CN112210537A - 肝癌类器官及其培养方法、培养用培养基和用途 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种培养肝癌类器官的方法，该方法包括将肝癌组织细胞与培养基和基质胶混合，得到待培养物，其中，所述培养基中含有胰岛素生长因子‑2，以所述培养基为基准，所述胰岛素生长因子‑2的浓度为1～50ng/ml，优选为5～10ng/ml；对所述待培养物进行培养扩增，得到肝癌类器官。本公开提供的肝癌类器官的培养方法中，由于所采用的培养基中含有特定浓度的胰岛素生长因子‑2，该特定浓度的胰岛素生长因子‑2能够促进肝癌类器官的体外生长，因此，利用本公开提供的方法进行肝癌类器官培养时，培养成功率较高。
Description
技术领域
本公开涉及生物医药技术领域，具体涉及一种培养肝癌类器官的方法、一种用于肝癌类器官培养的培养基、肝癌类器官及其在药物筛选、精准化用药检测及异种移植动物模型中的应用。
背景技术
原发性肝癌全球每年新发病例数高达85.4万，其中中国发病人数为46.6万，约占全球的55％。但目前，对于人类肝癌的研究，仍然缺乏可以真实再现原发性肝癌肿瘤病理生理的体外模型。
常见的肝癌细胞系，由于来自不同个体，在蛋白表达及异种移植成瘤性上具有明显差异。另外，由于肝癌细胞系在构建时转入了永生化基因，二维培养和传代过程中容易出现异化现象，使细胞系表现出与亲代肝癌细胞不同的特性，例如基因突变、生长变快、化疗敏感性增加等。此外，由于使用二维的单层细胞无法模拟出药物对细胞的渗透性能，部分药物对三维培养的细胞和二维培养的单层细胞呈现的杀伤力不同。
针对现有肝癌细胞系在进行药物筛选时准确性不高及原代肝癌组织无法在体外传代培养的问题，开发真实性更强的人源肝癌细胞模型，能够推进肝癌精准化用药及药物筛选的准确性。
发明内容
本公开的目的是提供一种培养肝癌类器官的方法、一种用于肝癌类器官培养的培养基、肝癌类器官及其在药物筛选、精准化用药检测及异种移植动物模型中的应用。
为了实现上述目的，第一方面，本公开提供一种培养肝癌类器官的方法，该方法包括：
将肝癌组织细胞与培养基和基质胶混合，得到待培养物，其中，所述培养基中含有胰岛素生长因子-2，以所述培养基为基准，所述胰岛素生长因子-2的浓度为1～50ng/ml，优选为5～10ng/ml；
对所述待培养物进行培养扩增，得到肝癌类器官。
可选地，所述待培养物中，所述肝癌组织细胞的浓度为1×104～5×104个/mL，所述基质胶的含量为2～15体积％。
可选地，所述培养基中还含有Advanced DMEM/F 12培养基、glutamax、青链霉素、HEPES、B27 supplement(without vitamin A)、N2 supplement、N-acetyll-cysteine、recombinant human(Leu15)-gastrin I、recombinant human FGF10、forskolin和A83-01。
可选地，以所述培养基为基准，所述glutamax的含量为0.1～10体积％，所述青链霉素的浓度为50～200μg/ml，所述HEPES的浓度为5～25mM，所述B27 supplement(withoutvitamin A)的含量为1～10体积％，所述N2supplement的含量为0.1～5体积％，所述N-acetyll-cysteine的浓度为0.1～5mM，所述recombinant human(Leu15)-gastrin I的浓度为1～50nM，所述recombinant human FGF10的浓度为50～200ng/ml，所述forskolin的浓度为1～20μM，所述A83-01的浓度为1～10μM，余量为所述Advanced DMEM/F 12培养基。
可选地，所述肝癌组织细胞由肝癌组织经酶解处理得到，其中，所述酶解处理包括：
将所述肝癌组织与酶解液混合，得到待酶解物；
将所述待酶解物进行培养酶解2～12h，得到酶解产物；
对所述酶解产物进行分离处理，得到所述肝癌组织细胞。
可选地，所述酶解液中含有DMEM/F 12培养基、HEPES、青链霉素、谷氨酰胺和胶原酶，以所述酶解液为基准，所述HEPES的浓度为5～25mM，所述青链霉素的浓度为50～200μg/ml，所述谷氨酰胺的含量为0.1～10体积％，所述胶原酶的含量为1～5ng/ml。
第二方面，本公开提供一种用于肝癌类器官培养的培养基，所述培养基中含有胰岛素生长因子-2，以所述培养基为基准，所述胰岛素生长因子-2的浓度为1～50ng/ml，优选为5～10ng/ml。
可选地，所述培养基中还含有Advanced DMEM/F 12培养基、glutamax、青链霉素、HEPES、B27 supplement(without vitamin A)、N2 supplement、N-acetyll-cysteine、recombinant human(Leu15)-gastrin I、recombinant human FGF10、forskolin和A83-01；其中，
以所述培养基为基准，所述glutamax的含量为0.1～10体积％，所述青链霉素的浓度为50～200μg/ml，所述HEPES的浓度为5～25mM，所述B27 supplement(without vitaminA)的含量为1～10体积％，所述N2 supplement的含量为0.1～5体积％，所述N-acetyll-cysteine的浓度为0.1～5mM，所述recombinant human(Leu15)-gastrin I的浓度为1～50nM，所述recombinant human FGF10的浓度为50～200ng/ml，所述forskolin的浓度为1～20μM，所述A83-01的浓度为1～10μM，余量为所述Advanced DMEM/F 12培养基。
第三方面，本公开提供第一方面中任意一项所述的方法培养得到的人肝癌类器官。
第四方面，本公开提供第三方面中所述的肝癌类器官在药物筛选、精准化用药检测及异种移植动物模型中的应用。
通过上述技术方案，本公开提供的肝癌类器官的培养方法中，由于所采用的培养基中含有特定浓度的胰岛素生长因子-2，该特定浓度的胰岛素生长因子-2能够促进肝癌类器官的体外生长，因此，利用本公开提供的方法进行肝癌类器官培养时，培养成功率较高。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开的第一方面提供一种培养肝癌类器官的方法，该方法包括：将肝癌组织细胞与培养基和基质胶混合，得到待培养物，其中，所述培养基中含有胰岛素生长因子-2，以所述培养基为基准，所述胰岛素生长因子-2的浓度为1～50ng/ml，优选为5～10ng/ml；对所述待培养物进行培养扩增，得到肝癌类器官。
本公开的发明人发现，浓度为1～50ng/ml的胰岛素生长因子-2能够促进肝癌组织细胞的体外生长，将其用于肝癌类器官的体外培养时，能够有效提升体外培养肝癌类器官的成功率，基于此提出本公开。
在本公开实施例中，具体地，在对所述待培养物进行培养扩增，得到肝癌类器官时，可以将所述待培养物置于培养板(例如可以是24孔培养板或96孔培养板)的培养孔中，使得每孔中含有1×104～5×104个肝癌组织细胞，然后再进行培养。培养过程中，可以先将培养板置于37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养30～120min，然后再向每个培养孔中加入150～300μL的培养基，之后每隔3～5天向每孔中补充100～200μL培养基，直至培养孔中培养物的直径达到100μm时，得到肝癌类器官。
通过上述技术方案，本公开利用含有1～50ng/ml胰岛素生长因子-2的培养基来进行肝癌类器官的培养，由于该浓度范围内的胰岛素生长因子-2能够促进肝癌组织细胞的体外生长，有助于肝癌组织细胞的快速增殖，因此，本公开培养肝癌类器官的成功率较高。
可选地，所述待培养物中，所述肝癌组织细胞的浓度为1×104～5×104个/mL，优选为1.5×104～3×104个/mL，所述基质胶的含量为2～15体积％，优选为5～10体积％。待培养物中的细胞浓度可以采用领域内的常规技术进行检测，此处不再赘述。
根据本公开，所述培养基中还可以含有其它组分，其它组分可以在较宽的范围内选择，有利于肝癌组织细胞生长的组分均可用于本公开。示例性地，所述培养基中还可以含有Advanced DMEM/F 12培养基、glutamax、青链霉素、HEPES、B27 supplement(withoutvitamin A)、N2 supplement、N-acetyll-cysteine、recombinant human(Leu15)-gastrinI、recombinant human FGF10、forskolin和A83-01。
其中，上述各组分均可通过购买获得，各组分的组成、剂型、规格等均是领域内已知的，此处不再赘述。本公开实施例中，将上述各组分进行合理搭配后得到用于肝癌类器官培养用的培养基，该培养基能够有效促进肝癌组织细胞的体外生长，这至少部分地提升了肝癌类器官的培养成功率。
可选地，以所述培养基为基准，所述glutamax的含量可以为0.1～10体积％，所述青链霉素的浓度可以为50～200μg/ml，所述HEPES的浓度可以为5～25mM，所述B27supplement(without vitamin A)的含量可以为1～10体积％，所述N2 supplement的含量可以为0.1～5体积％，所述N-acetyll-cysteine的浓度可以为0.1～5mM，所述recombinanthuman(Leu15)-gastrin I的浓度可以为1～50nM，所述recombinant human FGF10的浓度可以为50～200ng/ml，所述forskolin的浓度可以为1～20μM，所述A83-01的浓度可以为1～10μM，余量为所述Advanced DMEM/F 12培养基。
根据本公开，所述肝癌组织细胞由肝癌组织经酶解处理得到，其中，所述酶解处理包括：将所述肝癌组织与酶解液混合，得到待酶解物；将所述待酶解物进行培养酶解2～12h，得到酶解产物；对所述酶解产物进行分离处理，得到所述肝癌组织细胞。
在本公开实施例中，具体地，肝癌组织细胞由肝癌组织经酶解处理得到，其中除了含有肝癌细胞/干细胞外，还含有其它间质细胞，因此，利用肝癌组织细胞培养得到的肝癌类器官，能够较好地保留肝癌组织的异质性、组织特性及基因突变信息，可以在体外模拟肝癌组织的空间形态结构，其生物学特性与肝癌组织的生物学特性相似，可以用于构建肝癌患者的个体精准化疾病模型，用于疾病治疗方案及抗癌药物的研究和筛选。
可选地，所述酶解液中含有DMEM/F 12培养基、HEPES、青链霉素、谷氨酰胺和胶原酶，以所述酶解液为基准，所述HEPES的浓度可以为5～25mM，所述青链霉素的浓度可以为50～200μg/ml，所述谷氨酰胺的含量可以为0.1～10体积％，所述胶原酶的含量可以为1～5ng/ml。
本公开的第二方面提供一种用于肝癌类器官培养的培养基，所述培养基中含有胰岛素生长因子-2，以所述培养基为基准，所述胰岛素生长因子-2的浓度为1～50ng/ml，优选为5～10ng/ml。
可选地，所述培养基中还可以含有Advanced DMEM/F 12培养基、glutamax、青链霉素、HEPES、B27 supplement(without vitamin A)、N2 supplement、N-acetyll-cysteine、recombinant human(Leu15)-gastrin I、recombinant human FGF10、forskolin和A83-01；其中，以所述培养基为基准，所述glutamax的含量可以为0.1～10体积％，所述青链霉素的浓度可以为50～200μg/ml，所述HEPES的浓度可以为5～25mM，所述B27 supplement(without vitamin A)的含量可以为1～10体积％，所述N2 supplement的含量可以为0.1～5体积％，所述N-acetyll-cysteine的浓度可以为0.1～5mM，所述recombinant human(Leu15)-gastrin I的浓度可以为1～50nM，所述recombinant human FGF10的浓度可以为50～200ng/ml，所述forskolin的浓度可以为1～20μM，所述A83-01的浓度可以为1～10μM，余量为所述Advanced DMEM/F 12培养基。
本公开的第三方面提供第一方面中任意一项所述的方法培养得到的肝癌类器官。
本公开的第四方面提供第三方面中所述的肝癌类器官在药物筛选、精准化用药检测及异种移植动物模型中的应用。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
本公开实施例中涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得，此外，在本公开实施例中未注明具体实验温度时，实验温度均为室温(20-25℃)。
本公开实施例中所使用的培养基为肝癌类器官培养用培养基，包括：AdvancedDMEM/F 12培养基、1体积％的glutamax、100μg/ml的青链霉素、5～10ng/ml的胰岛素生长因子-2、10mM的HEPES、2体积％的B27 supplement(without vitamin A)、1体积％的N2supplement、1.25mM的N-acetyll-cysteine、10nM的recombinant human(Leu15)-gastrinI、100ng/ml的recombinant human FGF10、10μM的forskolin、5-μM的A83-01。
本公开实施例中使用的试剂来源如下：
DMEM/F12、DMEM高糖培养基购于Hyclone公司；TrypLE Express购于Gibco公司；matrigel基质胶购于美国Corning公司；青链霉素(Penicillin-Streptomycin)购于上海生工生物工程股份有限公司；胎牛血清蛋白(fetal bovine serum FBS)购于内蒙古金源康生物工程有限公司；胶原酶、ascorbic acid购于美国Sigma--Aldrich公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、谷氨酰胺、Wnt3a购于美国R&D Systems公司；Y27632、3μM的CHIR99021、1μM的A8301购于TargetMol公司；B27、N2细胞培养添加剂、1mM的sodium pyruvate购于Invitrogen公司；S1P、LPA购于Santa Cruz公司。
实施例1
本实施例用于说明人肝癌类器官的培养。
(1)人肝癌组织细胞的获取
获取临床确诊的肝癌患者的癌症组织，作为肝癌组织样本。利用预冷的PBS清洗肝癌组织样本，清洗结束后，利用无菌器械(例如外科手术剪)去除肝癌样本中的坏死组织，将肝癌组织样本切割成1-2mm3大小的组织块，得到肝癌组织块。
将得到的肝癌组织块与酶解液(含有10mM的HEPES、100μg/ml的青链霉素、1x谷氨酰胺、2ng/ml的胶原酶以及余量的DMEM/F12培养基)混合，得到待酶解物，其中，每1mg肝癌组织块对应加入0.1ml酶解液。将前述待酶解物置于37℃的培养箱中酶解2-8h，然后加入含有2体积％FBS的DMEM高糖培养基，终止消化作用，得到酶解产物。酶解产物洗涤两次，并于400g的条件下离心3min，弃上清，收集沉淀，即得肝癌组织细胞。
(2)肝癌类器官的培养
将步骤(1)中得到的肝癌组织细胞与培养用培养基(胰岛素生长因子-2的浓度为8ng/ml)混合，使得肝癌组织细胞的浓度为2×104个/mL，然后再加入5％体积的基质胶，并于冰上混合均匀，得到待培养物。将上述待培养物接种至24孔低吸附板中，并置于37℃的培养箱中培养30min，然后每孔补加200μl的培养用培养基，继续培养。培养过程中，每隔三天向每个孔中补加150μl的培养用培养基。
显微镜下观察，当单个培养孔中的培养物的直径达到200～500μm时，吸除原培养液，然后于24孔板的每孔中加入TrypLE Express，酶解1min后加入含有2体积％FBS的DMEM高糖培养基，终止消化作用，并收集酶解液。将收集的酶解液于300g的条件下离心3min，去除上清，收集细胞沉淀。细胞沉淀按照前述操作进行传代培养，当传代培养物的直径达到200～500μm时，去除培养液，得到肝癌类器官。培养得到的肝脏类器官可以按照5×105细胞/管的浓度冷冻保存在液氮中。
实施例2
本实施例用于说明肝癌类器官在药物筛选中的应用。
将实施例1培养得到的肝脏类器官利用TrypLE Express酶解1min，然后加入含有2体积％FBS的DMEM高糖培养基，终止消化作用，并收集酶解液。将收集的酶解液于300g的条件下离心3min，去除上清，收集细胞沉淀，对酶解后的细胞进行计数。
将上述细胞沉淀与培养用培养基混合，使得肝癌组织细胞的浓度为6×103个细胞每50μl，然后再加入5％体积的基质胶，并于冰上混合均匀，得到待培养物。将上述待培养物接种至96孔低吸附板中，然后将96孔板置于37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养30min，之后向96孔板的每孔中加入40μL培养用培养基并继续培养，培养过程中，每隔3天向每孔中补加10μL的培养用培养基。
当单个培养孔中的培养物的直径达到100μm时，将含有试验量的待筛选药物的培养基加入96孔板中，作为实验组，并将加入同体积的0.1％DMSO的培养孔作为阴性对照组，将加入同体积的1μM的Staurosporine的培养孔作为阳性对照组，然后同时将实验组和对照组置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中进行培养。药物加入后培养73-96h，利用CellTiter-Glo 3D细胞活力检测系统检测肿瘤细胞活力，并根据检测出的细胞活力判断待筛选药物对肝癌类器官细胞的作用效果。
实施例3
按照实施例1的方法培养肝癌类器官，不同的是：本实施例所使用的培养用培养基中，胰岛素生长因子-2的浓度为5ng/ml。
实施例4
按照实施例1的方法培养肝癌类器官，不同的是：本实施例所使用的培养用培养基中，胰岛素生长因子-2的浓度为10ng/ml。
实施例5
按照实施例1的方法培养肝癌类器官，不同的是：本实施例所使用的培养用培养基中，胰岛素生长因子-2的浓度为1ng/ml。
实施例6
按照实施例1的方法培养肝癌类器官，不同的是：本实施例所使用的培养用培养基中，胰岛素生长因子-2的浓度为50ng/ml。
对比例1
按照实施例1的方法培养肝癌类器官，不同的是：本对比例所使用的培养用培养基中不含有胰岛素生长因子-2。
对比例2
按照实施例1的方法培养肝癌类器官，不同的是：本对比例所使用的培养用培养基中，胰岛素生长因子-2的浓度为0.5ng/ml。
对比例3
按照实施例1的方法培养肝癌类器官，不同的是：本对比例所使用的培养用培养基中，胰岛素生长因子-2的浓度为60ng/ml。
测试实施例
分别按照实施例1、实施例3～6，以及对比例1～3的方法培养肝癌类器官，每种方法培养21例。
(1)培养成功率检测
开始培养7天后，进行形态学及免疫荧光染色检测，确定类器官培养的成功率，其中，当培养物直径达到200～500μm，且细胞数目达到5×106个时，认为肝癌类器官培养成功。检测结果如表1所示。
表1
| 组别 | 培养成功例数/总例数 | 培养成功率(％) |
| 实施例1 | 18/21 | 85.71 |
| 实施例3 | 17/21 | 80.95 |
| 实施例4 | 16/21 | 76.19 |
| 实施例5 | 12/21 | 57.14 |
| 实施例6 | 14/21 | 66.66 |
| 对比例1 | 3/21 | 14.29 |
| 对比例2 | 5/21 | 23.81 |
| 对比例3 | 7/21 | 33.33 |
由表1可以看出，本公开采用的培养用培养基中含有特定浓度的胰岛素生长因子-2，能够显著提升肝癌类器官培养的成功率。
(2)转录因子HNF4a、FoxA2检测
转录因子HNF4a与肝癌细胞的增殖能力有关，具体地，转录因子HNF4a的表达越高，肝癌细胞的增殖能力越差。转录因子FoxA2与肝癌细胞的侵袭转移能力有关，具体地，转录因子FoxA2在高侵袭性的肝癌细胞系中低表达，在低侵袭性的肝癌细胞中高表达。因此，本测试例将转录因子HNF4a和FoxA2作为反应肝癌细胞的生物学特性的检测指标。
检测方法：收集上述各组中成功培养得到的类器官，以及上述各组中培养类器官时使用的肝癌组织样本。将肝癌组织样本以及各肝癌类器官进行酶解，得到对应的细胞样本，然后向各细胞样本中加入细胞裂解液并置于冰上裂解30min，裂解结束后收集各细胞样品对应的蛋白样品。利用细胞裂解液稀释各蛋白样品，并利用Western blot法检测各蛋白样品中的肝脏相关转录因子HNF4a和FoxA2，然后利用Bio-Rad凝胶成像系统采集图像，并用image J软件对目标条带进行灰度扫描定量分析，每种蛋白样品重复3次实验，并以肝癌组织样本的灰度值为1，统计各肝癌类器官的灰度平均值，结果如表2所示。
表2
由表2可知，利用本公开实施例的方法培养得到的肝癌类器官中，相关蛋白的表达水平与其各自在肝癌组织样本中的水平相似，说明本公开实施例的方法培养得到的类器官的生物学特性与肝癌组织样本的生物学特性相似。
(3)高通量筛选指标检测
分别检测并计算各组肝癌类器官对应的Z因子、信号噪音比(S/N)和信号背景比(S/B)，其中，当Z因子>0.5、信号噪音比(S/N)>10且信号背景比(S/B)>3时，认为高通量筛选方法具有高灵敏度和高特异性。计算公式如下：
在式(Ⅰ)～(Ⅲ)中，Mmax为最大信号值的平均值，M,in为最小信号值的平均值，SDmax为最大信号值的标准偏差，SDmin为最小信号值的标准偏差。
各组肝癌类器官对应的高通量筛选指标检测结果见表3。
表3
| 组别 | Z因子 | 信号噪音比(S/N) | 信号背景比(S/B) |
| 实施例1 | 1.10 | 24.37 | 10.19 |
| 实施例3 | 0.88 | 18.31 | 8.56 |
| 实施例4 | 0.96 | 20.17 | 9.10 |
| 实施例5 | 0.82 | 17.69 | 8.01 |
| 实施例6 | 0.76 | 17.83 | 5.62 |
| 对比例1 | 0.12 | 2.36 | 1.93 |
| 对比例2 | 0.19 | 3.18 | 2.00 |
| 对比例3 | 0.23 | 4.25 | 2.65 |
由表3可以看出，利用本公开实施例的方法培养得到的肝癌类器官能够用于药物高通量筛选。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (10)
1.一种培养肝癌类器官的方法，其特征在于，该方法包括：
将肝癌组织细胞与培养基和基质胶混合，得到待培养物，其中，所述培养基中含有胰岛素生长因子-2，以所述培养基为基准，所述胰岛素生长因子-2的浓度为1～50ng/ml，优选为5～10ng/ml；
对所述待培养物进行培养扩增，得到肝癌类器官。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待培养物中，所述肝癌组织细胞的浓度为1×104～5×104个/mL，所述基质胶的含量为2～15体积％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中还含有Advanced DMEM/F 12培养基、glutamax、青链霉素、HEPES、B27 supplement(without vitamin A)、N2supplement、N-acetyll-cysteine、recombinant human(Leu15)-gastrin I、recombinanthuman FGF10、forskolin和A83-01。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以所述培养基为基准，所述glutamax的含量为0.1～10体积％，所述青链霉素的浓度为50～200μg/ml，所述HEPES的浓度为5～25mM，所述B27 supplement(without vitamin A)的含量为1～10体积％，所述N2 supplement的含量为0.1～5体积％，所述N-acetyll-cysteine的浓度为0.1～5mM，所述recombinanthuman(Leu15)-gastrin I的浓度为1～50nM，所述recombinant human FGF10的浓度为50～200ng/ml，所述forskolin的浓度为1～20μM，所述A83-01的浓度为1～10μM，余量为所述Advanced DMEM/F 12培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝癌组织细胞由肝癌组织经酶解处理得到，其中，所述酶解处理包括：
将所述肝癌组织与酶解液混合，得到待酶解物；
将所述待酶解物进行培养酶解2～12h，得到酶解产物；
对所述酶解产物进行分离处理，得到所述肝癌组织细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶解液中含有DMEM/F 12培养基、HEPES、青链霉素、谷氨酰胺和胶原酶，以所述酶解液为基准，所述HEPES的浓度为5～25mM，所述青链霉素的浓度为50～200μg/ml，所述谷氨酰胺的含量为0.1～10体积％，所述胶原酶的含量为1～5ng/ml。
7.一种用于肝癌类器官培养的培养基，其特征在于，所述培养基中含有胰岛素生长因子-2，以所述培养基为基准，所述胰岛素生长因子-2的浓度为1～50ng/ml，优选为5～10ng/ml。
8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述培养基中还含有Advanced DMEM/F12培养基、glutamax、青链霉素、HEPES、B27 supplement(without vitamin A)、N2supplement、N-acetyll-cysteine、recombinant human(Leu15)-gastrin I、recombinanthuman FGF10、forskolin和A83-01；其中，
以所述培养基为基准，所述glutamax的含量为0.1～10体积％，所述青链霉素的浓度为50～200μg/ml，所述HEPES的浓度为5～25mM，所述B27supplement(without vitamin A)的含量为1～10体积％，所述N2 supplement的含量为0.1～5体积％，所述N-acetyll-cysteine的浓度为0.1～5mM，所述recombinant human(Leu15)-gastrin I的浓度为1～50nM，所述recombinant human FGF10的浓度为50～200ng/ml，所述forskolin的浓度为1～20μM，所述A83-01的浓度为1～10μM，余量为所述Advanced DMEM/F 12培养基。
9.权利要求1～6中任意一项所述的方法培养得到的肝癌类器官。
10.权利要求9所述的肝癌类器官在药物筛选、精准化用药检测及异种移植动物模型中的应用。
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