CN103013923A

CN103013923A - 建立人卵巢癌动物模型的方法

Info

Publication number: CN103013923A
Application number: CN2012105909098A
Authority: CN
Inventors: 张建军; 刘珊玲; 谢晓砚; 陈新莲; 王和
Original assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Second University Hospital of Sichuan University
Priority date: 2012-12-29
Filing date: 2012-12-29
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及建立人卵巢癌动物模型的方法。本发明要解决的技术问题是提供建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法及模型建立方法。本发明提供了建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法，包括如下步骤：1）人卵巢癌细胞冻存；2）人卵巢癌冻存细胞复苏。本发明还提供了建立人卵巢癌动物模型的方法。本发明方法可用于建立人卵巢癌动物模型，并解决卵巢未见癌灶的难题。

Description

建立人卵巢癌动物模型的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法及模型建立方法。

背景技术

卵巢癌预后差，是导致女性因生殖系统恶性肿瘤病死率最高的癌症，因卵巢位于盆腔内位置深，发生肿瘤时无典型症状，确诊时60%～70%已属晚期，肿块已固定，出现腹水，广泛盆腔转移且卵巢癌化疗病情缓解后容易复发，5年生存率只有20%～30%。相比其他妇科肿瘤，卵巢癌早期诊断和治疗近来并无重大进展，患者生预后无明显转变。因此寻找和探索用于卵巢癌诊断和治疗的新技术,新方法变得非常重要。

动物模型是对人体肿瘤进行体内研究必不可少的工具，在建立新的治疗方法时尤为重要。目前建立的人卵巢癌裸鼠转移瘤模型大多来源于肿瘤细胞株，由于肿瘤细胞在体外培养，离开了体内环境，经过长期传代培养，消除了体内细胞与细胞之间的相互作用，不能完整模拟卵巢癌的生物学行为和自然生长过程，也会导致肿瘤细胞、生物学特性和遗传学特征的改变，由其来源的小鼠肿瘤模型的自然病程和病理类型及肿瘤表型自然不能完全代表临床患者，进而影响了实验结果的准确性和结论的可靠性，以及用于评估临床疗效与安全的权威性。

国内外也有把患者癌组织直接接种到裸鼠皮下或腹腔内并形成肿瘤模型的报道。皮下接种的肿瘤虽然容易观测，但未发现有其他部位的转移灶，尤其是腹腔（广泛腹腔播散是晚期卵巢癌临床特点之一），其应用价值受到限制。已报道的肿瘤腹腔内接种模型，虽然有腹腔内的癌灶扩散，但其卵巢本身并没有发现肿瘤转移灶，也有一定局限。

因此，当前本领域急需一种能克服现有技术缺点的建立一种能真正重现临床肿瘤发生发展的人卵巢癌的动物模型的方法。

发明内容

本发明的目的是提供人卵巢癌的动物模型建立方法。

本发明提供了建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法，包括如下步骤：

1）人卵巢癌细胞冻存：患者腹水置于无菌离心管中，300g离心5min，用冻存液重悬，-80℃保存24h后转入液氮中长期保存；

2）人卵巢癌冻存细胞复苏：取冻存的肿瘤细胞在37℃水浴中解冻，解冻时间≤30s，用高糖DMEM培养基（糖含量为4.5g/L）洗涤细胞1次，300g离心5min，PBS（磷酸盐缓冲液）重悬并调整细胞浓度至1~2×10⁷/mL；

前述所有操作均在无菌条件完成。

其中，所述的冻存液为含8%v/v DMSO（二甲基亚砜）的胎牛血清。

进一步的，步骤2）中PBS重悬并调整细胞浓度至10⁷/mL。

在操作开始前，患者腹水应置于冰上。

本发明提供了建立人卵巢癌动物模型的方法，包括如下步骤：在无菌条件下，将经前述方法处理后的组织材料接种至小鼠腹部；接种后第30周开始传代，第2代传代时间为92~98天，第3代后生长周期逐渐缩短并稳定，第3~6代传代时间为36~42天。

其中，上述方法中的接种采用注射器，行腹腔注射完成。

本发明的建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法也可以用于在模型建立后传代后肿瘤组织的处理。

本发明所使用的小鼠为NOD/SCID小鼠，鼠龄4周，体重15~20克，雌性，饲养在四川大学实验动物中心SPF（无特定病原体）屏障系统内，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

本发明的有益效果：

本发明方法通过将组织材料进行处理后再建立人卵巢癌动物模型，克服了目前人卵巢癌动物模型的种种问题，尤其是卵巢未见癌灶的难题。建立起了能稳定传代的人卵巢癌NOD/SCID小鼠动物模型，传代时间稳定，且每代的一次接种成功率达100%，鉴定结果迅速准确，远优于现有技术。经实验证明，使用本发明方法所建立的NOD/SCID鼠移植瘤模型再现了人卵巢癌的重要生物学特征，从病理组织学、免疫表型、分子生物学特征以及分子遗传学等方面均与供体病例基本一致，生长周期稳定。不仅解决了该肿瘤研究材料异质性的问题，同时由于模拟了该肿瘤在人体内生长情况，对该肿瘤发病的分子机制、肿瘤的演进的研究、治疗手段的探索、治疗药物的筛选及评价都有重要的实用价值，具有很好的应用前景。

附图说明

图1~5为人卵巢癌腹水瘤模型形态学观察

图1、右侧为荷瘤鼠，可见腹部明显胀大，左边为正常鼠

图2、腹腔内充满淡黄色腹水

图3、横膈及肝表面有转移结节

图4、肠系膜表面有转移结节

图5、腹膜上有转移结节

图6、荷瘤鼠生殖系统-子宫，输卵管，卵巢（右侧）与正常小鼠（左侧）比较

图7、为人卵巢癌动物模型卵巢转移。箭头所示可见卵巢里肿瘤组织占位明显，失去正常形态组织结构

图8、为人卵巢癌动物模型腹水细胞学涂片HE染色（苏木精-伊红染色）。可见细胞多数聚集成团，核深染，核质比增大

图9、为人卵巢癌动物模型核型分析。可见人类肿瘤染色体特征（小鼠核型以端着丝粒为主，二者差异明显）

图10、为人卵巢癌腹水瘤模型免疫细胞化学检测，EMA可见胞浆阳性。

图11、为人卵巢癌腹水瘤模型免疫细胞化学检测，Pan-cytokeatin可见胞浆阳性。

图12、为人卵巢癌腹水瘤模型免疫细胞化学检测，PCNA可见胞核阳性细胞较多，说明细胞繁殖速度较快

具体实施方式

实施例1接种人卵巢癌细胞

1、人卵巢癌腹水样本的采集和鉴定

收集四川大学华西第二医院手术中人卵巢低分化乳头状浆液性腺癌一例。经病理形态学检查、免疫表型检测，确诊为临床上常见的人卵巢低分化乳头状浆液性腺癌IIIC期。

2、实验动物

NOD/SCID小鼠，鼠龄4周，体重15-20克，雌性，饲养在四川大学实验动物中心SPF屏障系统内，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

3、肿瘤组织移植

所有操作均在无菌条件完成。

人卵巢癌细胞冻存：患者腹水（在操作开始前，患者腹水应置于冰上。）置于无菌离心管中，300g离心5min，用冻存液（含8%v/v DMSO的胎牛血清）重悬，-80℃保存24h后转入液氮中保存；

人卵巢癌冻存细胞复苏：取冻存的肿瘤细胞在37℃水浴中解冻30秒钟内，用高糖DMEM培养基（4.5g/L）洗涤细胞1次，300g离心5min，PBS重悬并调整细胞浓度至10⁷/mL；

酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，吸取细胞悬液于小鼠左下腹进针皮下穿行约0.4cm后进入腹腔，回抽无液体后将悬液注入。每个样本接种2只小鼠。所有操作在1小时内完成，注意全程无菌操作。

4、移植瘤观察及鼠间传代

接种后逐日观察鼠全身情况，移植部位有无感染，移植部位皮肤有无溃破等。

当见小鼠腹围明显变大时行鼠间传代

1）75%酒精消毒小鼠腹部皮肤后，用1mL注射器左下腹进针。皮下穿行约0.4cm后进入腹腔，回抽吸取腹水（即腹腔穿刺术），直接进行鼠间传代，一只小鼠可传1~5只（视需要而定）。

2）酒精棉球消毒拟传代小鼠腹部皮肤，吸取细胞悬液于小鼠左下腹进针。皮下穿行约0.4cm后进入腹腔，回抽无液体后将腹水注入。观察该传代荷瘤鼠全身情况，移植部位有无感染，移植部位皮肤有无溃破等。全程无菌操作。

其它模型传代方法是将小鼠处死之后，再取癌组织，进行传代。本模型与其它模型相比，其优点在于原代鼠传代时，不必处死，可继续观察，反复传代，反复抽取腹水供研究用（一般可反复抽取3~5次/只）。

5、移植瘤观察及鼠间传代

原代移植瘤潜伏期长达26周，26周后肿瘤开始生长，第30周传代。第2代传代时间为92~98天，第3代后生长周期逐渐缩短并稳定，第3~6代传代时间为36~42天，现移植瘤已稳定传至第6代。

6、接种结果

一次接种成功率：

第6代接种5只，成功率100%。

注：全程无菌操作。

实施例二人卵巢癌冻存细胞复苏传代实验：

1、细胞冻存

1）小鼠腹围明显变大后，同模型传代步骤获取腹水

2）75%酒精消毒小鼠腹部皮肤后，用1mL注射器左下腹进针。皮下穿行约0.4cm后进入腹腔，回抽吸取腹水（即腹腔穿刺术），转入15mL无菌离心管中

3）300g 5min离心，用冻存液（含8%DMSO的胎牛血清）重悬，1mL分装入冻存管（大约20管/只，细胞数约为10⁷/管）

4）放入程序降温盒，在-80℃低温冰箱中保存24小时后转入液氮中保存

2、细胞复苏

1）取动物模型的第1代、2代的冻存肿瘤细胞

2）分别将上述冻存细胞在37℃水浴中迅速解冻（30秒钟内）

3）在超净工作台内用高糖DMEM培养基（4.5g/L）洗涤细胞1次，300g离心5min。

4）PBS重悬并调整细胞浓度至10⁷/ml，取0.5ml接种于鼠龄为4周的健康NOD/SCID鼠腹腔内。注意要在30分钟内完成传代操作。

复苏NOD/SCID鼠移植瘤与原来源肿瘤生长周期及荷瘤情况相似。

实施例三人卵巢癌动物模型的鉴定

（一）鉴定实验项目

1、动物模型移植瘤种属鉴定

腹水细胞经含02ug/mL秋水仙素的l0％FBS（胎牛血清）的DMEM培养基培养2小时后收获染色体并行G显带分析。

2、病理形态学观察及免疫表型检测

免疫组织化学染色采用SABC法（Strept Avidin-Biotin Complex，链酶亲和素－生物素－过氧化物酶复合物）。所用第一抗体名称、克隆号、来源及特异性见表1。EMA为上皮膜抗原，各种上皮细胞及其来源的肿瘤表达该蛋白；Pan Cytokeratin为广谱细胞角蛋白，PCNA为增殖细胞核抗原。

表1免疫表型检测所用抗体及其特异性

抗体	克隆号	商品编号	阳性定位	工作浓度
					EMA抗体	GP1.4	BM0042	细胞膜	1︰500
Pan-cytokertain抗体	PCK26	BM0030	细胞浆	1︰500
					PCNA抗体	PC10	BM0104	细胞核	1︰500

注：上表中抗体均为单克隆抗体，购买自武汉博士德生物工程有限公司。

（二）实验结果

1、裸鼠移植瘤种属鉴定

腹水瘤的染色体检测结果显示为人类女性肿瘤核型，显示人体肿瘤在鼠体内移植传代过程中保持了人类肿瘤染色体特征。结果如图9所示，人卵巢癌动物模型核型分析：可见人类肿瘤染色体特征，小鼠核型以端着丝粒为主，二者差异明显。

2、动物模型病理形态学观察、免疫表型

2.1大体病理表现

NOD/SCID鼠接种腹水后主要表现为腹部膨胀（见图1，图2）、腹水形成，腹水量为2mL～8mL，淡黄色。腹水中可见大量肿瘤细胞，细胞计数约5～8×10⁷/mL，细胞异型性明显，核分裂相多见，呈团块状排列，可见到乳头状结构。腹水细胞学（见图8）。腹水瘤动物的主要脏器和淋巴结观察发现，肿瘤主要表现为盆腹腔、腹膜表面、腹壁、网膜、肠系膜及实质性器官表面及被膜下的癌性转移（见图3~5）。尤其可见双侧或单侧的卵巢转移（见图6），证实为卵巢低分化乳头状浆液性腺癌，与供体一致。肺、肾和脑肉眼未见明显异常。

2.2细胞学改变

细胞中等大小～中等偏大，圆形或椭圆形，胞浆少，淡染，大部分为细胞团细胞核大，呈圆形、卵圆形或不规则形，核染色质呈斑块状均匀分布，部分细胞可见有1~2个嗜碱性核仁，核分裂象3~10个/HPF，可见病理性核分裂（见图8）。

2.3免疫组织化学染色结果

肿瘤细胞免疫表型，见图10～12和表3。

表3动物模型肿瘤组织免疫表型

检测组织/抗体	EMA	Pan-cytokertain	PCNA
				结果	阳性	阳性	40%阳性

（三）、实验结果分析

本发明方法建立的人卵巢癌的动物模型，能再现卵巢癌的重要生物学特征，从病理组织学、免疫表型、况以及分子生物学特征等方面均与供体病例基本一致，具体表现如下：

（1）病理形态学：细胞异型性明显，核分裂相多见,呈团块状排列，可见到乳头状结构。移植瘤与原发瘤有相似的病理形态学表现，且移植瘤之肿瘤细胞更丰富，异形性更大，肿瘤间质更少。晚期，荷瘤鼠出现外周血、肝、脾、淋巴结、肾脏和肺等器官和组织的扩散，肿瘤细胞的形态亦与原位移植瘤相似。

（2）免疫表型：

EMA为上皮膜抗原，各种上皮细胞及其来源的肿瘤表达该蛋白；Pan Cytokeratin为广谱细胞角蛋白。细胞角蛋白主要表达在各种上皮细胞及其来源的肿瘤，如单纯性，角化和非角化鳞状上皮和假复层上皮等；PCNA为增殖细胞核抗原，常用作细胞增生的标志。本实验中EMA，Pan Cytokeratin二种抗原均为强阳性，证实了肿瘤细胞的上皮来源；PCNA阳性率约为40%，细胞增殖率高，

（3）种属来源：腹水细胞经含10%FBS的DMEM1640培养基培养2小时同时加秋水仙素使细胞终止在分裂中期，收获染色体并行G显带分析，显示为人类肿瘤染色体，数目在60～70之间（图9），证明了该移植瘤来源于人类。

由上述实例可知，采用本发明方法建立的模型从第3代后生长周期稳定，传代周期为30天左右，比现有方法短；一次接种成功率和复苏传代成功率均为100%，高于现有方法；通过种属鉴定证实了该移植瘤来源于人类，而且其病理形态学、免疫表型、及分子生物学特征等均与供体病例一致，经过一系列鉴定，符合异种移植瘤动物模型建立成功的主要标准，是一株优秀的人卵巢癌动物模型。本发明方法解决了现有卵巢癌模型不能真正代表卵巢癌恶性行为的问题，尤其是没卵巢癌转移及难于对模型进行鉴定等不足之处，具有很好的应用前景。

Claims

1.建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法，其特征在于：包括如下步骤：

2）人卵巢癌冻存细胞复苏：取冻存的肿瘤细胞在37℃解冻，解冻时间≤30s，用高糖DMEM培养基洗涤细胞1次，300g离心5min，PBS重悬并调整细胞浓度至1~2×10⁷/mL；其中，高糖DMEM培养基的含糖量为4.5g/L；

前述所有操作均在无菌条件完成。

2.根据权利要求1所述的建立人卵巢癌动物模型用组织材料的处理方法，其特征在于：所述的冻存液为含8%v/v DMSO的胎牛血清。

3.根据权利要求1或2所述的建立人卵巢癌动物模型用组织材料的处理方法，其特征在于：步骤2）中PBS重悬并调整细胞浓度至10⁷/mL。

4.建立人卵巢癌动物模型的方法，其特征在于：包括如下步骤：在无菌条件下，将经权利要求1~3任一项方法处理后的组织材料接种至小鼠腹部；接种后第30周开始传代，第2代传代时间为92~98天，第3代后生长周期逐渐缩短并稳定，第3~6代传代时间为36~42天。