CN115521912A - 一种以类器官与t细胞共培养的免疫细胞治疗方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，至少包括以下步骤：S1.类器官培养和传代：取肝癌的肿瘤组织，在体外培养成肝癌类器官，并扩增类器官，观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代；S2.T细胞分选：取病人的外周血，分离其中的PBMC，从PBMC中分选T细胞，并在体外进行培养和扩增；S3.免疫共培养：类器官和T细胞按照一定的比例混合，接种至培养板中共培养，并观察一段时间。所述S3中类器官和T细胞的数目比为(5‑15)：1。本发明能够完整地展示共培养中T细胞聚集在肿瘤类器官上的过程，可清晰的观察到T细胞杀伤肿瘤的过程。

Description

一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及IPC分类号C12N5/0783，更具体涉及一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法及应用。
背景技术
针对肿瘤治疗的评价模型通常包括2D细胞模型和动物模型，但是由于肿瘤的微环境复杂，而2D细胞模型为单一细胞系，不能很好的体现肿瘤的特性。动物模型为病人来源异种移植肿瘤模型(patient-derived xenografts,PDX)，它将新鲜的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内，因为PDX模型保留了肿瘤微环境，肿瘤的遗传特性和组织特征也得到了保留，能够反映肿瘤的发生发展机制，从而能更好体现临床的治疗效果。专利CN202011431738.5公开了一种稳定高效的PDX肿瘤模型建模方法，提高了现有PDX肿瘤模型建模方法的成功率，但是该方法较为复杂，成本和难度均较高。
类器官(Organoid)是目前国际领先的肿瘤个体药效学检测的最新方法，即以患者手术切除或活检的原代肿瘤组织在体外培养成类器官，重现组织或器官的结构，可以在体外条件下模拟器官的功能。进而对不同的治疗药物或方案进行药效学检测，筛选出最优的治疗方案作为重要参考，明显提高临床治疗的有效性，使用类器官作为体外细胞治疗模型，可以大幅度缩短临床前试验周期，降低临床试验失败的危险系数。此外还能够在体外模拟免疫细胞与肿瘤在体内的相互作用，动态观察体外免疫细胞治疗的疗效，是针对个体病人预测免疫细胞治疗疗效的全新选择。专利CN202010956473.4公开了一种结直肠癌类器官免疫微环境重构的方法，通过将新鲜结直肠癌组织和外周血来源的CD3+T细胞共培养获得了类器官免疫微环境，结果显示免疫细胞对CRC类器官有明显的杀伤能力，为临床自体T细胞回输的免疫治疗提供体外实验依据。然而针对肝癌类器官与T细胞进行共培养的治疗方法，目前还少有报道。
发明内容
针对上述提到的技术问题，本发明一方面提供了一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，至少包括以下步骤：
S1.类器官培养和传代：取肝癌的肿瘤组织，在体外培养成肝癌类器官，并扩增类器官，观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代；
S2.T细胞分选：取病人的外周血，分离其中的PBMC，从PBMC中分选T细胞，并在体外进行培养和扩增；
S3.免疫共培养：类器官和T细胞按照一定的比例混合，接种至培养板中共培养，并观察一段时间。
所述S3中类器官和T细胞的数目比为(5-15)：1。
优选地，所述S3中类器官和T细胞的数目比为10：1。
本发明中的消化液成分为：DMEM/F12+2％青霉素/链霉素+0.1mg/mL庆大霉素+0.6％制酶菌素+2mg/mL胶原蛋白酶A+0.096mg/mL透明质酸酶。
本发明中类器官培养用到的培养基的成分如下：advanced DMEM/F12,HEPES(1:100),GlutaMAX(1:100),B27(1:50),100ng/mL A83-01,50ng/mL EGF,100ng/mLNoggin,500ng/mL commercial R-spondin1。
本发明中传代培养中用到的培养基成分为：conditioned R-spondin1 mediumfrom RSPO cells(Cultrex,3700-100-01)，100ng/mL Nrg1,10mM Y-27632。
本发明中清洗液为1xPBS/5％FCS，不加特殊说明的话，本发明中洗涤用的试剂均为1xPBS/5％FCS。
在一些实施方式中，所述S1中类器官培养至少包括以下步骤：
1)取肝癌的肿瘤组织，用剪刀处理成0.1mm3的大小，然后加入消化液在37℃连续摇晃孵育0.5～1h，每隔15min手动摇晃混合一次；
2)待消化完全，将组织/细胞在温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清，加入2mg/mL DNasel，37℃孵育5min；
3)用1xPBS/5％FCS清洗组织/细胞；
4)加入0.25％胰蛋白酶/EDTA，37℃孵育2min；
5)加入DNasel，37℃孵育5min；
6)温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
7)用5％FC/PBS清洗组织/细胞。
8)加入红细胞在冰上裂解细胞3min。
9)温度4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
10)用1xPBS/5％FCS清洗组织/细胞。
11)用红细胞裂解缓冲液处理之后，组织/细胞通过40μm流式管过滤，并用1xPBS/5％FCS清洗获得单细胞悬液。
12)将最后一次清洗的组织/细胞计数，温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
13)取matrigel在冰上重悬细胞，将细胞与matrigel混合均匀，并取10μL细胞与matrigel混合液移至48孔板中央，避免气泡产生，37℃孵育5min，待matrigel凝固；
14)每孔加250μL类器官培养基37℃培养，约4～5天单细胞长成类器官，进行传代和冻存。
镜下观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代。
在一些实施方式中，所述S2类器官传代至少包括以下步骤：
(b1)用移液枪吸掉孔内培养液，需注意不要将matrigel吸走；
(b2)每孔加200μl的tryple，吹打多次，放入37℃的培养箱中消化5-10min，将类器官消化为单细胞；
(b3)待消化完成后，每孔加200μl Advanced DMEM/F12稀释tryple终止消化；
(b4)将单细胞在温度为4℃、转速为1500rpm下离心5min，弃上清；
(b5)取matrigel在冰上重悬细胞，将细胞与matrigel混合均匀，并取10μl细胞与matrigel混合液移至48孔板中央，避免气泡产生，37℃孵育5min，待matrigel凝固，每孔加250μl培养基37℃培养。
在一些实施方式中，本发明中所述tryple指的是TrypLETM Express酶。
在一些实施方式中，所述S2中T细胞分选的步骤包括：
(c1)将血液与Hank’s Buffer轻轻混合；
(c2)将混合后的血液沿壁缓慢加入到淋巴细胞分离液的上层，然后离心，得到分层；
(c3)从分层中吸取PBMC层，清洗后并计数；
(c4)使用试剂盒富集T细胞；
(c5)将T细胞计数，并加入T细胞培养基进行培养和扩增。
在一些实施方式中，所述血液与Hank’s Buffer为等体积。
在一些实施方式中，所述淋巴细胞分离液为LymphoprepTM(STEMCELL,CATO7851)。
在一些实施方式中，所述(c2)中离心的条件为：室温，转速为1200-1800r/min，时间为20-30min。
优选地，所述(c2)中离心的条件为：室温，转速为1500r/min，时间为25min。
在一些实施方式中，所述(c4)中的试剂盒为CD3 MicroBeads,human。
优选地，所述CD3 MicroBeads,human的品牌为美天旎。
在一些实施方式中，所述T细胞培养基为加入IL-2、IFN-γ、人CD3/CD28/CD2T细胞激活剂的ImmunoCultTM-XF T细胞扩增培养基。
在一些实施方式中，所述S3中免疫共培养的步骤包括：
(d1)类器官处理：取长势良好的肿瘤类器官，加入Tryple进行消化，消化完成后，用无血清培养基终止消化，转移至离心管中，计数；
(d2)免疫细胞处理：用移液枪轻轻吹打T细胞重悬后，转移至离心管中，用移液枪吹打混匀，计数；
(d3)根据计数结果，将T细胞与类器官按照一定比例混合，并用移液枪吹打使其混合均匀，离心后去除上清，将细胞沉淀置于冰上，并加入溶化的基质胶，用移液枪反复吹打混匀，然后吸取含细胞的基质胶，并接种至培养板的孔内，在37℃条件下孵育3-7min，使基质胶凝固；
(d4)孵育完成后，加入培养基后放入培养箱内培养。
在一些实施方式中，所述基质胶为Matrigel。
在一些实施方式中，所述S3中培养板包括48孔板或96孔板。
优选地，所述S3中培养板为48孔板。
在一些实施方式中，所述接种至培养板的密度为(0.5-1.5)×104个/孔。
优选地，所述接种至培养板的密度为1×104个/孔。
在一些实施方式中，所述(d1)步骤消化的时间为5-15min。
优选地，所述(d1)步骤消化的时间为10min。
在一些实施方式中，所述(d1)步骤中的无血清培养基为Advanced DMEM/F12。
在一些实施方式中，所述(d3)步骤中离心的条件为4℃，转速为1000r/min，时间为5min。
本发明的另一方面提供了一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法的应用，用于医学基础研究、药企药物筛查以及临床肿瘤治疗的用药指导。
有益效果：
(1)本发明以类器官为肿瘤免疫治疗的模型，建立了肝癌类器官与T细胞共培养的方法，设计了评估T细胞治疗效果的体系；
(2)本发明为T细胞免疫治疗的研究提供了更优的模型，保留了肿瘤的微环境，使肿瘤保留了原始的特性，通过免疫细胞和类器官的共培养体系模拟了免疫细胞与肿瘤在体内的相互作用，更好地反映了T细胞治疗肿瘤的过程、疗效和机制，对个体病人预测免疫细胞治疗的疗效；
(3)本发明完整地展示了共培养中T细胞聚集在肿瘤类器官上的过程，可清晰的观察到T细胞杀伤肿瘤的过程；
(4)本发明通过特定的培养条件对T细胞进行培养，能够使T细胞成团生长，且细胞状态优异，生长速度较快；
(5)本发明采用肝癌类器官与T细胞共培养，由实施例和对照例的结果可知加入T细胞后类器官的生长变慢，体积变小，且数量减少，表明T细胞能够成功杀伤肿瘤的作用。
附图说明
图1和图2是实施例1中分别培养2天和4天的T细胞生长示意图；
图3是实施例1-3与对照例1培养11天的类器官生长曲线；
图4是实施例1-3与对照例1-2在培养8-11天内的类器官的相对数量；
图5是实施例1分别在培养0天和培养8天后的类器官生长局部示意图；
图6是实施例2分别在培养0天和培养11天后的类器官生长局部示意图；
图7是实施例3分别在培养0天和培养11天后的类器官生长局部示意图；
图8是对照例1分别在培养0天和培养11天后的类器官生长局部示意图；
图9是对照例2分别在培养0天和培养11天后的类器官生长局部示意图。
具体实施方式
实施例
本发明的实施例中的消化液成分为：DMEM/F12+2％青霉素/链霉素+0.1mg/mL庆大霉素+0.6％制酶菌素+2mg/mL胶原蛋白酶A+0.096mg/mL透明质酸酶。
本发明的实施例中类器官培养用到的培养基的成分如下：advanced DMEM/F12,HEPES(1:100),GlutaMAX(1:100),B27(1:50),100ng/mL A83-01,50ng/mL EGF,100ng/mLNoggin,500ng/mL commercial R-spondin1。
本发明的实施例中传代培养中用到的培养基成分为：conditioned R-spondin1medium from RSPO cells(Cultrex,3700-100-01)，100ng/mL Nrg1,10mM Y-27632。
本发明的实施例中清洗液为1xPBS/5％FCS，不加特殊说明的话，本发明的实施例中洗涤用的试剂均为1xPBS/5％FCS。
实施例1
一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，包括以下步骤：
S1.类器官培养和传代：取肝癌的肿瘤组织，在体外培养成肝癌类器官，并扩增类器官，观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代；
S2.T细胞分选：取病人的外周血，分离其中的PBMC，从PBMC中分选T细胞，并在体外进行培养和扩增；
S3.免疫共培养：类器官和T细胞按照10：1的数目比混合，接种至培养板中共培养，并观察一段时间。
所述S1中类器官培养包括以下步骤：
1)取肝癌的肿瘤组织，用剪刀处理成0.1mm3的大小，然后加入消化液在37℃连续摇晃孵育0.5～1h，每隔15min手动摇晃混合一次；
2)待消化完全，将组织/细胞在温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清，加入2mg/mL DNasel，37℃孵育5min；
3)用1xPBS/5％FCS清洗组织/细胞；
4)加入0.25％胰蛋白酶/EDTA，37℃孵育2min；
5)加入DNasel，37℃孵育5min；
6)温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
7)用5％FC/PBS清洗组织/细胞；
8)加入红细胞在冰上裂解细胞3min；
9)温度4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
10)用1xPBS/5％FCS清洗组织/细胞。
11)用红细胞裂解缓冲液处理之后，组织/细胞通过40μm流式管过滤，并用1xPBS/5％FCS清洗获得单细胞悬液。
12)将最后一次清洗的组织/细胞计数，温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
13)取matrigel在冰上重悬细胞，将细胞与matrigel混合均匀，并取10μL细胞与matrigel混合液移至48孔板中央，避免气泡产生，37℃孵育5min，待matrigel凝固；
14)每孔加250μL类器官培养基37℃培养，约4～5天单细胞长成类器官，进行传代和冻存。
镜下观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代。
所述S1类器官传代包括以下步骤：
(b1)用移液枪吸掉孔内培养液，需注意不要将matrigel吸走；
(b2)每孔加200μl的tryple，吹打多次，放入37℃的培养箱中消化5-10min，将类器官消化为单细胞；
(b3)待消化完成后，每孔加200μl Advanced DMEM/F12稀释tryple终止消化；
(b4)将单细胞在温度为4℃、转速为1500rpm下离心5min，弃上清；
(b5)取matrigel在冰上重悬细胞，将细胞与matrigel混合均匀，并取10μl细胞与matrigel混合液移至48孔板中央，避免气泡产生，37℃孵育5min，待matrigel凝固，每孔加250μl培养基37℃培养。
本实施例中所述tryple指的是TrypLETM Express酶。
所述S2中T细胞分选的步骤包括：
(c1)在15mL离心管中先加入Hank’s Buffer，再加入等体积的血液轻轻混合；
(c2)在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，将混合后的血液轻轻加入到淋巴细胞分离液的上层，在室温下以1500rpm的转速进行离心25min，形成分层，由下到上包括红细胞、淋巴细胞分离液、PBMC、血浆；
(c3)从分层中吸取PBMC层，清洗3次后并计数；
(c4)使用美天旎CD3 MicroBeads,human试剂盒富集T细胞；
(c5)将T细胞计数，并加入T细胞培养基进行培养和扩增。
所述T细胞培养基为加入IL-2、IFN-γ、人CD3/CD28/CD2T细胞激活剂的ImmunoCultTM-XF T细胞扩增培养基。
所述S3中免疫共培养的步骤包括：
(d1)类器官处理：取长势良好的肿瘤类器官，加入Tryple后放置37℃消化10min，消化完成后，用无血清Advanced DMEM/F12终止消化，转移至离心管中，计数；
(d2)免疫细胞处理：用1mL移液枪轻轻吹打T细胞重悬后，转移至离心管中，用移液枪吹打混匀，计数；
(d3)根据计数结果，将T细胞与类器官按照比例混合，并用移液枪吹打使其混合均匀，在4℃下以转速1000r/min离心5min后去除上清，将细胞沉淀置于冰上，并加入溶化的matrigel基质胶，用移液枪反复吹打混匀，然后吸取含细胞的matrigel基质胶，并以1×104个/孔的密度接种至48孔板内，在37℃条件下孵育5min，使matrigel基质胶凝固；
(d4)孵育完成后，加入类器官培养基后放入培养箱内培养，每3天换一次液。
实施例2
本实施例提供了一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，具体实施方式同实施例1，区别在于，本实施例在免疫共培养的培养基中加入anti PD-L1，浓度为25ug/ml。
实施例3
本实施例提供了一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，具体实施方式同实施例1，区别在于，本实施例在免疫共培养的培养基中加入anti PD-L1&anti PD1，浓度为25ug/ml。
对照例1
与实施例1相比，本对照例在免疫共培养阶段中只加入类器官。
对照例2
与实施例1相比，本对照例在免疫共培养阶段中只加入类器官，为对照例1的平行实验。
数据收集与分析
使用仪器BioTekCytation 1酶标仪获取全景图像。从共培养0h开始，持续到实验结束，每隔24h拍照一次，对单个肿瘤类器官体积变化进行追踪测量和比较。
(1)仪器启动完成后，打开软件，选择合适的model，将细胞板放置载板台，点击拍摄后保存图像；
(2)图像添加标尺，并整理；
(3)使用BioTek收集每24h的图像。每组至少随机选取5个有效样本，并对有效样本的直径进行测量，用以评估类器官的生长情况。将测量的数据整理，并作图，得到各组类器官的生长曲线。数据处理如下：相对类器官大小＝有效样本实验终止日的直径/该有效样本Day0的直径。作图得到相对生长曲线；
(4)免疫共培养结束前，将对照组和实施例的微载体中的类器官数目进行统计，作为评价类器官生长状况以及免疫细胞治疗效果的方法之一。直径>50um的类器官被视为有效样本，并进行计数统计，与T细胞共培养一段时间后会出现类器官被T细胞包裹，并被杀伤而体积缩小的现象，当类器官完全的T细胞包裹，且类器官明显死亡，则对其不进行统计。
性能评价
1.T细胞培养生长
结论：由图1和图2的结果显示T细胞状态很好，并成团生长，生长速度较快。
2.类器官生长
分别对实施例1-3和对照例1-2观察免疫共培养11天内肿瘤类器官的生长曲线，结果见图3，并对培养8-11天的肿瘤类器官数量变化进行统计，其中直径>50um的类器官被视为有效样本，结果见表4；将实施例1-3与对照例1-2在培养0天和培养8天或11天后的类器官生长状况进行局部观察并拍照记录，结果见图5-9。
结论：图3结果显示类器官+T细胞共培养、类器官+T细胞+anti PD-L1联合共培养、类器官+T细胞+anti PD-L1&anti PD1联合共培养与单一的类器官相比，类器官生长变慢，体积变小，图4结果显示加入T细胞后8-11内类器官的数量无增加，表明T细胞具有杀伤肿瘤的作用，很好地抑制肿瘤类器官的增长；图5-9结果显示出T细胞可以激活并成功杀伤肿瘤。

Claims (10)

1.一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1.类器官培养和传代：取肝癌的肿瘤组织，在体外培养成肝癌类器官，并扩增类器官，观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代；
S2.T细胞分选：取病人的外周血，分离其中的PBMC，从PBMC中分选T细胞，并在体外进行培养和扩增；
S3.免疫共培养：类器官和T细胞按照一定的比例混合，接种至培养板中共培养，并观察一段时间。
所述S3中类器官和T细胞的数目比为(5-15)：1。
2.根据权利要求1所述的一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述S2中T细胞分选的步骤包括：
(c1)将血液与Hank’s Buffer轻轻混合；
(c2)将混合后的血液沿壁缓慢加入到淋巴细胞分离液的上层，然后离心，
得到分层；
(c3)从分层中吸取PBMC层，清洗后并计数；
(c4)使用试剂盒富集T细胞；
(c5)将T细胞计数，并加入T细胞培养基进行培养和扩增。
3.根据权利要求2所述的一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述(c4)中的试剂盒为CD3 MicroBeads,human。
4.根据权利要求2所述的一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述T细胞培养基为加入IL-2、IFN-γ、人CD3/CD28/CD2T细胞激活剂的ImmunoCultTM-XFT细胞扩增培养基。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述S3中免疫共培养的步骤包括：
(d1)类器官处理：取长势良好的肿瘤类器官，加入Tryple进行消化，消化完成后，用无血清培养基终止消化，转移至离心管中，计数；
(d2)免疫细胞处理：用移液枪轻轻吹打T细胞重悬后，转移至离心管中，用移液枪吹打混匀，计数；
(d3)根据计数结果，将T细胞与类器官按照一定比例混合，并用移液枪吹打使其混合均匀，离心后去除上清，将细胞沉淀置于冰上，并加入溶化的基质胶，用移液枪反复吹打混匀，然后吸取含细胞的基质胶，并接种至培养板的孔内，在37℃条件下孵育3-7min，使基质胶凝固；
(d4)孵育完成后，加入培养基后放入培养箱内培养。
6.根据权利要求5所述的一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述基质胶为Matrigel。
7.根据权利要求5所述的一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述S3中培养板包括48孔板或96孔板。
8.根据权利要求7所述的一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述接种至培养板的密度为(0.5-1.5)×104个/孔。
9.根据权利要求1所述的一种以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述(d1)步骤消化的时间为5-15min。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述的以类器官与T细胞共培养的免疫细胞治疗方法的应用，其特征在于，用于医学基础研究、药企药物筛查以及临床肿瘤治疗的用药指导。
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