CN115521898A - 肝癌类器官与nk细胞共培养的免疫细胞治疗方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，至少包括以下步骤：S1.类器官培养和传代：取肝癌的肿瘤组织，在体外培养成肝癌类器官，并扩增类器官，观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代；S2.PBMC提取：在Hank’s Buffer中加入血液轻轻混合，然后将混合后的血液加入到淋巴细胞分离液的上层，进行离心，形成分层后，小心吸取PBMC层，即完成PBMC的提取；S3.NK细胞分离和扩增：将提取的PBMC清洗后计数，并用试剂盒富集NK细胞，将NK细胞计数，并添加NK细胞培养基培养；S4.免疫共培养：将类器官与NK细胞以一定比例混合进行共培养。本发明的治疗方法周期短，在6‑11天内完整模拟了体内NK细胞对肿瘤反应和杀伤的过程，而且操作较动物实验简便，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及IPC分类号C12N5/09，更具体涉及一种肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法及应用。
背景技术
目前，肿瘤治疗的评价模型常见的是2D细胞模型和动物模型。然而肿瘤微环境复杂，其中含有大量的免疫细胞、基质细胞、细胞外基质，对肿瘤的发展有重要影响。2D细胞模型为单一细胞系，不能很好的体现肿瘤的特性。
动物模型中能够比较真实的反映原始肿瘤的特征的模型为病人来源异种移植肿瘤模型(patient-derived xenografts，PDX)，它将新鲜的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内。因而PDX模型保留了肿瘤微环境，肿瘤的遗传特性和组织特征也得到了保留，能够反映肿瘤的发生发展机制。PDX模型在肿瘤治疗中能更好体现临床的治疗效果。尽管如此，PDX模型也存在明显的缺点，PDX模型的实验周期长、成本高、难度高、成功率不稳定。专利CN111948392A公开了一种肝细胞癌PDX模型构建方法，能够用于判定肝细胞癌PDX模型构建时成瘤率高低的组合物，包括肝细胞癌肿瘤组织样品中的GPC3和Ki67，通过检测这两种蛋白，可以判断PDX建模成瘤率。本发明预测肝细胞癌PDX模型成瘤的方法，通过对肝细胞癌患者肿瘤组织GPC3和Ki67的免疫组织化学结果判读，早期预测PDX模型成瘤与否。早期预测PDX模型不可成瘤，可尽早排除构建PDX模型，但是该模型的建模成功率相对较低，且不稳定。
类器官(Organoid)是目前国际领先的肿瘤个体药效学检测的最新方法，即以患者手术切除或活检的原代肿瘤组织在体外培养成类器官，重现组织或器官的结构，可以在体外条件下模拟器官的功能。进而对不同的治疗药物或方案进行药效学检测，筛选出最优的治疗方案作为重要参考，明显提高临床治疗的有效性。NK细胞又称自然杀伤细胞(naturalkiller cell，NK细胞)，参与固有免疫，是机体内重要的抗肿瘤的免疫细胞。NK细胞能够直接靶向并杀伤恶性病变细胞，因而增加NK细胞数量、提高NK细胞活力是肿瘤免疫治疗的重要策略之一。但是肿瘤微环境的免疫抑制作用会影响实体瘤的治疗效率。因此，能够体外模拟肿瘤微环境的类器官模型对研究或评估NK细胞的治疗效果具有重要意义。
发明内容
针对上述提到的技术问题，本发明一方面提供了肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，至少包括以下步骤：
S1.类器官培养和传代：取肝癌的肿瘤组织，在体外培养成肝癌类器官，并扩增类器官，观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代；
S2.PBMC提取：在Hank’s Buffer中加入血液轻轻混合，然后将混合后的血液加入到淋巴细胞分离液的上层，进行离心，形成分层后，小心吸取PBMC层，即完成PBMC的提取；
S3.NK细胞分离和扩增：将提取的PBMC清洗后计数，并用试剂盒富集NK细胞，将NK细胞计数，并添加NK细胞培养基培养；
S4.免疫共培养：将类器官与NK细胞混合进行共培养，并加入肝癌的治疗治疗药物阿帕替尼和卡博替尼，观察肿瘤类器官的生长状态。
本发明中的消化液成分为：DMEM/F12培养基+2％青霉素/链霉素+0.1mg/mL庆大霉素+0.6％制酶菌素+2mg/mL胶原蛋白酶A+0.096mg/mL透明质酸酶。
本发明中类器官培养用到的培养基的成分如下：Advanced DMEM/F12,1％HEPES，1％GlutaMAX，2％B27,100ng/mL A83-01，50ng/mL EGF,100ng/mLNoggin，500ng/mLcommercial R-spondin1。
本发明中传代培养中用到的培养基成分为：conditioned R-spondin1 mediumfrom RSPO cells(Cultrex,3700-100-01)，100ng/mL Nrg1,10mM Y-27632。
本发明中清洗液为DMEM/F12+0.5％FBS+2％P/S，不加特殊说明的话，本发明中洗涤用的试剂均为DMEM/F12+0.5％FBS+2％P/S。
本发明中终止液为DMEM+0.5％FBS+2％P/S，不加特殊说明的话，本发明中终止消化用的试剂均为DMEM+0.5％FBS+2％P/S。
在一些实施方式中，所述S1中类器官培养至少包括以下步骤：
1)取肝癌的肿瘤组织，用剪刀处理成0.1mm3的大小，然后加入消化液在37℃连续摇晃孵育0.5～1h，每隔15min手动摇晃混合一次；
2)待消化完全，将组织/细胞在温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清，加入2mg/mL DNasel，37℃孵育5min；
3)用1xPBS/5％FCS清洗组织/细胞；
4)加入0.25％胰蛋白酶/EDTA，37℃孵育2min；
5)加入DNasel，37℃孵育5min；
6)温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
7)用5％FC/PBS清洗组织/细胞。
8)加入红细胞在冰上裂解细胞3min。
9)温度4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
10)用1xPBS/5％FCS清洗组织/细胞。
11)用红细胞裂解缓冲液处理之后，组织/细胞通过40μm流式管过滤，并用1xPBS/5％FCS清洗获得单细胞悬液。
12)将最后一次清洗的组织/细胞计数，温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
13)取matrigel在冰上重悬细胞，将细胞与matrigel混合均匀，并取10μL细胞与matrigel混合液移至48孔板中央，避免气泡产生。37℃孵育5min，待matrigel凝固；
14)每孔加250μL类器官培养基37℃培养，约4～5天单细胞长成类器官，进行传代和冻存。
镜下观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代。
在一些实施方式中，所述S1中类器官传代至少包括以下步骤：
a.用移液枪吸掉孔内培养液，需注意不要将matrigel吸走；
b.每孔加200μl的tryple，吹打多次，放入37℃的培养箱中消化5-10min，将类器官消化为单细胞；
c.待消化完成后，每孔加200μl Advanced DMEM/F12稀释tryple终止消化；
d.将单细胞在温度为4℃、转速为1500rpm下离心5min，弃上清；
e.取matrigel在冰上重悬细胞，将细胞与matrigel混合均匀，并取10μl细胞与matrigel混合液移至48孔板中央，避免气泡产生，37℃孵育5min，待matrigel凝固，每孔加250μl培养基37℃培养。
本发明中所述tryple指的是TrypLETM Express酶。
在一些实施方式中，所述S2中Hank’s Buffer与血液的用量为等体积。
在一些实施方式中，所述S2中离心的条件为室温、转速为1200-1800rpm，时间为20-30min。
优选地，所述S2中离心的条件为室温、转速为1500rpm，时间为25min。
在一些实施方式中，所述S2中淋巴细胞分离液为LymphoprepTM(STEMCELL,CATO7851)。
在一些实施方式中，所述NK细胞培养基为加入IL-2、IL-15、灭活血清的SCGM无血清培养基。
在一些实施方式中，所述S3中用到的试剂盒为美天旎的试剂盒。
在一些实施方式中，所述S3中加入NK细胞培养基后接种到6孔板中，置于5％的二氧化碳孵育箱中培养、进行扩增，每2-3天观察拍照。
在一些实施方式中，所述S4中免疫共培养至少包括以下步骤：
(c1)类器官处理：取长势良好的肿瘤类器官，加入Tryple进行消化，消化完成后，用无血清培养基终止消化，转移至离心管中，计数；
(c2)免疫细胞处理：用移液枪轻轻吹打NK细胞，使其重悬后，转移至离心管中，用移液枪吹打混匀，计数；
(c3)根据计数结果，将NK细胞与类器官按照一定比例混合，并用移液枪吹打使其混合均匀，离心后去除上清，将细胞沉淀置于冰上，并加入溶化的matrigel基质胶，用移液枪反复吹打混匀，然后接种至培养板的孔内，在37℃条件下孵育3-7min；
(c4)孵育完成后，加入培养基后放入培养箱内培养。
在一些实施方式中，所述步骤(c1)中无血清培养基为Advanced DMEM/F12。
在一些实施方式中，所述步骤(c3)中离心的条件为：温度3-5℃、转速800-1200r/min、时间为4-6min。
优选地，所述步骤(c3)中离心的条件为：温度4℃、转速1000r/min、时间为5min。
在一些实施方式中，所述S4中(c3)步骤中类器官与NK细胞的数目比为1：(150-250)。
优选地，所述S4中(c3)步骤中类器官与NK细胞的数目比为1：200。
在一些实施方式中，所述培养板包括24孔板、48孔板、96孔板中的一种。
优选地，所述培养板为48孔板。
在一些实施方式中，所述S4中(c3)步骤中接种至培养板孔中的细胞浓度为(0.5-1.5)×104个/孔。
优选地，所述S4中(c3)步骤中接种至培养板孔中的细胞浓度为1×104个/孔。
在一些实施方式中，所述S4中(c4)步骤中用到的培养基为类器官培养基。
本发明的另一方面提供了一种肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法在研究或评估NK细胞治疗肿瘤中的应用。
有益效果：
(1)本发明为NK细胞免疫治疗的研究提供了更优的模型，保留了肿瘤的微环境，使肿瘤保留了原始的特性，免疫细胞和类器官的共培养体系模拟了免疫细胞与肿瘤在体内的相互作用，更好地反映了NK细胞治疗肿瘤的过程、疗效和机制，对个体病人预测免疫细胞治疗的疗效；
(2)本发明的肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法周期短，在6-11天内完整模拟了体内NK细胞对肿瘤反应和杀伤的过程，而且操作较动物实验简便，成本低；
(3)本发明通过特定的培养条件对NK细胞进行培养，能够使NK细胞成团生长，且细胞状态优异，生长速度较快；
(4)本发明采用肝癌类器官与NK细胞共培养，且通过对照例结果可知加入NK细胞后类器官的数量减少，表明NK细胞能够成功杀伤肿瘤的作用。
附图说明
图1是本发明的实施例1中共培养的流程示意图；
图2和图3是本发明的实施例1中NK细胞培养4天的生长示意图；
图4是本发明的实施例1与对照例培养6天中的肿瘤类器官生长曲线；
图5是本发明的实施例1与对照例培养6天后的肿瘤类器官数量对比；
图6是本发明的实施例1与对照例在培养0天和培养6天后的类器官生长状况局部示意图；
具体实施方式
实施例中的消化液成分为：DMEM/F12培养基+2％青霉素/链霉素+0.1mg/mL庆大霉素+0.6％制酶菌素+2mg/mL胶原蛋白酶A+0.096mg/mL透明质酸酶。
实施例中类器官培养用到的培养基的成分如下：Advanced DMEM/F12，1％HEPES，1％GlutaMAX，2％B27，100ng/mLA83-01，50ng/mL EGF，100ng/mLNoggin，500ng/mLcommercial R-spondin1。
实施例中传代培养中用到的培养基成分为：conditioned R-spondin1 mediumfrom RSPO cells(Cultrex,3700-100-01)，100ng/mL Nrg1,10mM Y-27632。
不加特殊说明的话，本发明的实施例中洗涤用的试剂均为DMEM/F12+0.5％FBS+2％P/S。
不加特殊说明的话，本发明的实施例中终止消化用的试剂均为DMEM+0.5％FBS+2％P/S。
实施例1
请参照图1，肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，包括以下步骤：
S1.类器官培养和传代：取肝癌的肿瘤组织，在体外培养成肝癌类器官，并扩增类器官，观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代；
S2.PBMC提取：在15mL离心管中先加入Hank’s Buffer，再加入等体积的血液轻轻混合，然后在50ml离心管中加入淋巴细胞分离液，将混合后的血液加入到淋巴细胞分离液的上层，在室温下以1500rpm的转速进行离心25min，形成分层，由下到上包括红细胞、淋巴细胞分离液、PBMC、血浆，小心吸取PBMC层，即完成PBMC的提取；
S3.NK细胞分离和扩增：将提取的PBMC清洗3次后计数，并用美天旎的试剂盒富集NK细胞，将NK细胞计数，并添加NK细胞培养基培养，接种到6孔板中，在5％的二氧化碳孵育箱中培养，每3天观察拍照；
S4.免疫共培养：将类器官与NK细胞混合进行共培养，并加入肝癌的治疗治疗药物阿帕替尼和卡博替尼，观察肿瘤类器官的生长状态。
本实施例中的肿瘤组织来源于肝癌病人，通过手术分离获得，NK细胞来自病人子女的血液，并经过PBMC分离和NK细胞分选，得到富集的NK细胞，并用人NK细胞培养基扩增。
所述S2中淋巴细胞分离液为LymphoprepTM(STEMCELL,CATO7851)。
所述S3中NK细胞培养基为加入IL-2、IL-15、灭活血清的SCGM无血清培养基。
所述S1中类器官培养包括以下步骤：
1)取肝癌的肿瘤组织，用剪刀处理成0.1mm3的大小，然后加入消化液在37℃连续摇晃孵育0.8h，每隔15min手动摇晃混合一次；
2)待消化完全，将组织/细胞在温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清，加入2mg/mL DNasel，37℃孵育5min；
3)用1xPBS/5％FCS清洗组织/细胞；
4)加入0.25％胰蛋白酶/EDTA，37℃孵育2min；
5)加入2mg/mL DNasel，37℃孵育5min；
6)温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
7)用5％FC/PBS清洗组织/细胞；
8)加入红细胞在冰上裂解细胞3min；
9)温度4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
10)用1xPBS/5％FCS清洗组织/细胞；
11)用红细胞裂解缓冲液处理之后，组织/细胞通过40μm流式管过滤，并用1xPBS/5％FCS清洗获得单细胞悬液；
12)将最后一次清洗的组织/细胞计数，温度为4℃，转速为1500rpm，离心5min，弃上清；
13)取matrigel在冰上重悬细胞，将细胞与matrigel混合均匀，并取10μL细胞与matrigel混合液移至48孔板中央，避免气泡产生。37℃孵育5min，待matrigel凝固；
14)每孔加250μL类器官培养基37℃培养，约4～5天单细胞长成类器官，进行传代和冻存。
镜下观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代。
所述S1中类器官传代包括以下步骤：
a.用移液枪吸掉孔内培养液，需注意不要将matrigel吸走；
b.每孔加200μl的tryple，吹打多次，放入37℃的培养箱中消化5-10min，将类器官消化为单细胞；
c.待消化完成后，每孔加200μl Advanced DMEM/F12稀释tryple终止消化；
d.将单细胞在温度为4℃、转速为1500rpm下离心5min，弃上清；
e.取matrigel在冰上重悬细胞，将细胞与matrigel混合均匀，并取10μl细胞与matrigel混合液移至48孔板中央，避免气泡产生，37℃孵育5min，待matrigel凝固，每孔加250μl培养基37℃培养。
本实施例中所述tryple指的是TrypLETM Express酶。
所述S4中免疫共培养包括以下步骤：
(c1)类器官处理：取长势良好的肿瘤类器官，加入Tryple至48孔培养板中，用量为150μl/孔，用移液枪将matrigel吹打散，之后放置37℃消化10min，消化完成后，用无血清培养基Advanced DMEM/F12终止消化，转移至离心管中，计数；
(c2)免疫细胞处理：用1mL移液枪轻轻吹打NK细胞，使其重悬后，转移至离心管中，用移液枪吹打混匀，计数；
(c3)根据计数结果，将NK细胞与类器官按照200：1的数目比混合，并用移液枪吹打使其混合均匀，在4℃下以1000r/mim的转速离心5min后去除上清，将细胞沉淀置于冰上，并加入溶化的matrigel基质胶，用移液枪反复吹打混匀，然后以细胞浓度1×104/孔接种至48孔板，在37℃条件下孵育5min；
(c4)孵育完成后，加入类器官培养基后放入培养箱内培养，每3天换一次液。
对照例
所述对照例指的是在共培养过程中只加入类器官。
数据收集与分析
(1)使用仪器BioTekCytation 1酶标仪获取图像。从共培养0h开始，每24h使用BioTek进行拍照。
(2)仪器启动完成后，打开软件Gen Image+3.09，选择Imager Manual Mode，选择Capture now。将细胞板放置载板台。软件选择相应的板类型，并勾选use lid。选择需要进行拍照的孔，4倍镜进行拍照。在Imaging Mode栏勾选Montage，手动设置拍照范围，使视野包含完整的Matrigel图像；勾选Z-Stack，设置连续成像的厚度范围。点击拍摄后，图像。
(3)图像添加标尺，并整理。部分图像对局部进行裁剪，并添加相应标尺，并整理。
(4)使用BioTek收集每24h的图像。每组至少随机选取5个有效样本，并对有效样本的直径进行测量，用以评估类器官的生长情况。将测量的数据整理，并作图，得到各组类器官的生长曲线。数据处理如下：相对类器官大小＝有效样本的直径/该有效样本Day0的直径。作图得到相对生长曲线。
(5)免疫共培养结束前，将对照例和治疗组的微载体中的类器官数目进行统计，作为评价类器官生长状况以及免疫细胞治疗效果的方法之一。直径>50um的类器官被视为有效样本，并进行计数统计。与NK细胞共培养一段时间后，会出现类器官被NK细胞被杀伤的现象。当类器官死亡，则对其不进行统计。
性能评价
1.NK细胞培养生长
结论：由图2和图3的结果显示NK细胞状态很好，并成团生长，生长速度较快。
2.类器官生长
将实施例1培养得到的肿瘤类器官在用卡博替尼和阿帕替尼先后各刺激72h后，加入NK细胞共培养，观察6天内肿瘤类器官的生长曲线，结果见图4，并对6天后的肿瘤类器官数量进行统计，其中直径>50um的类器官被视为有效样本，结果见表5；将实施例1与对照例在培养0天和培养6天后的类器官生长状况进行局部观察并拍照记录，结果见图6。
结论：图4结果显示类器官+NK细胞与类器官相比，类器官生长变慢，体积变小，图5结果显示加入NK细胞后类器官的数量减少，表明NK细胞具有杀伤肿瘤的作用；图6结果显示出NK细胞激活并成功杀伤肿瘤。
Claims (10)
1.肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1.类器官培养和传代：取肝癌的肿瘤组织，在体外培养成肝癌类器官，并扩增类器官，观察类器官生长状态，将长势良好的进行传代；
S2.PBMC提取：在Hank’s Buffer中加入血液混合，然后将混合后的血液加入到淋巴细胞分离液的上层，进行离心，形成分层后，吸取PBMC层，即完成PBMC的提取；
S3.NK细胞分离和扩增：将提取的PBMC清洗后计数，并用试剂盒富集NK细胞，将NK细胞计数，并添加NK细胞培养基培养；
S4.免疫共培养：将类器官与NK细胞混合进行共培养，并加入肝癌的治疗治疗药物阿帕替尼和卡博替尼，观察肿瘤类器官的生长状态。
2.根据权利要求1所述的肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述S2中Hank’s Buffer与血液的用量为等体积。
3.根据权利要求1所述的肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述S2中离心的条件为室温、转速为1200-1800rpm，时间为20-30min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述NK细胞培养基为加入IL-2、IL-15、灭活血清的SCGM无血清培养基。
5.根据权利要求1所述的肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述S3中用到的试剂盒为美天旎的试剂盒。
6.根据权利要求1所述的肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述S3中加入NK细胞培养基后接种到6孔板中，置于5％的二氧化碳孵育箱中培养、进行扩增，每2-3天观察拍照。
7.根据权利要求1-5任一项所述的肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述S4中免疫共培养至少包括以下步骤：
(c1)类器官处理：取长势良好的肿瘤类器官，加入Tryple进行消化，消化完成后，用无血清培养基终止消化，转移至离心管中，计数；
(c2)免疫细胞处理：用移液枪轻轻吹打NK细胞，使其重悬后，转移至离心管中，用移液枪吹打混匀，计数；
(c3)根据计数结果，将NK细胞与类器官按照一定比例混合，并用移液枪吹打使其混合均匀，离心后去除上清，将细胞沉淀置于冰上，并加入溶化的matrigel基质胶，用移液枪反复吹打混匀，然后接种至培养板的孔内，在37℃条件下孵育3-7min；
(c4)孵育完成后，加入培养基后放入培养箱内培养。
8.根据权利要求7所述的肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述S4中类器官与NK细胞的数目比为1：(150-250)。
9.根据权利要求7所述的肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法，其特征在于，所述S4中(c3)步骤中接种至培养板孔中的细胞浓度为(0.5-1.5)×104个/孔。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述的肝癌类器官与NK细胞共培养的免疫细胞治疗方法在研究或评估NK细胞治疗肿瘤中的应用。
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