CN114634912B - 一种能够稳定传代的脊髓胶质瘤组织块及其冻存和复苏方法 - Google Patents

一种能够稳定传代的脊髓胶质瘤组织块及其冻存和复苏方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种脊髓胶质瘤组织块，所述脊髓胶质瘤组织块的保藏编号为CGMCC No.23030，该脊髓胶质瘤组织块能够在动物体内稳定传代，维持亲代胶质瘤的遗传特征并反映人类患者群体的异质性和多样性，在药物开发和肿瘤学研究领域具有重要意义。

Description

一种能够稳定传代的脊髓胶质瘤组织块及其冻存和复苏方法
技术领域
本申请涉及生物医学领域，具体地，涉及一种能够稳定传代的脊髓胶质瘤组织块及其冻存和复苏方法。
背景技术
肿瘤（tumour）是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物（neogrowth），因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物（neoplasm）。研究发现，肿瘤细胞会出现不同于正常细胞的代谢变化，同时肿瘤细胞自身可通过糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）之间的转换来适应代谢环境的改变。
脊髓胶质瘤是一种发生于椎管内髓内恶性肿瘤，与脑胶质瘤相比，其发病率较低，好发于青少年、有着独特的分子遗传特点。高级别脊髓胶质瘤从放化疗中获益有限，亟需依据脊髓星形细胞瘤自身特点来探索新的治疗方法。然而，脊髓胶质瘤尚没有可以开展基础实验研究的动物和细胞模型。建立可供研究脊髓胶质瘤生物学特征和治疗评估的动物脊髓胶质瘤模型显得尤为迫切。
因此，获得永生化、质量均一并且能够保留原肿瘤的生物学特性脊髓胶质瘤组织是实现临床治疗相关研究的基础和关键。
发明内容
本公开的目的在于提供一种能够稳定传代的脊髓胶质瘤组织块及其冻存和复苏方法，以解决现有技术中脊髓胶质瘤组织占比低、不易存活等导致不能对其充分探究等问题。
为了实现上述目的，本公开第一方面提供了一种分离的并且能够连续稳定传代培养的脊髓胶质瘤组织块，所述脊髓胶质瘤组织块的保藏编号为CGMCC No.23030。
根据本公开，其中，所述脊髓胶质瘤组织块能够在实验动物体内连续稳定地传代培养。
根据本公开，其中，所述实验动物为大鼠或小鼠，优选为NPG小鼠。
另一方面，本公开提供了上述脊髓胶质瘤组织块的冻存方法，该方法包括如下步骤：
S1、利用磷酸盐缓冲液清洗待冻存的脊髓胶质瘤组织；
S2、将清洗后的脊髓胶质瘤组织剪成组织块，并使用磷酸盐缓冲液再次冲洗所述组织块；
S3、向冲洗后的组织块中加入预冷的冻存液，重悬所述组织块，然后分装至冻存管中；
S4、将步骤S3获得的装有组织块的冻存管依次进行：3-5℃冷藏3-5h，15-25℃冷藏5-7h，零下70~零下90℃冷冻7-9h，最后在液氮中冷冻保存。
根据本公开，其中，所述预冷的冻存液包括含8-12体积%的二甲基亚砜的胎牛血清冻存液。
根据本公开，其中，步骤S3中所述预冷的冻存液的体积为所述组织块体积的10-20倍。
根据本公开，其中，所述组织块的长度为1-3mm，截面积为1-6mm2。
根据本公开，其中，步骤S3中所述预冷的冻存液包括含8-12体积%的二甲基亚砜的胎牛血清冻存液。
另一方面，本公开提供了第一方面所述脊髓胶质瘤组织块的复苏方法，其中，该方法包括：将利用上述冻存方法冻存得到的所述脊髓胶质瘤组织从液氮中取出，放置在35-38℃的水浴中解冻至融化，然后加入生理盐水混匀，再离心去掉上清液，得到复苏后的脊髓胶质瘤组织块。
另一方面，本公开提供了第一方面所述脊髓胶质瘤组织块在筛选治疗脊髓胶质瘤药物中的用途。
通过上述技术方案，本公开提供了一种脊髓胶质瘤组织块及其冻存和复苏方法，该脊髓胶质瘤组织块能够在动物体内稳定传代，维持亲代胶质瘤的遗传特征并反映人类患者群体的异质性和多样性，在药物开发和肿瘤学研究领域具有重要意义。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是脊髓胶质瘤组织块在小鼠体内成瘤图。
图2是连续传代的脊髓胶质瘤免疫组化测试图。
生物材料保藏信息
本公开涉及到的生物保藏信息包括：分类命名为：人源细胞；保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；邮政编码：100101；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2021-09-17；保藏编号为：CGMCC No.23030。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面提供了一种分离的并且能够连续稳定传代培养的脊髓胶质瘤组织块，所述脊髓胶质瘤组织块的保藏编号为CGMCC No.23030。
本公开提供的脊髓胶质瘤组织块，与脊髓胶质瘤手术中切除的肿瘤组织具有较高的相似程度，并且能够在实验动物体内连续稳定传代培养。
可选地，所述实验动物为大鼠或小鼠，优选为NPG小鼠，NPG小鼠为高度免疫缺陷小鼠。
另一方面，本公开提供了一种脊髓胶质瘤组织块的冻存方法，该方法包括如下步骤：
S1、利用磷酸盐缓冲液清洗待冻存的脊髓胶质瘤组织；
S2、将清洗后的脊髓胶质瘤组织剪成组织块，并使用磷酸盐缓冲液再次冲洗所述组织块；
S3、向冲洗后的组织块中加入预冷的冻存液，重悬所述组织块后，然后分装至冻存管中；
S4、将步骤S3获得的装有组织块的冻存管依次进行：3-5℃冷藏3-5h，15-25℃冷藏5-7h，零下70~零下90℃冷冻7-9h，最后在液氮中冷冻保存。
根据本公开，其中，步骤S3中所述预冷的冻存液包括含8-12体积%的二甲基亚砜的胎牛血清冻存液；
根据本公开，其中，步骤S3中所述预冷的冻存液的体积为所述脊髓胶质瘤组织块体积的10-20倍；
根据本公开，其中，所述组织块的长度为1-3mm，截面积为1-6mm2。
根据本公开，其中，步骤S3中所述预冷的冻存液包括含8-12体积%的二甲基亚砜的胎牛血清冻存液。
另一方面，本公开提供了一种脊髓胶质瘤组织块的复苏方法，其中，该方法包括：将利用上述冻存方法冻存得到的所述脊髓胶质瘤组织块从液氮中取出，放置在35-38℃的水浴中解冻至融化，然后加入生理盐水混匀，再离心去掉上清液，得到复苏后的所述肿瘤组织块。
另一方面，本公开提供了第一方面所述脊髓胶质瘤组织块在筛选治疗脊髓胶质瘤药物中的用途。
其中，可以将所述脊髓胶质瘤组织块在复苏后移植到实验动物（裸鼠）体内，使得所述脊髓胶质瘤组织在实验动物体内增殖，形成脊髓胶质瘤动物模型，该动物模型中的脊髓胶质瘤与脊髓胶质瘤手术中切除的肿瘤组织具有较高的相似性，也就是与脊髓胶质瘤患者体内的脊髓胶质瘤具有较高的相似性；将待筛选的药物对所述脊髓胶质瘤动物模型进行给药，并且测定所述筛选的药物对所述脊髓胶质瘤动物模型中的脊髓胶质瘤组织的大小等参数的改变情况，可以获得所述待测药物的准确疗效，因此具有较高的应用价值。
以下通过实施例进一步详细说明本公开。
实施例1
1、脊髓胶质瘤组织的移植、冻存、复苏
肿瘤组织的样本来源：脊髓胶质瘤手术中切除的肿瘤组织；
选取活性最好的病理样本保存于DMEM无血清培养基中，将新鲜脊髓胶质瘤样本冰浴条件下送于实验室，无菌条件下使用眼科镊和眼科剪去除样本组织上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用PBS清洗2-3次，将肿瘤机械分离为约3mm3大小组织块，并收集于冷PBS中。
免疫缺陷小鼠预先麻醉，接种部位备皮并用酒精擦拭消毒，切开约1cm切口，弯镊钝性分离后将准备好的组织块接种于皮下，缝合切口。
接种后定期观察小鼠活动情况，每三天测量一次肿瘤大小，游标卡尺测量肿瘤长径和短径，肿瘤体积mm3=长径×短径×短径×0.5；PDX小鼠荷瘤体积大于500mm3时可能影响小鼠生活行动，需进行肿瘤传代繁殖或者冻存操作。
传代步骤：荷瘤小鼠麻醉后予安乐处死，尽快切开皮肤剥离PDX肿瘤，剥离下组织于无菌条件下PBS清洗3次，并剪去肿瘤包膜及其他组织，将PDX肿瘤机械剪离为约3mm3大小组织块，收集于冷PBS中。按照上述移植的方法再次将组织块移植到免疫缺陷小鼠体内。
冻存处理：将肿瘤组织进行预处理：利用20mL的磷酸盐缓冲液清洗该脊髓胶质瘤组织，利用肿瘤组织剪切器将肿瘤组织剪成长度为2mm，截面积为4mm2的肿瘤组织块，经过2mL的磷酸盐缓冲液再次冲洗；向冲洗后的肿瘤组织块中加入15倍体积的含10%二甲基亚砜的胎牛血清，重悬所述肿瘤组织块后，再分装至冻存管中；将含有组织块的冻存管先后在4℃冷藏4h，20℃冷藏6h，-80℃冷冻8h，最后在-176℃液氮中冷冻备用。
复苏处理：将冻存得到的肿瘤组织块从液氮中取出，在37℃恒温水浴中解冻至全部冻存液开始融化，用移液管吸取解冻的肿瘤组织块，放入洁净的离心管，加入生理盐水混匀，离心去掉上清液，得到复苏的脊髓胶质瘤组织块。
将复苏得到的脊髓胶质瘤组织块尽快种植到小鼠体内。
对第一次将肿瘤组织种植到小鼠体内形成的肿瘤组织进行免疫组化染色检测，检测肿瘤组织的结构和性质：优选使用的抗体为中山金桥公司H3 K27M，Ki-67，GFAP，以及CST公司H3K27me3抗体，染色结果显示小鼠体内肿瘤的H3 K27M、星形细胞的标记物GFAP、以及细胞增殖标记物Ki-67染色均为强阳性。小鼠成瘤如图1所示，将脊髓胶质瘤组织块移植到小鼠背部后第15天，可见小鼠背部有6mm×8mm圆形肿块隆起；免疫组化结果如图2所示。
将上述得到的复苏脊髓胶质瘤组织块移植入小鼠体内进行传代培养：
连续传代3次，脊髓胶质瘤组织种植于免疫缺陷小鼠成功获得人源脊髓胶质瘤组织块，并稳定传代3代，第零代为患者来源肿瘤组织种植于小鼠获得，第一代和第二代为小鼠异种移植肿瘤组织传代获得，第三代为第二代组织冻存后复苏种植于小鼠获得，每一代小鼠体内均可成瘤。在相同检测条件下重新利用免疫组化染色法检测传代后的肿瘤组织，具体结果显示，这些肿瘤的H3K27M、星形细胞的标记物GFAP、以及细胞增殖标记物Ki-67染色均为强阳性，传代1-3次后的脊髓胶质瘤组织的免疫组化结果如图2所示。
可见，传代培养3代之后的脊髓胶质瘤组织块与体内培养后的原代肿瘤组织性质和结构相同，本申请提供的脊髓胶质瘤组织块能够在动物体内稳定传代培养，维持亲代脊髓胶质瘤的遗传特征。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (9)

1.一种分离的并且能够连续稳定传代培养的脊髓胶质瘤组织块，其特征在于，所述脊髓胶质瘤组织块的保藏编号为CGMCC No.23030。
2.根据权利要求1所述的脊髓胶质瘤组织块，其中，所述脊髓胶质瘤组织块能够在实验动物体内连续稳定地传代培养。
3.根据权利要求2所述的脊髓胶质瘤组织块，其中，所述实验动物为大鼠或小鼠。
4.权利要求1~3中任意一项所述脊髓胶质瘤组织块的冻存方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、利用磷酸盐缓冲液清洗待冻存的脊髓胶质瘤组织；
S2、将清洗后的脊髓胶质瘤组织剪成组织块，并使用磷酸盐缓冲液再次冲洗所述组织块；
S3、向冲洗后的组织块中加入预冷的冻存液，重悬所述组织块，然后分装至冻存管中；
S4、将步骤S3获得的装有组织块的冻存管依次进行：3-5℃冷藏3-5h，15-25℃冷藏5-7h，零下70~零下90℃冷冻7-9h，最后在液氮中冷冻保存。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤S3中所述预冷的冻存液的体积为所述组织块体积的10-20倍。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述组织块的长度为1-3mm，截面积为1-6平方毫米。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，步骤S3中所述预冷的冻存液包括含8-12体积%的二甲基亚砜的胎牛血清冻存液。
8.一种脊髓胶质瘤组织块的复苏方法，其特征在于，该方法包括：
将权利要求4~7中任意一项所述的方法冻存得到的脊髓胶质瘤组织块从液氮中取出，放置在35-38℃的水浴中解冻至融化，然后加入生理盐水混匀，再离心去掉上清液，得到复苏后的脊髓胶质瘤组织块。
9.权利要求1~3中任意一项所述的脊髓胶质瘤组织块在筛选治疗脊髓胶质瘤药物中的用途。
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