代的方法为：
(1)准备培养基一；培养基一组分包括DMEM basic基础培养基、质量浓度为10～15％的FBS、质量浓度为1％的Glutamax、质量浓度为1％的MEM NEAA和质量浓度为1％的P/S；
(2)将肺癌/肺成纤维细胞分离方法获得的成纤维细胞进行计数后，按照50～200万个细胞重悬在培养基一中，再转移至培养皿中进行贴壁培养，培养4～6天后更换新鲜的培养基一；
(3)当培养皿中的细胞汇合率至80～90％时，将培养基一吸走，向皿中加入胰蛋白酶消化液消化细胞，在37℃培养箱孵育3～5min后，加入胰蛋白酶消化液体积3～5倍的新鲜培养基一终止消化，在离心速度1200rpm条件下离心3min后，收集细胞沉淀，用培养基一重悬细胞并转移至培养皿中进行贴壁培养，每3～4天更换新鲜的培养基一。
上述的步骤(3)中，消化细胞所用的是质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液，用量按每个培养皿加500ul胰蛋白酶消化液；所用的培养皿为3.5cm培养皿。
上述的步骤(3)中，肺癌/肺成纤维细胞的传代比例为1∶(3～5)。
上述的步骤(2)和步骤(3)中，所用的培养皿前用质量浓度为0.1～0.2％的Gelatin溶液或者用DMEF/12培养基稀释的体积浓度为1～2％的matrigel包被培养皿，并置于培养箱中在37℃孵育0.5～2h。
上述的步骤(2)和步骤(3)中，培养基一中添加终浓度为10uM的Y-27632促进肺癌/肺成纤维细胞的存活。
上述的步骤(2)和步骤(3)中，培养基一中添加终浓度为5～10ng/ml的TGFB1和浓度为5～20ng/ml的human FGF2促进肺癌/肺成纤维细胞的增殖。
所述的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官共培养方法为：
(a)准备培养基二；培养基二组分包括DMEM/F12基础培养基、浓度为1x的N2、浓度为1x的B27、质量浓度为1％的P/S、质量浓度为1％的Glutamax、浓度为0.2～1μM的monothioglycerol、浓度为1～10μM的CHIR99021、浓度为300～1000ng/ml的R-spondin-1、浓度为1～50ng/ml的human FGF10、浓度为1～50ng/ml的human KGF、浓度为20～100nM的dexamethasone(地塞米松)、浓度为0.05～0.3mM的8-bromo-cAMP(环磷酸腺苷)、浓度为0.05～0.3mM的IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)，浓度为5～20ng/ml的BMP4和浓度为20～100nM的all-trans retinoic acid；
(b)用培养基二培养至密度为70％～80％的肺癌类器官，然后将培养基二吸走，加入1ml TrypLE，在37℃培养箱中孵育5～10min；再加入3ml DMEM/F12终止消化；将消化后的肺癌类器官在转速1200rpm条件下离心3min，然后收集细胞沉淀并用1ml培养基二重悬，进行细胞计数；
(c)用培养基一培养至密度为80％～90％的肺癌成纤维细胞，然后将培养基一吸走，加入0.5ml质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液，在37℃培养箱中孵育3～5min，加入3ml培养基一终止消化，将消化后的肺癌成纤维细胞在转速1200rpm条件下离心3min，收集细胞沉淀并用1ml培养基一重悬，进行细胞计数；
(d)将DMEM/F12和matrigel按体积比1∶(1～1.5)进行混合，将混合均匀后的混合液加至24孔板中，每个孔加入300ul混合液，拍打培养板使混合液覆盖整个孔底部；然后将24孔板置于37℃培养箱中孵育20～30min，使混合液凝固，获得覆盖有凝固体的培养板；
(e)将计数之后的肺癌类器官和肺癌成纤维细胞混合，在转速1200rpm条件下离心3min后收集细胞沉淀，用培养基二将细胞重悬，再转移至覆盖有凝固体的培养板中；摇晃培养板使细胞分布均匀，然后将培养板置于37℃和5％CO2浓度下培养3～7天，获得肺癌成纤维细胞-肺癌类器官共培养模型；
(f)肺癌成纤维细胞-肺癌类器官共培养模型用于病理鉴定或进行传代维持。
上述的步骤(b)中所用的类器官选用正常肺组织来源的肺类器官，步骤(c)中所用的成纤维细胞选用正常肺组织来源的肺成纤维细胞，可用于构建肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型，模拟肺纤维化疾病。
上述的步骤(b)中，肺癌类器官培养在6cm培养皿中，加入TrypLE后用枪头将肺癌类器官吹散，消化至形成小团块，每个小团块含3～10个细胞。
上述的步骤(c)中，肺癌成纤维细胞培养在3.5cm培养皿中，加入胰蛋白酶后将细胞重悬，用枪头将肺癌成纤维细胞吹散为单细胞。
上述的步骤(b)中，所用的肺癌类器官为肺癌患者肿瘤组织来源的肺癌类器官，或者为肺癌患者积液来源的肺癌类器官。
上述的步骤(c)中，所用的肺癌成纤维细胞为肺癌患者肿瘤组织来源的肺癌成纤维细胞，或者为肺癌患者积液来源的肺癌成纤维细胞。
上述的步骤(e)中，肺癌类器官的细胞数为3×104～10×105，肺癌成纤维细胞的细胞数为肺癌类器官细胞数的5-10倍。
从肺癌患者的肿瘤组织以及积液中提取分离肺癌成纤维细胞的方法目前未见报道；肺癌类器官与肺癌成纤维细胞的共培养技术也同样尚未被报道，本发明所建立的人肺癌/肺成纤维细胞培养技术以及肺癌成纤维细胞-肺癌类器官共培养模型和肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型，不仅可以简化实验操作，缩短周期，还可以补强现有肺癌/肺纤维化动物、细胞模型的短板，为肺癌/肺纤维化的疾病模拟、药物筛选和新药研发提供有利的支持。
本发明研究模型具体特点如下：从肺癌患者分离的肿瘤成纤维细胞，更好的保留了患者的病理特征，且分离方法简单；利用患者来源的组织构建的肺癌/肺纤维化共培养模型，便于监测肿瘤细胞与成纤维细胞的相互作用，还丰富了细胞的培养环境，打破动物模型中物种差异和永生化细胞异质性缺失等技术壁垒；肺成纤维细胞-肺类器官共培养模式，能够更好的模拟原始组织的生长环境，更好的模拟细胞间相互作用。
附图说明
图1为肺癌成纤维细胞与肺癌类器官共培养模型的构建方法的技术路线图；
图2为本发明实施例1中的肺癌患者肿瘤组织来源的肺癌成纤维细胞光镜图；
图3为本发明实施例2中的肺癌患者积液来源的肺癌成纤维细胞光镜图；
图4为本发明实施例中3的肺癌患者肿瘤组织来源的肺癌成纤维细胞传代培养后的光镜图；
图5为本发明实施例4中的肺癌患者积液来源的肺癌成纤维细胞传代培养后光镜图；
图6为本发明实施例5中的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官的共培养模型的光镜图；
图7为本发明实施例6中的肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型的光镜图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种肺癌患者肿瘤组织来源的肺癌成纤维细胞分离方法，包括以下步骤：
步骤1：去除组织中的血管、脂肪和筋膜，制成处理组织；
步骤2：将处理组织用生理盐水中清洗3遍后，置于冰上，并将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态；
步骤3：当观察到组织结构松散，有明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；
步骤4：将获得的消化后物料用100um滤膜过滤，将过滤后的滤膜下物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得肺癌成纤维细胞，于培养基一中贴壁培养，肺癌成纤维细胞的形态如图2所示。
上述的步骤1中，组织为人肺癌组织，预先保存于组织保存液中；用手术剪和镊子分离去除其中的血管、脂肪和筋膜。
上述的步骤2中，剪成组织小块的尺寸为1～2mm3，消化液为质量浓度0.25％的trypsin消化液；重悬组织的消化液用量按1g组织的消化液用量为3-5ml。
上述的步骤3中，加入HBSS时HBSS的加入量为消化液体积的3-4倍。
上述的步骤4中，过滤后的离心速度为1200rpm，离心时间3min；培养基一为包括DMEM basic基础培养基、质量浓度为10～15％的FBS、质量浓度为1％的Glutamax、质量浓度为1％的MEM NEAA和质量浓度为1％的P/S的组分。
实施例2
本实施例提供一种肺癌患者积液来源的肺癌成纤维细胞分离方法，包括以下步骤：
步骤1：将肺癌积液在800g条件下离心10min；
步骤2：离心后的物料去除上清液，剩余的浆料用PBS洗涤3次；
步骤3：洗涤完成后的物料进行红细胞裂解，裂解后的物料在1200rpm条件下离心3min，去除上清液后用PBS重悬，获得肺癌成纤维细胞；
步骤4：将获得的肺癌成纤维细胞于培养基一中贴壁培养，肺癌成纤维细胞的形态如图3所示。
上述的步骤2中，用PBS洗涤是用PBS将细胞重悬，在300g条件下离心3min，收集细胞沉淀。
上述的步骤3中，红细胞裂解液的用量和裂解时间为5ml，在室温消化5min。
上述的步骤4中，培养基一为包括DMEM basic基础培养基、质量浓度为10～15％的FBS、质量浓度为1％的Glutamax、质量浓度为1％的MEM NEAA和质量浓度为1％的P/S的组分。
实施例3
本实施例提供一种肺癌患者肿瘤组织来源的肺癌成纤维细胞传代方法，包括以下步骤：
步骤1：当培养皿中的肺癌成纤维细胞汇合率至95％时，将培养基一吸走，向皿中加入胰蛋白酶消化细胞，在37℃培养箱孵育5min；
步骤2：消化完成后加入3倍的新鲜培养基一终止消化，1200rpm离心3min后，收集细胞沉淀，用培养基一重悬细胞并转移至培养皿中进行贴壁培养，每3-4天更换新鲜的培养基一。传代后的成纤维细胞形态如图4所示。
上述的步骤1中培养皿为3.5cm皿；肺癌成纤维细胞为肿瘤组织来源的肺癌成纤维细胞。
上述的步骤2中消化细胞所用的是质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液，用量是500ul；肺癌成纤维细胞的传代比例为1∶3。
上述步骤1和步骤2中所用的培养皿都需要提前用质量浓度为质量浓度为2％的matrigel包被，并置于培养箱中在37℃孵育1h。
上述的步骤2中的培养基一中添加终浓度为10uM的Y-27632促进肺癌成纤维细胞的存活。
实施例4
本实施例提供一种肺癌患者肿瘤积液来源的肺癌成纤维细胞传代方法，方法同实施例3，传代后的肺癌成纤维细胞形态如图5所示，不同点在于：
上述的步骤1中，肺癌成纤维细胞为肺癌患者积液来源的肺癌成纤维细胞，肺癌成纤维细胞传代之前的回合密度为90％。
上述的步骤2中消化细胞所用的时间为3min；肺癌成纤维细胞的传代比例为1∶3。
实施例5
本实施例提供一种肺癌成纤维细胞-肺癌类器官共培养的方法，包括以下步骤：
步骤1：培养密度为80％的肺癌类器官，将培养基二吸走后，加入1ml TrypLE，在37℃培养箱中孵育8min，加入3ml DMEM/F12终止消化后，1200rpm离心3min，收集细胞沉淀并用1ml培养基二重悬，进行细胞计数。
步骤2：培养密度为90％的肺癌成纤维细胞，将培养基一吸走后，加入0.5ml质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液，在37℃培养箱中孵育4min，加入3ml培养基一终止消化后，1200rpm离心3min，收集细胞沉淀并用1ml培养基一重悬，进行细胞计数。
步骤3：将DMEM/F12和matrigel按1∶1进行混合，混合均匀后将混合液加至24孔板中，每个孔加入300ul混合液，轻轻拍打培养板使混合液充分覆盖整个孔底部，将24孔板置于37℃培养箱中孵育30min，使混合液凝固。
步骤4：将计数之后的肺癌类器官和肺癌成纤维细胞混合，肺癌类器官和肺癌成纤维细胞的比例为1∶5，类器官数为3x104，1200rpm离心3min后收集细胞沉淀，用培养基二将细胞重悬后，转移至步骤3中的培养板中，轻轻摇晃培养板使细胞分布均匀后，将培养板置于37℃、5％CO2浓度下培养。培养4天的肺癌成纤维细胞与肺癌类器官共培养结果如图6所示。
上述的步骤2中的肺癌成纤维细胞为肺癌患者肿瘤组织来源的肺癌成纤维细胞。
上述步骤1和步骤3中的培养基二组分包括：DMEM/F12基础培养基、浓度为1x的N2、浓度为1x的B27、质量浓度为1％的P/S、质量浓度为1％的Glutamax、浓度为0.2～1μM的monothioglycerol、浓度为1～10μM的CHIR99021、浓度为300～1000ng/ml的R-spondin-1、浓度为1～50ng/ml的human FGF10、浓度为1～50ng/ml的human KGF、浓度为20～100nM的dexamethasone(地塞米松)、浓度为0.05～0.3mM的8-bromo-cAMP(环磷酸腺苷)、浓度为0.05～0.3mM的IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)，浓度为5～20ng/ml的BMP4和浓度为20～100nM的all-trans retinoic acid。
上述步骤1中的肺癌类器官培养在6cm培养皿中，加入TrypLE后用枪头将类器官吹散，消化至含3-10个细胞的小团块。
上述步骤2中的肺癌成纤维细胞培养在3.5cm皿中，加入胰蛋白酶消化液后将细胞重悬，吹散为单细胞。
实施例6
本实施例提供一种肺成纤维细胞与肺类器官共培养的方法，方法同实施例5，不同点在于：
步骤1中的类器官为正常肺组织来源的肺类器官。
步骤1中的消化时间为10min。
步骤2中的成纤维细胞为正常肺来源的肺成纤维细胞，消化时间为3min。
步骤4中肺类器官和肺成纤维细胞的比例为1∶10，类器官数为3x105。
培养6天的肺成纤维细胞与肺类器官共培养结果如图7所示。

Claims (7)

1.一种肺癌成纤维细胞-肺癌类器官或者肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型的构建方法，其特征在于包括肺癌/肺成纤维细胞分离，肺癌/肺成纤维细胞的培养、传代，肺癌成纤维细胞-肺癌类器官或者肺成纤维细胞-肺类器官共培养三个步骤；
所述的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官或者肺成纤维细胞-肺类器官共培养方法为：
(a)准备培养基二；培养基二组分包括DMEM/F12基础培养基、浓度为1×的N2、浓度为1×的B27、质量浓度为1％的P/S、质量浓度为1％的Glutamax、浓度为0.2～1μM的monothioglycerol、浓度为1～10μM的CHIR99021、浓度为300～1000ng/ml的R-spondin-1、浓度为1～50ng/ml的human FGF10、浓度为1～50ng/ml的human KGF、浓度为20～100nM的dexamethasone(地塞米松)、浓度为0.05～0.3mM的8-bromo-cAMP(环磷酸腺苷)、浓度为0.05～0.3mM的IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)，浓度为5～20ng/ml的BMP4和浓度为20～100nM的all-trans retinoic acid；
(b)用培养基二培养制成密度为70％～80％的肺癌/肺类器官，然后将培养基二吸走，加入1ml TrypLE，在37℃培养箱中孵育5～10min；再加入3ml DMEM/F12终止消化；将消化后的肺癌/肺类器官在转速1200rpm条件下离心3min，然后收集细胞沉淀并用1ml培养基二重悬，进行细胞计数；
(c)用培养基一培养至密度为80％～90％的肺癌/肺成纤维细胞，然后将培养基一吸走，加入0.5ml质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液，在37℃培养箱中孵育3～5min,加入3ml培养基一终止消化，将消化后的肺癌/肺成纤维细胞在转速1200rpm条件下离心3min,收集细胞沉淀并用1ml培养基一重悬，进行细胞计数；
(d)将DMEM/F12和matrigel按体积比1﹕(1～1.5)进行混合，将混合均匀后的混合液加至24孔板中，每个孔加入300ul混合液，拍打培养板使混合液覆盖整个孔底部；然后将24孔板置于37℃培养箱中孵育20～30min，使混合液凝固，获得覆盖有凝固体的培养板；
(e)将计数之后的肺癌/肺类器官和肺癌/肺成纤维细胞混合，肺癌/肺类器官和肺癌/肺成纤维细胞的细胞数目比为1﹕(5～10)，肺癌/肺类器官数为3×104～10×105，在转速1200rpm条件下离心3min后收集细胞沉淀，用培养基二将细胞重悬，再转移至覆盖有凝固体的培养板中；摇晃培养板使细胞分布均匀，然后将培养板置于37℃和5％CO2浓度下培养3～7天，获得肺癌成纤维细胞-肺癌类器官或者肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型。
2.根据权利要求1所述的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官或者肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型的构建方法，其特征在于所述的肺癌成纤维细胞分离的方法为：
去除肺癌组织中的血管、脂肪和筋膜，制成处理组织；将处理组织用生理盐水中清洗3遍后，置于冰上，并将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态，当观察到组织结构松散，有明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；将获得的消化后物料用100um滤膜过滤，将过滤后的滤膜下物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得肺癌成纤维细胞；
或者为：将肺癌积液在800g条件下离心10min；离心后的物料去除上清液，剩余的浆料用PBS洗涤3次；洗涤完成后的物料进行红细胞裂解，裂解后的物料,去除上清液后用PBS重悬，获得肺癌成纤维细胞；
所述的肺成纤维细胞分离的方法为：去除肺组织中的血管、脂肪和筋膜，制成处理组织；将处理组织用生理盐水中清洗3遍后，置于冰上，并将处理组织剪成组织小块；用消化液将组织小块重悬，再置于培养箱中，在37℃晃动孵育50～120min，并观察细胞消化状态，当观察到组织结构松散，有明显可见的细胞漏出后，向组织小块中加入HBSS终止消化；将获得的消化后物料用100um滤膜过滤，将过滤后的滤膜下物料离心，收集离心获得的细胞沉淀，获得肺成纤维细胞。
3.根据权利要求1所述的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官或者肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型的构建方法，其特征在于所述的肺癌/肺成纤维细胞的培养和传代的方法为：
(1)准备培养基一；培养基一组分包括DMEM basic基础培养基、质量浓度为10～15％的FBS、质量浓度为1％的Glutamax、质量浓度为1％的MEM NEAA和质量浓度为1％的P/S；
(2)将肺癌/肺成纤维细胞分离方法获得的肺癌/肺成纤维细胞进行计数后，按照50～200万个细胞重悬在培养基一中，再转移至培养皿中进行贴壁培养，培养4～6天后更换新鲜的培养基一；
(3)当培养皿中的细胞汇合率至80～90％时，将培养基一吸走，向皿中加入胰蛋白酶消化液消化细胞，在37℃培养箱孵育3～5min后，加入胰蛋白酶体积3～5倍的新鲜培养基一终止消化，在离心速度1200rpm条件下离心3min后，收集细胞沉淀，用培养基一重悬细胞并转移至培养皿中进行贴壁培养，每3～4天更换新鲜的培养基一。
4.根据权利要求3所述的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官或者肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型的构建方法，其特征在于步骤(3)中，消化细胞所用的是质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液，用量按每个培养皿加500ul胰蛋白酶消化液；所用的培养皿为3.5cm培养皿。
5.根据权利要求3所述的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官或者肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型的构建方法，其特征在于步骤(3)中，肺癌/肺成纤维细胞的传代比例为1﹕(3～5)。
6.根据权利要求1所述的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官或者肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型的构建方法，其特征在于步骤(b)中，肺癌/肺类器官培养在6cm培养皿中，加入TrypLE后用枪头将肺癌/肺类器官吹散，消化至形成小团块，每个小团块含3～10个细胞。
7.根据权利要求1所述的肺癌成纤维细胞-肺癌类器官或者肺成纤维细胞-肺类器官共培养模型的构建方法，其特征在于步骤(c)中，肺癌/肺成纤维细胞培养在3.5cm培养皿中，加入胰蛋白酶消化液后将细胞重悬，用枪头将肺癌/肺成纤维细胞吹散为单细胞。
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