CN102578078A - 一种神经细胞的冻存液及冻存方法 - Google Patents
一种神经细胞的冻存液及冻存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102578078A CN102578078A CN201210023539XA CN201210023539A CN102578078A CN 102578078 A CN102578078 A CN 102578078A CN 201210023539X A CN201210023539X A CN 201210023539XA CN 201210023539 A CN201210023539 A CN 201210023539A CN 102578078 A CN102578078 A CN 102578078A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- frozen
- nerve cell
- nerve cells
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明公开了一种冻存神经细胞的细胞冻存液及冻存方法，用于冻存神经细胞，特别是新鲜分离的原代动物神经细胞，如海马神经细胞。本发明冻存液为在基础培养基中加入基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜、6-磷酸果糖和黄酮类物质，6-磷酸果糖(w/w)具有在使冻存的细胞复原时提高活细胞率（有效细胞率）的功能，黄酮类物质具有明确的抗氧化、可以抵御自由基对细胞的损伤。本发明提高神经细胞经过冻存的存活率以及细胞功能，复苏细胞存活率提高到95%以上，本发明神经细胞冻存液可以长期保存神经细胞，保证神经细胞生物学活性，具有很强的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞的冻存液及冻存方法。
背景技术
细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已深入广泛的应用。低温冷冻保存技术即将二甲亚砜和血清加入细胞悬液后放入冻存管中，置于-80℃冰箱内过夜后转入液氮中保存。对多种细胞来说，加入适宜的冷冻液，经过冻-融过程细胞仍可存活并可以继续培养。但多数情况适合于能在体外进行培养并长期存活的细胞，如骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞等。中国专利公告号CN 1164739C公开一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液，该发明配方为10％-30％的细胞培养液、60％-80％小牛血清和10％二甲基亚砜。所针对的细胞为普通动物组织细胞，甚至是肿瘤细胞，但是，对于神经细胞，因其中包含处于不同分化状态的细胞，在体外又不适于长期存活、生长、分化，对冻融损伤、能量缺乏的敏感性较强，将严重影响神经细胞复苏后的存活率和细胞活性。
与其它细胞类型相比，神经细胞能量代谢快，能量需求量大，尤以细胞分化时更甚。葡萄糖是神经元能量代谢必需的能源物质，葡萄糖有利于神经元生长，但葡萄糖浓度太高，就容易增加污染的机会。神经细胞冻存复苏后存活率较差、细胞活性较低，目前还未探索出一种较为理想的神经细胞冻存液和冻存方法，其原因主要与冻存液毒性、细胞能量缺乏等有关。
中国专利CN1966674A公开了一种冷冻保存神经干细胞的方法，该发明所采用的将15％2×DMSO导入胶原培养基中冻干，二甲基亚砜(DMSO)是细胞冻存常用的保护剂，无色透明液体，有很强的极性，可显著改变细胞内多种酶类的活性，从而有利于细胞的冻存，但二甲基亚砜使用浓度过高(≥10％)，对冻存细胞产生严重的毒性作用，与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性。因此，神经细胞冻存液的研制应该致力于保证神经细胞的活性和提高复苏后的存活率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种保持神经细胞活性，且提高细胞冻存复苏后存活率的冻存液，同时，也提供一种应用此冻存液进行神经细胞冻存的方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是，一种神经细胞的冻存液，所述冻存液包括基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜、6-磷酸果糖和黄酮类物质，其中各组分的重量比为：
基础培养基20-70重量份
胎牛血清20-50重量份
二甲基亚砜3-8重量份
6-磷酸果糖0.1-1重量份
黄酮类物质0.1-1重量份；
其中，所述基础培养基为Eagle′s MEM、DMEM、F12、或DMEM与F12的按1∶1的重量比的混合培养基。
其中，所述黄酮类物质为：4′，5，7-三羟基黄酮、5，6-二羟基-7，4′-二甲氧基黄酮、5，8，2′-三烃基-7-甲氧基黄酮或3′，4′，5，7-四羟基黄烷酮。
在本发明的神经细胞的冻存液中，黄酮类物质具有明确的抗氧化、可以抵御自由基对细胞的损伤。6-磷酸果糖具有在使冻存的细胞复原时提高活细胞率(有效细胞率)的功能，能在分子水平上调节细胞代谢中若干酶活性，恢复和改善细胞代谢，减轻细胞损伤，能促进血液循环，增加ATP合成。
本发明在神经细胞冻存液中含6-磷酸果糖、黄酮类物质和两种制剂。本发明含6-磷酸果糖和黄酮类物质的混合物有较好的效果，6-磷酸果糖和的黄酮类物质有显著的协同作用，可以显著提高神经细胞的活性和复苏后的存活率。
本发明还提供了一种神经细胞的冻存液的制备方法，即将所述各组分混合摇匀即成。
本发明还提供了一种神经细胞冻存方法，包括以下步骤：
A.冻存液制备：制备所述的神经细胞冻存液；
B.细胞悬液制备：培养生长成单层的神经细胞一瓶，0.25％胰蛋白酶液消化3分钟，弃胰酶液，加入RPMI-1640培养液10ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
C.冷冻：先将冻存管在0℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存1h，再放入-80℃冻存4h，最后移入液氮罐中保存；
D.细胞复苏：取出冻存管快速置于37℃水浴1-2min，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用10倍Hanks液稀释，1000r/min离心5min，离心，去除上清液，再重复3次。
所述细胞悬浮浓度为1×108细胞/ml～5×1010细胞/ml，以深低温保藏。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
(1)本发明的神经细胞冻存液和冻存方法，复苏细胞存活率可达95％-99％以上，较使用常规细胞冻存液的复苏存活率有了显著提高；
(2)本发明的神经细胞冻存液和冻存方法可以长期保存神经细胞，并且在长期保存后神经细胞活性不发生变化，保证了神经细胞生物学活性。
(3)本发明神经细胞冻存方法，操作简单可行，具有很强的实用价值。
(4)本发明冻存液配方中二甲基亚砜浓度低于10％，对冻存神经细胞无毒性作用。
具体实施方式
实施例1神经细胞冻存液的制备
一种神经细胞的冻存液，它由基础培养基，胎牛血清，二甲基亚砜，6-磷酸果糖和黄酮类物质组成。
按如下四个配方所列的物质和重量称取各组分(单位为克)：
制备上述各实施例的冻存液，只需将各组分按重量混合摇匀即成。
以下是应用上述四个冻存液中任意一个的冻存液对SD大鼠海马神经细胞的冻存与复苏效果。
神经细胞的冻存：
(1)冻存液制备：
(2)其中，本发明所述的商品化基础培养液Eagle′s MEM、DMEM、F12、或DMEM与F12的按1∶1的重量比的混合培养基。之后采用0.22um的滤膜过滤除菌。配置好的培养液置于4℃储存。
(3)细胞悬液制备：培养生长成单层的神经细胞一瓶，0.25％胰蛋白酶液消化3分钟，弃胰酶液，加入RPMI-1640培养液10ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/10分钟，弃上清，加入步骤(1)冻存液2ml/管，混均，置入洁净冻存小管；
(4)冷冻：先将冻存管在0℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存1h，再放入-80℃冻存4h，最后移入液氮罐中长期保存。
(5)细胞复苏：1个月后取出冻存管快速置于37℃水浴1-2min，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用10倍Hanks液稀释，1000r/min离心5min，离心，去除上清液，再重复3次。
海马神经细胞复苏效果：
在倒置显微镜下观察，大鼠海马神经细胞接种6～8h开始贴壁，单个分散，呈圆形。48h后基本完全贴壁，细胞开始变扁平，大小均匀，折光性好，并开始长出1～2个突起。4d后，神经元数量进一步增多，突起进一步增长。经免疫细胞化学检测NSE染色阳性，胞体和突起呈明显的棕黄色或深棕色，表达强度不一，阳性细胞(纯度)≥90％。而神经胶质细胞也开始迅速分裂增殖，神经元生长成单层，继续传代培养，完成了细胞复苏生长繁殖周期。复苏后海马神经细胞活率为(96.2±1.4)％。
试验1 6-磷酸果糖和黄酮类物质协调作用
单层贴壁培养方式下，使用添加6-磷酸果糖和黄酮类物质成分的冻存液与不含6-磷酸果糖和黄酮类物质成分的冻存液的结果差别：
表1培养的海马神经元的细胞活力和存活率(％)
传统冻存组：采用中国专利公告号CN 1164739C公开的细胞冻存液，该发明配方为10％-30％的细胞培养液、60％-80％小牛血清和10％二甲基亚砜。
由实验数据，在神经细胞冻存液中添加6-磷酸果糖和和黄酮类物质两种制剂的混合物。本发明添加6-磷酸果糖和黄酮类物质的混合物有较好的效果，0.1-2％的6-磷酸果糖和0.1-1％的黄酮类物质有显著的协同作用，可以显著提高神经细胞的活性和复苏后的存活率。1％的6-磷酸果糖和0.5％的黄酮类物质有最好的效果。
实施例2 SD大鼠大脑皮层神经细胞、脊髓神经细胞、外周神经细胞的冻存与复苏效果
(1)冻存液制备：
(2)细胞悬液制备：培养生长成单层的神经细胞一瓶，0.25％胰蛋白酶液消化3分钟，弃胰酶液，加入RPMI-1640培养液10ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/10分钟，弃上清，加入步骤(1)冻存液2ml/管，混均，置入洁净冻存小管；
(3)冷冻：先将冻存管在0℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存1h，再放入-80℃冻存4h，最后移入液氮罐中长期保存。
(4)细胞复苏：1个月后取出冻存管快速置于37℃水浴1-2min，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用10倍Hanks液稀释，1000r/min离心5min，离心，去除上清液，再重复3次。
(5)细胞复苏效果细胞冻存性能
在倒置显微镜下观察复苏后的细胞状态，大脑皮层神经细胞、脊髓神经细胞、外周神经细胞均见细胞大面积贴壁生长，细胞形态好，大小均匀，折光性好；神经元数量进一步增多，突起进一步增长，而神经胶质细胞也开始迅速分裂增殖大脑皮层神经细胞细胞复苏率约85％，脊髓神经细胞细胞复苏率约95％，外周神经细胞复苏率约93％；培养48小时后，细胞生长成单层，继续传代培养；完成了细胞复苏生长繁殖周期。
表2 SD大鼠海马神经细胞的存活率与贴壁率(％)
传统冻存组：采用中国专利公告号CN 1164739C公开的细胞冻存液，该发明配方为10％-30％的细胞培养液、60％-80％小牛血清和10％二甲基亚砜。
从表2中可见采用本发明冻存液，神经细胞均保持较高的存活率和贴壁率。
Claims (5)
1.一种神经细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液包括基础培养基、胎牛血清、二甲基亚砜、6-磷酸果糖和黄酮类物质，其中各组分的重量比为：
基础培养基20-70重量份
胎牛血清20-50重量份
二甲基亚砜3-8重量份
6-磷酸果糖0.1-1重量份
黄酮类物质0.1-1重量份；
其中，所述基础培养基为Eagle＇s MEM、DMEM、F12、或DMEM与F12的按1：1的重量比的混合培养基。
2. 根据权利要求1所述的神经细胞的冻存液，其特征在于，所述黄酮类物质为：4',5,7-三羟基黄酮、5, 6-二羟基-7, 4'-二甲氧基黄酮、5，8，2'-三烃基-7-甲氧基黄酮或3',4',5,7-四羟基黄烷酮。
3.一种神经细胞的冻存液的制备方法，将所述各组分混合摇匀即成。
4.一种使用权利要求1所述的神经细胞的冻存液的神经细胞冻存方法，包括以下步骤：
A．冻存液制备：制备如权利要求1所述的神经细胞冻存液；
B．细胞悬液制备：培养生长成单层的神经细胞一瓶，0.25%胰蛋白酶液消化3分钟，弃胰酶液，加入RPMI-1640培养液10ml，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，离心4000转/分，弃上清，加入步骤A冻存液2ml，混均，置入无菌的冻存管内；
C．冷冻：先将冻存管在0℃下冻存30min，然后放入-30℃冻存1h，再放入-80℃冻存4h，最后移入液氮罐中保存；
D．细胞复苏：取出冻存管快速置于37℃水浴1-2min，震荡直至细胞悬液完全融化，然后用10倍Hanks液稀释，1000r/min离心5min，离心，去除上清液，再重复3次。
5.根据权利要求4所述的神经细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞悬浮浓度为1×108细胞/ml～5×1010细胞/ml，以深低温保藏。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210023539 CN102578078B (zh) | 2012-02-02 | 2012-02-02 | 一种神经细胞的冻存液及冻存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201210023539 CN102578078B (zh) | 2012-02-02 | 2012-02-02 | 一种神经细胞的冻存液及冻存方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102578078A true CN102578078A (zh) | 2012-07-18 |
| CN102578078B CN102578078B (zh) | 2013-06-19 |
Family
ID=46467768
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201210023539 Expired - Fee Related CN102578078B (zh) | 2012-02-02 | 2012-02-02 | 一种神经细胞的冻存液及冻存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102578078B (zh) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105454222A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-04-06 | 河南省银丰生物工程技术有限公司 | 一种细胞冻存液及其制备方法和应用 |
| CN105866445A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-08-17 | 青岛古高生物科技有限公司 | 一种液相凝血酶时间测定试剂及其制备方法 |
| CN106942201A (zh) * | 2017-04-21 | 2017-07-14 | 武汉理工大学 | 利用受限空间中超分子水凝胶冻存雪旺细胞的方法 |
| CN107347875A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-17 | 河南省银丰生物工程技术有限公司 | 一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法 |
| CN107949277A (zh) * | 2015-08-31 | 2018-04-20 | 石原产业株式会社 | 脏器或组织的保存剂和脏器或组织的保存方法 |
| CN108552160A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-09-21 | 武汉波睿达生物科技有限公司 | 一种直接静脉回输的car-t细胞冻存液及其制备方法和应用 |
| CN109329269A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-02-15 | 深圳先进技术研究院 | 一种组织和细胞冻存液及其冻存方法 |
| CN110338188A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-10-18 | 首都医科大学附属北京天坛医院 | 一种神经元冻存液及神经元冻存、复苏方法 |
| CN110199985B (zh) * | 2019-06-14 | 2021-12-14 | 首都医科大学附属北京天坛医院 | 一种神经元冻存液的制备方法 |
| CN114634912A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-06-17 | 北京市神经外科研究所 | 一种能够稳定传代的脊髓胶质瘤组织块及其冻存和复苏方法 |
| WO2022133247A3 (en) * | 2020-12-17 | 2022-08-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Composition and method of preserving viability of cell in a low temperature environment |
| CN115299433A (zh) * | 2022-08-03 | 2022-11-08 | 深圳知因细胞生物科技有限公司 | 一种利用皂苷和黄酮促生长的成体干细胞低温保存冻存液 |
| CN116569916B (zh) * | 2023-07-13 | 2023-11-28 | 九天览月生物科技(天津)有限公司 | 一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1412301A (zh) * | 2002-12-05 | 2003-04-23 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液 |
| CN1966674A (zh) * | 2005-11-18 | 2007-05-23 | 王智 | 一种蜘蛛中枢神经细胞培养液 |
-
2012
- 2012-02-02 CN CN 201210023539 patent/CN102578078B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1412301A (zh) * | 2002-12-05 | 2003-04-23 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液 |
| CN1966674A (zh) * | 2005-11-18 | 2007-05-23 | 王智 | 一种蜘蛛中枢神经细胞培养液 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 柯春龙等: "冻存时间对复苏后胚胎大鼠神经干细胞体外诱导向多巴胺能神经元分化的影响", 《中国临床康复》 * |
| 王洪美等: "两种冻存液中海马神经元细胞复苏后生物学特性比较", 《解剖学杂志》 * |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11246309B2 (en) | 2015-08-31 | 2022-02-15 | Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. | Preserving agent for organs or tissue and preservation method for organs or tissue |
| CN107949277A (zh) * | 2015-08-31 | 2018-04-20 | 石原产业株式会社 | 脏器或组织的保存剂和脏器或组织的保存方法 |
| CN105454222B (zh) * | 2016-02-02 | 2018-10-30 | 河南省银丰生物工程技术有限公司 | 一种细胞冻存液及其制备方法和应用 |
| CN105454222A (zh) * | 2016-02-02 | 2016-04-06 | 河南省银丰生物工程技术有限公司 | 一种细胞冻存液及其制备方法和应用 |
| CN105866445A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-08-17 | 青岛古高生物科技有限公司 | 一种液相凝血酶时间测定试剂及其制备方法 |
| CN106942201B (zh) * | 2017-04-21 | 2019-10-25 | 武汉理工大学 | 利用受限空间中超分子水凝胶冻存雪旺细胞的方法 |
| CN106942201A (zh) * | 2017-04-21 | 2017-07-14 | 武汉理工大学 | 利用受限空间中超分子水凝胶冻存雪旺细胞的方法 |
| CN107347875A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-11-17 | 河南省银丰生物工程技术有限公司 | 一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法 |
| CN108552160A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-09-21 | 武汉波睿达生物科技有限公司 | 一种直接静脉回输的car-t细胞冻存液及其制备方法和应用 |
| CN109329269A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-02-15 | 深圳先进技术研究院 | 一种组织和细胞冻存液及其冻存方法 |
| CN110199985B (zh) * | 2019-06-14 | 2021-12-14 | 首都医科大学附属北京天坛医院 | 一种神经元冻存液的制备方法 |
| CN110338188B (zh) * | 2019-06-14 | 2021-08-31 | 首都医科大学附属北京天坛医院 | 一种神经元冻存液及神经元冻存、复苏方法 |
| CN110338188A (zh) * | 2019-06-14 | 2019-10-18 | 首都医科大学附属北京天坛医院 | 一种神经元冻存液及神经元冻存、复苏方法 |
| WO2022133247A3 (en) * | 2020-12-17 | 2022-08-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Composition and method of preserving viability of cell in a low temperature environment |
| CN114634912A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-06-17 | 北京市神经外科研究所 | 一种能够稳定传代的脊髓胶质瘤组织块及其冻存和复苏方法 |
| CN114634912B (zh) * | 2022-05-16 | 2022-08-26 | 北京市神经外科研究所 | 一种能够稳定传代的脊髓胶质瘤组织块及其冻存和复苏方法 |
| CN115299433A (zh) * | 2022-08-03 | 2022-11-08 | 深圳知因细胞生物科技有限公司 | 一种利用皂苷和黄酮促生长的成体干细胞低温保存冻存液 |
| CN115299433B (zh) * | 2022-08-03 | 2023-10-31 | 深圳知因细胞生物科技有限公司 | 一种利用皂苷和黄酮促生长的成体干细胞低温保存冻存液 |
| CN116569916B (zh) * | 2023-07-13 | 2023-11-28 | 九天览月生物科技(天津)有限公司 | 一种冻存细胞、细胞冻存液、冻存方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102578078B (zh) | 2013-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102578078B (zh) | 一种神经细胞的冻存液及冻存方法 | |
| CN102459572B (zh) | 银杏科的形成层来源的植物干细胞及其分离方法 | |
| CN103484432B (zh) | 一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途 | |
| CN102533654B (zh) | 一种新生大鼠海马神经元原代培养的培养液及其制备方法和应用 | |
| CN101037666B (zh) | 一种动物细胞的低温保存溶液及保存方法 | |
| CN104082355A (zh) | 一种含天然提取物的植物生长促进剂 | |
| CN106256203B (zh) | 一种干细胞冻存体系及其使用方法 | |
| CN110396495A (zh) | 喜马拉雅紫茉莉愈伤组织、增殖方法与悬浮细胞繁殖方法 | |
| ES2617178T3 (es) | Algas de cepas planctónicas Parachlorella nurekis 1904 KIEG y su uso para exterminar cianobacterias, bacterias y hongos | |
| Dadkhah | Effect of salt stress on growth and essential oil of Matricaria chamomilla | |
| CN108823143A (zh) | 一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法 | |
| CN102550543B (zh) | 用于保存脐带组织的液体 | |
| CN103789267A (zh) | 一种改进的海马神经元原代培养方法 | |
| CN103805565A (zh) | 海马神经元分离和原代培养方法及试剂 | |
| CN103789268A (zh) | 一种分离培养海马神经细胞的方法及其专用培养液 | |
| CN104026132B (zh) | 一种小麦抗寒调节剂制备方法 | |
| CN101550408A (zh) | 人体外周血淋巴细胞培养基及其应用 | |
| CN107242250A (zh) | 一种小麦抗寒诱导剂及其施用方法 | |
| CN102321569B (zh) | 一种石鲽肝脏细胞系的构建方法 | |
| CN102342248A (zh) | 马铃薯茎尖脱毒育种方法及双层培养基 | |
| CN109864964B (zh) | 一种包含干细胞的抗衰老组合物及其应用 | |
| CN107927007B (zh) | 一种可提高杂交鹅掌楸体胚幼苗抗逆和具有促生作用的组合物及其应用 | |
| CN104962549B (zh) | 一种沼泽红假单胞菌同步化浓缩的方法及应用 | |
| CN101884321A (zh) | 一种新疆雪莲细胞系的超低温冷冻保存方法 | |
| CN104673701A (zh) | 一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130619 Termination date: 20150202 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |