CN107787961A - 用于保存异种移植瘤的冻存液及其冻存与复苏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于保存异种移植瘤的冻存液及其冻存、复苏的方法。该冻存液包括5％‑15％的二甲基亚砜、余量为胎牛血清。冻存的方法为将新鲜瘤块处理后置于冻存液中，用渐进冻存的方法，保存于液氮；复苏时采用快速融化的方法。本发明可提高细胞膜对水的通透性，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤，最大限度的保存组织细胞活力。通过本发明可避免冻存、复苏过程对患者来源异种移植瘤模型的损耗，为基于肿瘤患者来源异种移植瘤模型的药物筛选及实验研究提供支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于保存异种移植瘤的冻存液，尤其涉及一种用于保存肿瘤患者来源用于异种移植肿瘤块的冻存液及其冻存与复苏方法。
背景技术
肿瘤患者来源异种移植瘤模型(patient derived xenograft,PDX)是将患者的新鲜肿瘤组织直接移植到免疫缺陷鼠上而建立的肿瘤动物模型。该模型不仅成功地再现了患者肿瘤的分子生物学、组织学和病理学特点，更重要的是，这些肿瘤模型保留了肿瘤的间质细胞，以及形成远隔转移灶的能力和对某些药物的耐药性，具有与原始病人肿瘤相同的组织学特征并维持了病人肿瘤的异质性。基于以上特点，该模型可用于筛选新型抗肿瘤药物及药物疗效标志物，最终指导患者的个体化治疗。这对于肿瘤临床前期评估、治疗和预后具有及其重要的转化意义。
然而肿瘤患者来源异种移植瘤小鼠模型构建成功率低，成本相对较高，人源间质成分会随着多次传代而丢失，从而影响了该模型的广泛应用。因此，将成功建立的肿瘤患者来源异种移植瘤小鼠模型进行冻存，待实验时再复苏使用显得格外重要。通过肿瘤患者来源异种移植瘤块的冻存和复苏，不需要每次建立新的模型，从而实现一次建模永久使用，极大的降低了研究成本。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种用于保存异种移植瘤的冻存液及其冻存与复苏方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于保存异种移植瘤的冻存液，包括以体积百分比计的如下组分：5％-15％的二甲基亚砜，余量为胎牛血清。
进一步，上述用于保存异种移植瘤的冻存液是按照如下方法制备得到的：在胎牛血清中加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜的体积百分含量为5％-15％。
优选地，所述胎牛血清具体可为购自美国Invitrogen公司货号为16000-044的Gibco胎牛血清。
进一步，本发明提供的上述冻存液可应用于保存肿瘤患者来源用于异种移植的肿瘤块。
本发明还提供了一种保存肿瘤患者来源异种移植瘤块的冻存方法，包括如下步骤：
1)将肿瘤患者来源的待移植瘤块取下，置于含DMEM培养基的培养皿中；
2)清除新鲜移植瘤块表面包膜，去除肿瘤坏死组织，剪成18-27mm3大小；
3)将瘤块放入装有用于保存异种移植瘤的冻存液的冻存管中；
4)将冻存管放入预冷好的冻存盒中，并将冻存盒放到-80℃冰箱内，放置12-24小时；
5)将冻存管转移入液氮罐中。
优选地，步骤1)中所述肿瘤患者为小鼠肿瘤患者。
优选地，步骤3)中所述预冷冻存盒是将冻存盒置于0-4℃，15-45分钟。
本发明还提供了一种冻存肿瘤患者来源异种移植瘤块的复苏方法，包括如下步骤：
i)将保存于液氮中的冻存有肿瘤患者来源异种移植瘤块的冻存管取出，于36-38℃水浴，摇动，1-2分钟；
ii)将融化好的瘤块放到培养皿内，用水浴好的DMEM培养基冲洗1-3遍；
iii)将冲洗好的瘤块，放入到Matrigel和DMEM培养基体积比为1:1-2:1的混合物中，并置于冰上，复苏完成；
其中，步骤i)中所述冻存管内的冻存液为本发明所述用于保存异种移植瘤的冻存液。
进一步，复苏完成的异种移植瘤块应立即接种到移植受体的皮下，移植受体优选为小鼠。
优选地，步骤1)、2)、3)、ii)和iii)在超净工作台中进行。
本发明用于保存异种移植瘤的冻存液中加入的二甲亚砜可提高细胞膜对水的通透性，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤，用渐进冻存的方法，将异种移植瘤保存于液氮，复苏时采用快速融化的方法，最大限度的保存组织细胞活力。通过本发明可避免冻存、复苏过程对患者来源异种移植瘤模型的损耗，为基于肿瘤患者来源异种移植瘤模型的药物筛选及实验研究提供支持。
附图说明
图1为复苏前/后对肿瘤组织进行HE染色后显示病理特征图；
图2为复苏前/后肿瘤组织进行基因水平检测结果图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下面结合具体实施方式来介绍本发明的一种用于保存异种移植瘤的冻存液及其冻存与复苏方法。
实施例1
1.肿瘤患者来源异种移植瘤冻存液的制备
冻存液甲的制备方法：在DMEM中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为10％；
冻存液乙的制备方法：在DMEM中加入甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使甘油的体积百分含量为10％；
冻存液丙的制备方法：在DMEM中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)和甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为5％，甘油的体积百分含量为5％；
冻存液丁的制备方法：在胎牛血清中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为10％；
冻存液戊的制备方法：在胎牛血清中加入甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使甘油的体积百分含量为10％；
冻存液己的制备方法：在胎牛血清中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)和甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为5％，甘油的体积百分含量为5％；
2.肿瘤患者来源异种移植瘤块的冻存
1)处死小鼠后将移植瘤块取下，置于含DMEM培养基(Invitrogen公司；货号：11965-092)的100mm培养皿中；
2)清除新鲜移植瘤块表面包膜，去除肿瘤坏死组织，剪成18-27mm3大小，共18块；
3)将每3个瘤块放入一种装有冻存液的冻存管中，在冻存管壁标记肿瘤相关信息；
4)将冻存管放入预冷好(4℃，30分钟)的冻存盒中，并将冻存盒放到-80℃冰箱内，过夜；
5)将冻存管转移入液氮罐中。
3.肿瘤患者来源异种移植瘤块的复苏
i)将保存于液氮中的冻存管于6个月后取出，于36-38℃水浴，摇动1分钟30秒，使其全部融化；
ii)将冻存管转移至超净工作台并用酒精消毒冻存管口，将融化好的组织放到100mm培养皿内，用37℃水浴好的DMEM培养基(Invitrogen公司；货号：11965-092)冲洗3遍；
iii)将冲洗好的瘤块，放入到Matrigel(BD公司；货号：356234)和DMEM培养基(Invitrogen公司；货号：11965-092)体积比为1：1的混合物中，置于冰上并传入动物房；
iv)每种冻存液保存肿瘤组织分别接种到3只小鼠皮下；
v)连续观察90天，每种冻存液接种3只小鼠中有大于等于1只小鼠皮下肿瘤体积超过1000mm3，则认定为复苏成功。复苏结果见表一。
实施例2
1.肿瘤患者来源异种移植瘤冻存液的制备
冻存液甲的制备方法：在DMEM中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为10％；
冻存液乙的制备方法：在DMEM中加入甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使甘油的体积百分含量为5％；
冻存液丙的制备方法：在DMEM中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)和甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为5％，甘油的体积百分含量为5％；
冻存液丁的制备方法：在胎牛血清中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为5％；
冻存液戊的制备方法：在胎牛血清中加入甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使甘油的体积百分含量为10％；
冻存液己的制备方法：在胎牛血清中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)和甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为5％，甘油的体积百分含量为5％；
2.肿瘤患者来源异种移植瘤块的冻存
1)处死小鼠后将移植瘤块取下，置于含DMEM培养基(Invitrogen公司；货号：11965-092)的100mm培养皿中；
2)清除新鲜移植瘤块表面包膜，去除肿瘤坏死组织，剪成18-27mm3大小，共18块；
3)将每3个瘤块放入一种装有冻存液的冻存管中，在冻存管壁标记肿瘤相关信息；
4)将冻存管放入预冷好(4℃，30分钟)的冻存盒中，并将冻存盒放到-80℃冰箱内，过夜；
5)将冻存管转移入液氮罐中。
3.肿瘤患者来源异种移植瘤块的复苏
i)将保存于液氮中的冻存管于6个月后取出，于36-38℃水浴，摇动1分钟30秒，使其全部融化；
ii)将冻存管转移至超净工作台并用酒精消毒冻存管口，将融化好的组织放到100mm培养皿内，用37℃水浴好的DMEM培养基(Invitrogen公司；货号：11965-092)冲洗3遍；
iii)将冲洗好的瘤块，放入到Matrigel(BD公司；货号：356234)和DMEM培养基(Invitrogen公司；货号：11965-092)体积比为1：1的混合物中，置于冰上并传入动物房；
iv)每种冻存液保存肿瘤组织分别接种到3只小鼠皮下；
v)连续观察90天，每种冻存液接种3只小鼠中有大于等于1只小鼠皮下肿瘤体积超过1000mm3，则认定为复苏成功。复苏结果见表一。
实施例3
1.肿瘤患者来源异种移植瘤冻存液的制备
冻存液甲的制备方法：在DMEM中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为10％；
冻存液乙的制备方法：在DMEM中加入甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使甘油的体积百分含量为10％；
冻存液丙的制备方法：在DMEM中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)和甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为5％，甘油的体积百分含量为5％；
冻存液丁的制备方法：在胎牛血清中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为15％；
冻存液戊的制备方法：在胎牛血清中加入甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使甘油的体积百分含量为10％；
冻存液己的制备方法：在胎牛血清中加入二甲基亚砜(Sigma公司；货号：67-68-5)和甘油(Sigma公司；货号：56-81-5)，使二甲基亚砜的体积百分含量为5％，甘油的体积百分含量为5％；
2.肿瘤患者来源异种移植瘤块的冻存
1)处死小鼠后将移植瘤块取下，置于含DMEM培养基(Invitrogen公司；货号：11965-092)的100mm培养皿中；
2)清除新鲜移植瘤块表面包膜，去除肿瘤坏死组织，剪成18-27mm3大小，共18块；
3)将每3个瘤块放入一种装有冻存液的冻存管中，在冻存管壁标记肿瘤相关信息；
4)将冻存管放入预冷好(4℃，30分钟)的冻存盒中，并将冻存盒放到-80℃冰箱内，过夜；
5)将冻存管转移入液氮罐中。
3.肿瘤患者来源异种移植瘤块的复苏
i)将保存于液氮中的冻存管于6个月后取出，于36-38℃水浴，摇动1分钟30秒，使其全部融化；
ii)将冻存管转移至超净工作台并用酒精消毒冻存管口，将融化好的组织放到100mm培养皿内，用37℃水浴好的DMEM培养基(Invitrogen公司；货号：11965-092)冲洗3遍；
iii)将冲洗好的瘤块，放入到Matrigel(BD公司；货号：356234)和DMEM培养基(Invitrogen公司；货号：11965-092)体积比为1：1的混合物中，置于冰上并传入动物房；
iv)每种冻存液保存肿瘤组织分别接种到3只小鼠皮下；
v)连续观察90天，每种冻存液接种3只小鼠中有大于等于1只小鼠皮下肿瘤体积超过1000mm3，则认定为复苏成功。复苏结果见表一。
表一.不同冻存液配伍方案比较
vi)选取复苏成功率最高冻存液配伍方案(胎牛血清+10％二甲基亚砜)的复苏前/后肿瘤组织进行病理特征和基因水平检测。HE染色显示冻存前后病理组织结构不发生改变(图1)。U133及SNP6.0芯片检测结果，表明复苏前后不改变基因表达情况(图2)，平均相似性值分别为0.98和0.94。提示该冻存方法的优越性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于保存异种移植瘤的冻存液，其特征在于包括以体积百分比计的如下组分：5％-15％的二甲基亚砜，余量为胎牛血清。
2.如权利要求1所述的用于保存异种移植瘤的冻存液，其特征在于其是按照如下方法制备得到的：在胎牛血清中加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜的体积百分含量为5％-15％。
3.如权利要求1所述的用于保存异种移植瘤的冻存液，其特征在于二甲基亚砜的体积百分百含量为10％。
4.如权利要求1所述的用于保存异种移植瘤的冻存液，其特征在于所述胎牛血清为购自美国Invitrogen公司货号为16000-044的Gibco胎牛血清。
5.如权利要求1所述的用于保存异种移植瘤的冻存液在保存肿瘤患者来源用于异种移植的肿瘤块中的应用。
6.一种保存肿瘤患者来源异种移植瘤块的冻存方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将肿瘤患者来源的待移植瘤块取下，置于含DMEM培养基的培养皿中；
2)清除新鲜移植瘤块表面包膜，去除肿瘤坏死组织，剪成18-27mm3大小；
3)将瘤块放入装有用于保存异种移植瘤的冻存液的冻存管中；
4)将冻存管放入预冷好的冻存盒中，并将冻存盒放到-80℃冰箱内，放置12-24小时；5)将冻存管转移入液氮罐中。
7.如权利要求6所述的保存肿瘤患者来源异种移植瘤块的冻存方法，其特征在于步骤1)中所述肿瘤患者为小鼠肿瘤患者。
8.如权利要求6所述的保存肿瘤患者来源异种移植瘤块的冻存方法，其特征在于步骤3)中所述预冷冻存盒是将冻存盒置于0-4℃，15-45分钟。
9.一种冻存肿瘤患者来源异种移植瘤块的复苏方法，其特征在于包括如下步骤：
i)将保存于液氮中的冻存管取出，于36-38℃水浴，摇动，1-2分钟；
ii)将融化好的瘤块放到培养皿内，用水浴好的DMEM培养基冲洗1-3遍；
iii)将冲洗好的瘤块，放入到Matrigel和DMEM培养基体积比为1:1-2:1的混合物中，并置于冰上，复苏完成；
其中，步骤i)中所述冻存管内的冻存液为权利要求1中所述用于保存异种移植瘤的冻存液。
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