CN110004109A - 一种肝癌类器官模型的体外构建方法 - Google Patents

一种肝癌类器官模型的体外构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肝癌类器官模型的体外构建方法，将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按特定比例混悬于培养基A；培养至第4天，半量换液维持培养；第7天开始，换为培养基B，连续培养7天；第14天传代扩增培养。本发明基于肿瘤微环境中复杂的细胞构成，快速构建大小均一、结构稳定、可检测抗癌药物有效性，并可扩增培养的3D肝癌类器官体外模型。本发明构建的肝癌类器官模型方法简易，构建迅速，可操作性强，适用于研究肝癌发生发展机制、以及肝癌药物高通量筛选等，具有产业化意义。

Description

一种肝癌类器官模型的体外构建方法
技术领域
本发明涉及一种肝癌类器官模型的体外构建方法。
背景技术
肝癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，全球发病率和肿瘤相关致死率位居前列。病原学显示，导致肝癌的因素众多，乙肝或丙肝病毒感染，非酒精性脂肪肝，酗酒，肥胖等。肝癌具有异质性，耐药性和转移复发性，这给肝癌的治疗带来了极大的挑战。目前来说，对于肝癌的研究模型主要分为体内研究模型和体外研究模型。其中体外研究模型包括传统的平面2D培养和近年出现的三维培养。尽管在肝癌发生机制和肝癌药物筛选上具有一定的参考意义，但这种单细胞组分的模型往往忽视了多种细胞间或细胞-胞外基质间的相互作用。肝癌的进展并不是单一肿瘤细胞的增殖，其发生发展与复杂的肿瘤微环境和微环境中的多种成分细胞有关。因此，一种包含多种肝癌相关细胞并能模拟肝癌微环境的体外模型亟待开发。
类器官是一种利用哺乳动物干细胞或成体细胞的特性构建的具有多种特异细胞类型的体外模型。近来多项研究报道，这些有复杂内部结构的类器官，在功能及构造上已经趋近于相应体内结构。基于多细胞组分的类器官体外肿瘤模型，可以重现在肿瘤组织中肿瘤细胞与其他肿瘤相关细胞的互相作用，如肿瘤相关成纤维细胞，血管内皮细胞，甚至免疫细胞等。因此，构建肝癌类器官模型，为深入研究肝癌发生发展的机制，及肝癌药物筛选提供了新的方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速简易的肝癌类器官模型的体外构建方法，本发明提供的方法可以在较短时间内得到模拟肝癌微环境的类器官模型，为进一步肝癌机制研究及高通量肝癌药物筛选提供平台。
本发明的技术解决方案是：
一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基A，静置培养；（2）第4天使用培养基A半量换液，维持培养；（3）第7天换为培养基B培养7天；（4）第14天取肝癌类器官消化传代，消化后的细胞按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养；
所述培养基A包括：青霉素、链霉素、I型鼠尾胶原蛋白，维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、和DMEM/F12培养基。
所述培养基B包括：青霉素、链霉素、转铁蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、Wnt3a、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）、和DMEM/F12培养基。
将肝癌细胞、肝星状细胞、及肝窦内皮细胞，使用计数仪计数，按7:2:1的特定比例，混悬于培养基A。
将肝癌细胞、肝星状细胞、及肝窦内皮细胞按特定比例混匀于A后，计数后按每孔2000个细胞使用排枪均匀地接种于超低吸附圆底细胞板，每孔接种细胞混悬液的体积为100µL。
肝癌细胞、肝星状细胞、及肝窦内皮细胞按比例混悬于培养基A，接种于超低吸附圆底细胞板，然后放入37℃二氧化碳培养箱，静置培养，尽量避免移动。
第4天半量换液一次，使用微量移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中50µL培养基，并加入等量培养基A。
培养至第7天，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，吸出旧培养基；再沿孔壁缓慢加入100µL培养基B，隔日吸弃50µL培养基，加入等量培养基B，持续培养7天。
培养至第14天，使用1000µL移液枪，吸出96孔板中所有类器官置离心管，吸弃上清，加入500µL Accutase放入37℃二氧化碳培养箱孵育30min, 离心去上清后使用培养基A计数、重悬并稀释，消化后的细胞按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养。
培养基A包括：100U/mL青霉素、100µg/mL链霉素、2~10µg/mL I型鼠尾胶原蛋白，1µg/mL维生素C、10µg/mL牛胰岛素、2µmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、10ng/mL氢化可的松、2~10µmol/mL谷氨酰胺、4~8% 胎牛血清、10~50 ng/mL表皮生长因子（EGF）、10~50 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、和DMEM/F12培养基；培养基B包括：100U/mL青霉素、100µg/mL 链霉素、2~10µg/mL转铁蛋白、1µg/mL维生素C、10µg/mL牛胰岛素、2µmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、10ng/mL氢化可的松、2~10µmol /mL谷氨酰胺、8-12% 胎牛血清、2~50ng/mL Wnt3a、10~50 ng/mL表皮生长因子（EGF）、10~50 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、10~100 ng/mL肝细胞生长因子（HGF）、和DMEM/F12培养基。
实验结果表明，本发明可迅速构建形状均一的肝癌类器官模型，类器官成熟后体积可持续增长，并可传代扩大培养。肝癌类器官模型对药物的敏感性与2D细胞模型差别较大，提示具有复杂肿瘤微环境的肝癌类器官能更真实的模拟药物对肝癌的作用。
本发明基于肝癌肿瘤微环境构成，快速构建大小均一、结构稳定、可检测抗癌药物有效性，并可扩增培养的3D肝癌类器官体外模型。本发明构建的肝癌类器官模型方法简易，构建迅速，可操作性强，适用于肝癌发生发展的基础研究、肝癌药物高通量筛选等，具有产业化意义。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1 为肝癌类器官的制备工艺流程图。
图2 为不同时间点的光镜拍摄图。
图3 为肝癌类器官增殖示意图。
图4 为索拉菲尼处理后2D肝癌细胞模型及肝癌类器官模型的生存率对比。
图5为索拉菲尼处理后肝癌类器官生存状态示意图。
具体实施方式
参见图1，图1为本发明提供的肝纤维化类器官的制备工艺流程图。
步骤一，流式细胞术原代分选肝星状细胞和肝窦内皮细胞，通过液氮冻存保种；或直接购置冻存的肝星状细胞，肝窦内皮细胞。预先将肝癌细胞系常规培养（DMEM高糖培养基，补充以1%青霉素/链霉素，10%胎牛血清；培养于25cm2细胞培养瓶，置于37℃二氧化碳恒温培养箱）。在融合度为80%左右使用胰酶消化肝癌细胞株，800rps离心，使用培养基A重悬计数。同时，将肝星状细胞，肝窦内皮细胞，使用自动细胞复苏系统小心复苏，800rps离心，使用培养基A重悬，分别使用细胞计数仪计数。将肝癌细胞株，肝星状细胞，肝窦内皮细胞以7:2:1的特定比例，混悬于培养基A。以2000个细胞每孔/100µL，使用排枪小心均匀地种于超低吸附的圆底细胞培养板。培养基A包括：100U/mL青霉素、100µg/mL 链霉素、5µg/mL I型鼠尾胶原蛋白，1µg/mL维生素C、10µg/mL牛胰岛素、2µmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、10ng/mL氢化可的松、6µmol/mL谷氨酰胺、6%胎牛血清、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、和DMEM/F12培养基。
步骤二，接种后在培养基A中置于37℃，5% CO2培养箱中静置培养，可观察每个孔形成初始细胞团。第4天半量换液一次，使用微量移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中50µL培养基，并加入等量培养基A。
步骤三，培养至第7天，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，吸出旧培养基；再沿孔壁缓慢加入100µL培养基B，隔日吸弃50µL培养基，加入等量培养基B，持续培养7天。培养基B成分包括：100U/mL青霉素、100µg/mL 链霉素、10µg/mL转铁蛋白、1µg/mL维生素C、10µg/mL牛胰岛素、2µmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、10ng/mL氢化可的松、6µmol /mL谷氨酰胺、10% 胎牛血清、20ng/mL Wnt3a、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/mL表皮生长因子（EGF），50 ng/mL肝细胞生长因子（HGF）、和DMEM/F12培养基。
步骤四，培养至第14天，使用1000µL移液枪，吸出96孔板中所有类器官置离心管，吸弃上清，加入500µL Accutase放入37℃二氧化碳培养箱孵育30min, 离心去上清后使用培养基A计数、重悬并稀释置2000细胞/孔，消化后的细胞按步骤（一）~（三）的细胞培养方法继续培养。
参见图2，图2是根据步骤一至三，在不同时间节点拍摄的肝癌类器官模型光镜图。在培养基A中静置培养，在第4天半量换液，在第7天开始扩大培养并成为成熟的肝癌类器官模型，第14天经过Accutase消化可用于传代。肝癌形成过程中，肿瘤微环境发挥重要作用。其中肝癌细胞与非实质细胞如肝星状细胞，肝窦内皮细胞的交互作用尤为重要。将肝癌细胞、肝星状细胞，和肝窦内皮细胞这三种细胞模拟肝癌中细胞比例混合接种于超低吸附圆形96孔板中，通过自组装形成肝癌类器官。肝癌类器官在第1天呈不规则形状（图2A），从第5天（图2B）至第10天（图2C），形成规则球形，并且体积将近扩大一倍，说明肝癌细胞在类器官体系中增殖较快。在第14天将其传代，继续按上述方法培养可得到相似的第二代肝癌类器官模型（图2D）。由此可见，本发明构建的类器官模型结构稳定，可以扩增培养，利于高通量大规模地进行肝癌药物筛选。
参见图3，图3是根据步骤一至三，观察肝癌类器官中细胞增殖情况。在特定类器官培养孔中加入10 μM EdU溶液共培养24小时后，收集类器官球，每组加入100 μL 4%多聚甲醛固定1h。然后使用含BSA的PBS洗三次，加入Triton-X通透液室温放置15min，在EdU反应液中避光孵育30min。随后使用PBS洗三次，加入Hoechst33342溶液，避光孵育15min。荧光显微镜特定激发光下检测。如图3所示，在第10天，肝癌类器官中将近一半的细胞呈EdU染色阳性，提示肝癌类器官中细胞处于增殖状态。
参见图4，按照工艺流程，培养10天后，在部分培养孔中加入不同浓度的索拉菲尼。24h后加入MTT溶液，孵育4h后置于酶标仪在490nm波长下检测各孔吸光度。与之作为对比，将肝癌细胞系HCCLM3以每孔3000个种入普通96孔细胞培养板，在特定孔分别加入以上浓度索拉菲尼，24h后加入MTT溶液，检测各孔吸光度。如图4所示，与2D培养相比，肝癌类器官模型显示出不同的索拉菲尼敏感性。2D培养系统中，索拉菲尼的IC50值为10.49µM，而肝癌类器官索拉菲尼的IC50值为14.05µM，相差将近40%。这提示传统的2D培养系统由于缺乏肿瘤微环境中与其他细胞的相互作用，并不能很准确的反应肿瘤细胞对化学药物的真实敏感性。本发明中的肝癌类器官包含两种肝癌相关的非实质细胞-星状细胞和肝窦内皮细胞，能更贴近体内的肿瘤微环境状态，可作为体外模型筛选肝癌药物。
参见图5，按照工艺流程，在培养的第10天在部分培养孔中分别加入1µM和10µM浓度的索拉菲尼，以只加药物稀释液的培养孔作为对照。培养24h后取出肝癌类器官，使用Live/dead法分析生存状态。具体地来说，使用吸头小心吸出三组类器官球，PBS浸洗3遍。预先配置染色液（calcein AM /ethidium homodimer-1, 1:4），加入类器官球避光染色30min，在特定激发光下共聚焦检测。如图4所示，在加入1µM索拉菲尼后，肝癌类器官中的死细胞略有增加，但总体生存状态并没有明显区别。而在加入10µM索拉菲尼后，肝癌类器官中死亡细胞明显增多，说明肝癌类器官对索拉菲尼的反应呈剂量依赖性。提示本发明中的肝癌类器官模型可用于肝癌药物筛选，而Live/dead法有助于肝癌类器官的快速筛药。
以上说明仅是本发明的优选实施方式，在遵循本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应被视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基A，静置培养；（2）第4天使用培养基A半量换液，维持培养；（3）第7天换为培养基B培养7天；（4）第14天取肝癌类器官消化传代，消化后的细胞按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养；
所述培养基A包括：青霉素、链霉素、I型鼠尾胶原蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基；
所述培养基B包括：青霉素、链霉素、转铁蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、Wnt3a、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。
2.根据权利要求1所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，使用计数仪计数，按7:2:1的特定比例，混悬于培养基A。
3.根据权利要求书2所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按特定比例混匀于培养基A后，计数并按每孔2000个细胞使用排枪均匀地接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，每孔接种细胞混悬液体积为100µL。
4.根据权利要求书3的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按比例混悬于培养基A，接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，然后放入37℃二氧化碳培养箱，静置培养，尽量避免移动。
5.根据权利要求书4所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：第4天半量换液一次，使用微量移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中50µL培养基，并加入等量培养基A。
6.根据权利要求书5所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养至第7天，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，吸出旧培养基；再沿孔壁缓慢加入100µL培养基B，隔日吸弃50µL培养基，加入等量培养基B，持续培养7天。
7. 根据权利要求书6所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养至第14天，使用1000µL移液枪，吸出96孔板中所有类器官置离心管，吸弃上清，加入500µLAccutase放入37℃二氧化碳培养箱孵育30min，离心去上清后使用培养基A计数、重悬并稀释，按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养。
8. 根据权利要求书1、2、3或4所述的一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养基A包括：100U/mL青霉素、100µg/mL 链霉素、2~10µg/mL I型鼠尾胶原蛋白，1µg/mL维生素C、10µg/mL牛胰岛素、2µmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10ng/mL氢化可的松、2~10µmol/mL谷氨酰胺、4~8%胎牛血清、10~50ng/mL表皮生长因子、10~50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基；培养基B包括：100U/mL青霉素、100µg/mL链霉素、2~10µg/mL转铁蛋白、1µg/mL维生素C、10µg/mL牛胰岛素、2µmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10ng/mL氢化可的松、2~10µmol /mL谷氨酰胺、8-12% 胎牛血清、2~50ng/mL Wnt3a、10~50 ng/mL表皮生长因子、10~50 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10~100 ng/mL肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。
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