CN113293127A - 一种多细胞共培养的三维肝微球模型的构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多细胞共培养的三维肝微球模型的构建及应用，属于细胞微球技术领域。本发明所述的一种多细胞共培养的三维模型的构建方法，包括如下步骤：将肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞配制为混合细胞悬浮液；之后将混合细胞悬浮液加入超低吸附孔板，培养1‑2天，得到所述的多细胞共培养的三维模型；其中所述的混合细胞悬浮液中肝实质细胞、肝星形细胞以及内皮细胞的数量比为4：1：1；所述的肝实质细胞为人肝癌细胞HepG2，肝星形细胞为LX‑2，内皮细胞为人脐静脉融合细胞EA.hy926。本发明的模型可以全方位地接触培养液和其他细胞，更加接近人体内的细胞环境，使得三维模型对于肝毒性或肝损伤的评价更为准确、可靠。

Description

一种多细胞共培养的三维肝微球模型的构建及应用
技术领域
本发明涉及一种多细胞共培养的三维肝微球模型的构建及应用，属于细胞微球技术领域。
背景技术
传统的毒理学评价通常以动物实验为基础，虽然动物可以完整地模拟整个吸收、代谢、转化、排泄的复杂过程，但是由于物种间的差异性并不能充分反应人体的生理过程，要证实动物实验的结果还需进一步的实验验证。而且动物实验周期过长、成本较高，灵敏性和特异性也比较差。随着分子生物学和现代分析技术的不断发展，越来越多的细胞模型开始用于肝毒性研究。
目前，基于二维培养的细胞模型依然是药物检测和毒性评估的主要方法。但是，二维培养环境与人体内环境差异过大，无法准确模拟体内的代谢过程，因此构建一种可以更加准确可靠模拟体内环境且经济高效的评价模型对于药物、食品的开发、评价至关重要。
发明内容
[技术问题]
动物实验周期长、成本较高，灵敏性和特异性也比较差；二维培养的细胞模型无法准确模拟体内的代谢过程；单种细胞的三维培养缺乏不同细胞间的交流，与人体内多细胞共同作用的内环境差异较大。
[技术方案]
为了解决上述至少一个问题，本发明提供了一种多细胞共培养的三维模型构建方法及其应用，选用了人体肝组织中具有重要功能的三种细胞(肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞)共培养，用于更加准确模拟体内肝代谢环境并进行肝毒性检测评估。
本发明的第一个目的是提供了一种多细胞共培养的三维模型的构建方法，包括如下步骤：
将肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞配制为混合细胞悬浮液；之后将混合细胞悬浮液加入超低吸附孔板，培养1-2天，得到所述的多细胞共培养的三维模型。
在本发明的一种实施方式中，所述的肝实质细胞为人肝癌细胞HepG2，肝星形细胞为LX-2，内皮细胞为人脐静脉融合细胞EA.hy926。
在本发明的一种实施方式中，所述的混合细胞悬浮液中肝实质细胞、肝星形细胞以及内皮细胞的数量比为4：1：1。
在本发明的一种实施方式中，所述的混合细胞悬浮液中采用的细胞培养液是由HepG2细胞的专用培养基与LX-2、EA.hy926细胞的专用培养基等比例混合配制而成。
在本发明的一种实施方式中，所述的混合细胞悬浮液中肝实质细胞的浓度为5000cells/mL，肝星形细胞的浓度为1250cells/mL，内皮细胞的浓度为1250cells/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述的超低吸附孔板为96孔。
在本发明的一种实施方式中，所述超低吸附孔板中每孔加入200μL的混合细胞悬浮液；使其自发形成细胞微球，每个微球含有1000个HepG2细胞、250个EA.hy926细胞、250个LX-2细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述的培养中，每24h需要更换一次孔板中的培养液，所述更换体积为原体积的一半。
在本发明的一种实施方式中，所述的培养是在37℃下进行培养。
在本发明的一种实施方式中，所述的肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞在使用之前需要复苏，所述的复苏具体包括如下步骤：
装有肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞的冻存管，37℃水浴融化，迅速离心后，用含1％双抗、10％胎牛血清的细胞专用培养基进行培养(HepG2细胞的培养基为MEM，LX-2和EA.hy926的培养基为DMEM)；每2天换液一次，待细胞铺满培养皿底70-80％时，用胰蛋白酶消化液进行消化，在显微镜中观察到细胞外形呈椭圆状，且部分细胞即将脱壁分离时，立即加入培养液终止消化；收集消化后的细胞于15mL离心管中，离心，弃去上清，得到复苏后的肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法构建得到的多细胞共培养的三维模型。
本发明的第三个目的是本发明所述的多细胞共培养的三维模型在肝毒性评价中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的应用是检测黄曲霉毒素B1或T-2毒素。
[有益效果]
(1)本发明将肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞进行细胞共培养，模拟人体内三种具有重要功能的肝细胞的代谢情况，相比贴壁培养，细胞可以全方位地接触培养液和其他细胞，更加接近人体内的细胞环境，使得三维模型对于肝毒性或肝损伤的评价更为准确、可靠。
(2)本发明采用的细胞评价模型，相比动物实验，实验流程及操作更加简单，实验周期显著缩短，成本更低。
附图说明
图1为不同细胞比例形成微球后，活细胞的比例变化。
图2为不同细胞种类、细胞数量以及不同培养时间的微球形态明场图；其中(A)为肝癌细胞HepG2；(B)为HepG2细胞+EA.hy926细胞；(C)为HepG2细胞+EA.hy926细胞+LX-2细胞成球。
图3为1000个HepG2细胞+250个EA.hy926细胞+250个LX-2细胞成球培养10天后，肝微球中细胞的存活情况。
图4为不同数量的HepG2培养3天、9天、15天、21天后的球体面积变化。
图5为AFB1刺激24h后，肝微球中死细胞的比例随加药浓度变化情况。
图6为T-2刺激24h后，肝微球中死细胞的比例随加药浓度变化情况
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1
一种多细胞共培养的三维模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)肝癌细胞HepG2、肝星形细胞LX-2、内皮细胞EA.hy926的复苏与培养
分别取出装有肝癌细胞HepG2、肝星形细胞LX-2、内皮细胞EA.hy926的冻存管，37℃水浴融化，迅速离心后，用含1％双抗、10％胎牛血清的细胞专用培养基进行培养(HepG2细胞的培养基为MEM，LX-2和EA.hy926的培养基为DMEM)；每2天换液一次，待细胞铺满培养皿底70-80％时，用胰蛋白酶消化液进行消化，在显微镜中观察到细胞外形呈椭圆状，且部分细胞即将脱壁分离时，立即加入培养液终止消化；收集消化后的细胞于15mL离心管中，离心，弃去上清，加入1mL培养液重悬，得到复苏后的肝癌细胞HepG2、肝星形细胞LX-2、内皮细胞EA.hy926；
(2)配制细胞悬液
将步骤(1)复苏后的肝癌细胞HepG2、肝星形细胞LX-2、内皮细胞EA.hy926配制为混合细胞悬浮液；其中人肝癌细胞HepG2的浓度为5000cells/mL，肝星形细胞LX-2的浓度为1250cells/mL，内皮细胞EA.hy926的浓度为1250cells/mL；
(3)制备细胞微球
将步骤(2)得到的混合细胞悬浮液加入到超低吸附的96孔板中，每孔加入200μL，进行培养使得最终为1000个细胞成球；培养液每24h进行半量换液；得到所述的多细胞共培养的三维模型。
实施例2肝癌细胞HepG2、肝星形细胞LX-2、内皮细胞EA.hy926的比例优化
调整实施例1中肝癌细胞HepG2、内皮细胞EA.hy926、肝星形细胞LX-2的数量比为2：1：1、8：1：1；其他和实施例1保持一致，得到多细胞共培养的三维模型。
将实施例1和2得到的三维模型进行细胞存活情况观察，具体是：
待微球形态稳定之后，尽量吸尽孔板中的培养液，每孔加入100μL含2μmol/LCalcein-AM和4.5μmol/L PI荧光探针的染色液，37℃孵育15min；孵育完成后弃去孔内液体，每孔加入100μL的PBS溶液清洗2次，每次5min；再加入100μL的DAPI染色液，37℃孵育10min，对细胞核进行染色，方便后面细胞计数；然后PBS清洗2次，清洗完成后加入100μL的PBS复溶，采用共聚焦显微镜拍摄荧光照片，并用Imaris软件对活细胞、死细胞以及细胞总数进行计数，并计算活细胞比例。
结果如图1所示，实施例1的三维细胞模型(4：1：1)中活细胞的存活率明显高于实施例2中的三维细胞模型(2：1：1和8：1：1)。
实施例3微球中个数的优化
调整实施例1步骤(3)中的培养时间，使得500细胞成球或者2000个细胞成球，其他和实施例1保持一致，得到三维细胞模型。
将得到的三维细胞模型在3、9、15、21天的时候进行细胞形态观察并对球体面积进行定量，结果如图4，可以看出：500个细胞成球由于人为操作造成的样本之间的差异和波动较大，数据不太稳定；2000个细胞得到微球在3天之后，有部分球体面积超过了20 000μm2，球体体积过大可能造成微球中间部位的细胞缺乏营养和氧气，最终死亡；因此，选择1000个细胞成球。
实施例4单细胞、双细胞的三维细胞模型
调整实施例1步骤(2)中混合细胞悬浮液为单细胞细胞悬浮液(肝癌细胞HepG2，浓度为5000cells/mL)、双细胞悬浮液(肝癌细胞HepG2、内皮细胞EA.hy926，数量比为4：1；人肝癌细胞HepG2的浓度为5000cells/mL，内皮细胞EA.hy926的浓度为1250cells/mL)，同时调整成球的细胞个数为500、1000、1500、2000、3000、5000，培养时间为24h、48h、72h、96h，其他和实施例1保持一致，得到三维细胞模型。
将实施例1和实施例4得到的三维细胞模型进行细胞形态的观察，结果如图2和图3：
从图2可以看出：48h到72h后，可形成稳定的球体形态；且相比于单细胞或两种细胞成球，三种细胞形成的微球形态更好。
从图3可以看出：10天后实施例1的三细胞微球中细胞的存活率较高，适用于细胞培养。
实施例5三维肝微球模型用于肝毒性评价的应用
将实施例1和4的三维微球评价模型用于黄曲霉毒素B1(AFB1)的检测，包括以下步骤：
(1)给药刺激
将实施例1和4的三细胞、单细胞、双细胞的肝微球模型培养48h后，分别加入0μg/mL、0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、60μg/mL的AFB1溶液；其中AFB1毒素采用DMSO溶解成30mg/mL的母液贮存，实验加药采用细胞培养液稀释成适宜的加药浓度；加药时同换液一样采用半数换液法，因此实际给药刺激的药物浓度分别为0μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、30μg/mL
(2)检测活死细胞的比例
加药培养24h后，尽量吸尽孔板中的培养液，每孔加入100μL含2μmol/L Calcein-AM和4.5μmol/L PI荧光探针的染色液，37℃孵育15min。孵育完成后弃去孔内液体，每孔加入100μL的PBS溶液清洗2次，每次5min；再加入100μL的DAPI染色液，37℃孵育10min，对细胞核进行染色，方便后面细胞计数；然后PBS清洗2次，清洗完成后加入100μL的PBS复溶，采用共聚焦显微镜拍摄荧光照片，并用Imaris软件对活细胞、死细胞以及细胞总数进行计数，并计算死细胞比例；
(3)结果分析
结果如图5所示；从图5可以看出：细胞球中死细胞的比例与AFB1的加药浓度呈一个剂量依赖性的上升趋势；未加药以及加药浓度极低的微球中，死细胞比例在1-5％；当加药浓度达到30μg/mL时，微球中死细胞的比例最高可以达到18.06％；此外，对于不同细胞共培养的微球而言，单细胞成球的体系对药物更加敏感，随着药物浓度增加，死细胞比例不断增加，即单细胞成球的体系更容易受到药物的刺激而损伤细胞；而多种细胞共培养，尤其是三细胞成球，其在低浓度药物作用24h时出现了死细胞减少的现象；当药物浓度不断升高时，三细胞共培养的体系也出现了死细胞比例上升的趋势，但是与单细胞微球上升了15.10％对比，加药浓度由0到30μg/mL，三细胞体系的死细胞比例由3.69％增加到8.96％，只增加了5.27％。此现象也说明了三细胞共培养体系对药物作用的损害抵御能力更强，可以通过细胞间的代谢调节减少药物损伤。
实施例6三维肝微球模型用于肝毒性评价的应用
将实施例1和4的三维微球评价模型用于T-2毒素的检测，包括以下步骤：
(1)给药刺激
将实施例1和4的三细胞、单细胞、双细胞的肝微球模型培养48h后，分别加入0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL的T-2溶液；其中T-2毒素采用DMSO溶解成5mg/mL的母液贮存，实验加药采用细胞培养液稀释成适宜的加药浓度；加药时同换液一样采用半数换液法，因此实际给药刺激的药物浓度分别为0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL。
(2)检测活死细胞的比例
加药培养24h后，尽量吸尽孔板中的培养液，每孔加入100μL含2μmol/L Calcein-AM和4.5μmol/L PI荧光探针的染色液，37℃孵育15min。孵育完成后弃去孔内液体，每孔加入100μL的PBS溶液清洗2次，每次5min。再加入100μL的DAPI染色液，37℃孵育10min，对细胞核进行染色，方便后面细胞计数。然后PBS清洗2次，清洗完成后加入100μL的PBS复溶，采用共聚焦显微镜拍摄荧光照片，并用Imaris软件对活细胞、死细胞以及细胞总数进行计数，并计算死细胞比例。
(3)结果分析
结果如图6所示，从图6可以看出：加药后死细胞比例的变化趋势与AFB1实验相似，总体与药物浓度呈现正相关性。但是对于不同的细胞而言，当药物作用浓度小于100ng/mL时，双细胞以及三细胞共培养的体系中死细胞比例与未加药组的差异不大。T-2作用浓度在10ng/mL时，三细胞共培养体系的死细胞比例即与单细胞的存在显著差异。药物浓度达到20ng/mL时，双细胞体系也与单细胞体系产生显著差异。这一实验结果同样验证了多细胞共培养体系对于低浓度药物刺激并不会引起细胞的显著损伤。而当药物浓度增加到1000ng/mL时，三细胞体系的死细胞比例依然小于单细胞体系。
人体中组织器官都不是单个细胞组成的，单细胞体系作为肝毒性评价模型存在很多缺陷，与人体的差异太大，汇集了三种具有特殊肝功能的细胞共培养的体系是更贴合人体的肝毒性评价模型。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种多细胞共培养的三维模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
将肝实质细胞、肝星形细胞、内皮细胞配制为混合细胞悬浮液；之后将混合细胞悬浮液加入超低吸附孔板，培养1-2天，得到所述的多细胞共培养的三维模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的混合细胞悬浮液中肝实质细胞、肝星形细胞以及内皮细胞的数量比为4：1：1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的肝实质细胞为人肝癌细胞HepG2，肝星形细胞为LX-2，内皮细胞为人脐静脉融合细胞EA.hy926。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的混合细胞悬浮液中肝实质细胞的浓度为5000cells/mL，肝星形细胞的浓度为1250cells/mL，内皮细胞的浓度为1250cells/mL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述超低吸附孔板中每孔加入200μL的混合细胞悬浮液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述的超低吸附孔板为96孔。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述的培养是在37℃下进行培养。
8.权利要求1-7任一项所述的方法构建得到的多细胞共培养的三维模型。
9.权利要求8所述的多细胞共培养的三维模型在肝毒性评价中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用是检测黄曲霉毒素B1或T-2毒素。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103509751A (zh) * 2013-07-08 2014-01-15 康珞生物科技（武汉）有限公司 人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法
CN108118079A (zh) * 2016-11-28 2018-06-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法
CN110004109A (zh) * 2019-04-01 2019-07-12 南通大学附属医院 一种肝癌类器官模型的体外构建方法
CN110684712A (zh) * 2018-07-05 2020-01-14 广东博溪生物科技有限公司 一种组织工程肝脏模型的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103509751A (zh) * 2013-07-08 2014-01-15 康珞生物科技（武汉）有限公司 人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法
CN108118079A (zh) * 2016-11-28 2018-06-05 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于定性滤纸的三维肝模型的药物肝毒性评价方法
CN110684712A (zh) * 2018-07-05 2020-01-14 广东博溪生物科技有限公司 一种组织工程肝脏模型的制备方法
CN110004109A (zh) * 2019-04-01 2019-07-12 南通大学附属医院 一种肝癌类器官模型的体外构建方法

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