CN101884321A - 一种新疆雪莲细胞系的超低温冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种中药材新疆雪莲细胞系的超低温冷冻保存技术。在保存中首先选择合适的细胞系，然后分别用0.2M山梨醇溶液和0.4M山梨醇溶液进行保存前的预处理，最后再用冷冻保护剂对细胞系进行包埋，包埋完成后即可直接投入到液氮中进行超低温冷冻保存，冷冻好的细胞在1.2M蔗糖溶液中洗涤之后即可进行正常培养，成活率可达60％以上。
Description
技术领域
本发明专利申请涉及一种中药材新疆雪莲的种植保存技术，特别是新疆雪莲细胞系的超低温冷冻保存技术。
背景技术
雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.et Maxim.)菊科凤毛菊属雪莲亚属的草本植物。雪莲是高山地区的民间药用植物，用于散寒除湿、活血通经、抗炎镇痛等，民间多用于风湿性关节炎、妇女小腹冷痛、闭经，胎衣不下、麻痹不透、肺寒咳嗽、阳痿、高山不适应症等症的治疗。近年来，雪莲作为民族药在抗炎镇痛、抗早孕、抗衰老及抑制癌细胞增生方面的作用倍受关注。但我国雪莲主要分布在4000m以上的高原寒带地区，如新疆、甘肃、四川、云南和西藏。这些地区气候多变，冷热无常，最高月平均气温3-10℃，最低月平均气温则在零下十几度到几十度，生长环境十分恶劣，只有耐寒的苔草属、蒿草属以及少数高山多年生草本植物与之伴生，一般在此环境下的雪莲植物大多为多年生，生长缓慢，人工栽培困难，长期以来掠夺性采挖已使雪莲资源严重匮乏，已使得雪莲成为濒危物种，自然资源难以满足临床日益增长的需要。由于雪莲资源的紧张，许多科研单位都开始研究代替野生种植方法获得雪莲资源的生产方法，其中以雪莲细胞的室内培养研究的最多，应用的也最广，目前已经有许多公司将雪莲细胞用于产业化生产。
超低温冷冻保存技术是一种建立在减少或停止生物体的新陈代谢从而减缓或暂停其生命活动的一种生物技术，其实现是将生物体投入到液氮中实现的。由于超低温保存可以实现延缓甚至暂停生命活动的作用。
组织培养技术是种质保存的有效途径之一，利用这种技术可迅速建立植物无性繁殖系，其缺点在于长期继代培养过程中要发生细胞学变化，导致染色体变异和基因突变，增加遗传的不稳定性。在超低温条件(一般指液氮低温，-196℃)下，几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止进行，但细胞活力和形态发生的潜能却可保存，因而细胞培养物的遗传稳定性得以保存。将超低温冷冻保存技术和组织培养技术结合起来，可望成为保存植物种质的最佳办法。
植物组织培养物的超低温保存是指在-80℃以下的超低温环境中保存种质资源，是70年代发展起来的一套现代生物学保存技术。常以液氮为冷源，因此超低温保存又称液氮保存。植物材料的特性和材料的预培养对超低温保存植物组织培养物的成活关系很大。另外，低温冰冻会使细胞内水结冰，造成细胞结构不可逆的破坏，导致死亡。组织培养物含大量的水分，因此，冰冻防护剂的使用、降温及解冻方法是植物组织培养物保存的几个关键因素。
发明内容
本专利发明为一种雪莲细胞超低温冷冻保存技术，具体方法如下：
首先是材料准备：用于超低温冷冻保存的保存材料为固态培养基中培养10-15天的雪莲细胞。用于其培养的培养基为：MS+NAA 0.1-2.0mg/L+6-BA 0.1-2.0mg/L+蔗糖30g/L；
用于雪莲超低温冷冻保存的冷冻保护剂为含有15％DMSO、15％PEG、30％甘油以0.4M蔗糖或山梨醇的细胞系液态营养液；用于雪莲超低温冷冻保存的前期处理试剂为处理剂A(其配方为含有0.2M山梨醇的液态营养液)和B(含有0.4M山梨醇的液态营养液)；用于保存细胞洗涤的溶液为含有1.2M蔗糖的液态营养液。配置好的培养基密封好后，采用高压蒸汽的方式进行灭菌，灭菌时间为15-30min；
当材料都准备好后即可开始保存过程：
首先是预处理，将选择好的细胞系投入到A处理液中进行摇床培养，培养温度为(25±1)℃，摇床转速为90-130r/min，24-72小时后取上清，加入b处理液，在同样条件培养24-72h
预处理完成后即可进行冷冻前的保护剂处理，处理方法为：
将经过预处理的细胞系，去掉多余的营养液，加入全剂量冷冻保护剂处理10min后，快速投入到液氮当中。冷冻细胞的解冻：取出冷冻管快速投入到37℃的水浴锅中解冻2min，当其全部融化后，将细胞转入到含有1.2M蔗糖的液态营养液中进行洗涤完成后转入正常培养基进行培养。
具体实施方式
实例一 冷冻材料的处理方法比较
处理方案
①固态培养10天的雪莲细胞；25％PVS2常温处理10min；100％PVS2 0℃脱水10min；直接投入LN中。
②固态培养12天的雪莲细胞；0.2M D-山梨醇处理24h；0.4M D-山梨醇处理48h；25％PVS2常温处理10min；100％PVS2 0℃脱水10min；直接投入LN中
③固态培养15天的雪莲细胞：0.2M D-山梨醇处理24h；0.4M D-山梨醇处理48h；5％PVS2预处理24h；25％PVS2常温处理10min；100％PVS2 0℃脱水10min；直接投入LN中
解冻方法：37℃快速化冻1.5min后，迅速将细胞转入到1.2M蔗糖液态营养液10ml洗涤，完成后去上清余少量液态营养液导入固态培养瓶后，倒掉多余营养液培养固态培养
结果：三种处理方式下解冻得到的细胞都有存活细胞，
结论：三种冷冻保存处理方式均可用于雪莲的超低温冷冻保存，那一个更好一些需要进一步优化比较
实例二 冷冻保护剂PVS2中利用山梨醇代替蔗糖
实验一
①固态培养10天的雪莲细胞；100％PVS2 脱水10min；直接投入LN中。
②固态培养12天的雪莲细胞；0.2M D-山梨醇处理48h；0.4M D-山梨醇处理48h；100％PVS2 0℃脱水10min；直接投入LN中
③固态培养15天的雪莲细胞：0.2M D-山梨醇处理48h；0.4M D-山梨醇处理48h；100％PVS2脱水10min；直接投入LN中
解冻方法：37℃快速化冻1.5min后，迅速将细胞转入到1.2M蔗糖液态营养液10ml 10min；洗涤完成后，去上清余少量液态营养液导入固态培养瓶后，倒掉多余营养液培养固态培养
实验二
材料：固态培养12的雪莲细胞
预处理方案：
方案①0.2M D-山梨醇处理48h；0.4M D-山梨醇处理48h
方案②不进行任何处理
冷冻保护剂：PVS2(蔗糖)与PVS2(山梨醇)
处理方法：100％PVS2处理10min迅速投入LN中。
解冻方法：1.2M蔗糖液态营养液10min；去上清1.2M蔗糖液态营养液10min；去上清1.2M蔗糖液态营养液10min；固态培养
解冻时间18天
结果：PVS2(蔗糖)与PVS2(山梨醇)处理下的细胞都有存活
结论：PVS2(蔗糖)与PVS2(山梨醇)均可用于雪莲的超低温冷冻保存，并且差别不太明显从成本上看建议用蔗糖组。
实例三 洗涤方法的改进
洗涤方法：1.0M蔗糖液态营养液10min；去上清1.0M蔗糖液态营养液10min；去上清1.0M蔗糖液态营养液10mn；
实验一
①固态培养10天的雪莲细胞；100％PVS2 脱水10min；直接投入LN中。
②固态培养12天的雪莲细胞；0.2M D-山梨醇处理24h；0.4M D-山梨醇处理24h；100％PVS2 0℃脱水10min；直接投入LN中
③固态培养15天的雪莲细胞：0.2M D-山梨醇处理24h；0.4M D-山梨醇处理24h；；100％PVS2脱水10min；直接投入LN中
解冻方法：37℃快速化冻1.5min后，迅速将细胞转入到1.2M蔗糖液态营养液10ml 10min；洗涤完成后，去上清余少量液态营养液导入固态培养瓶后，倒掉多余营养液培养固态培养
实验二：
材料：固态培养12的雪莲细胞
预处理方案：
方案①0.2M D-山梨醇处理24h；0.4M D-山梨醇处理24h
方案②不进行任何处理
冷冻保护剂：PVS2(蔗糖)与PVS2(山梨醇)
处理方法：100％PVS2处理10min迅速投入LN中。
解冻方法：1.2M蔗糖液态营养液10min；去上清1.2M蔗糖液态营养液10min；去上清1.2M蔗糖液态营养液10min：洗涤后进行固态培养。
解冻时间18天
结果：该洗涤方法洗涤后得到的细胞有明显的生长现象
结论：该改进的洗涤方法完全可用于雪莲的超低温冷冻保存
实例四 解冻后细胞培养方式改进：液态培养
材料：固态培养12的雪莲细胞
预处理方案：：
方案①0.2M D-山梨醇处理24h；0.4M D-山梨醇处理24h
冷冻保护剂：PVS2(蔗糖)与PVS2(山梨醇)
处理方法：100％PVS2处理10min后，迅速投入LN中。
解冻方法：1.2M蔗糖液态营养液10摇床培养30min后，调整逐步调整洗涤液中蔗糖的浓度至正常营养液状态，调整方法为加入液态营养液调整蔗糖浓度至0.6M后处理5min，然后继续调整至0.3M 5min；调整至0.15M 5min，去上清加入新鲜液态营养液摇床100r/min摇床培养
解冻时间：冷冻4天后
结果：解冻后的细胞无存活现象
结论：液态培养在该方法下不适合解冻后的细胞的再培养
通过以上实验我们拿到了可以用于雪莲超低温冷冻保存的方法，并得到了冷冻过程中的主要注意事项，我们完全可以通过本方法对雪莲细胞进行超低温冷冻保存
1保存材料
固态培养基中培养10-15天的雪莲细胞
2试剂
DMSO，甘油，乙二醇，d-山梨醇，蔗糖 常规MS培养基所用物品
3仪器与耗材
液氮罐，三角瓶，2ml螺口冷冻管，烧杯，制冰机或冷冻冰箱
4冷冻保护剂
PVS2(15％DMSO+30％甘油+15％乙二醇+0.4M蔗糖或山梨醇)
5预处溶剂
0.2M d-山梨醇的液态营养液，0.4M d-山梨醇的液态营养液
6处理方案
0.2M d-山梨醇的液态营养液预处理24-72h，0.4M d-山梨醇的液态营养液 预处理24-72h，100％PVS2处理10min后，迅速投入液氮。
7解冻与解冻后的培养方案
从液氮罐中取出冷冻管后迅速投入37℃的水浴锅中解冻90-120S，擦净表面的水分后转入超净工作台开盖，倒入1.2M的蔗糖液态营养液，常温洗涤10min-30min；最后倒入到固态培养瓶中，去掉洗涤液转入正常固态培养基培养。
Claims (3)
1.新疆雪莲细胞系的超低温冷冻保存其特征包括：细胞系营养液的制备，超低温冷冻保护剂的选择，超低温冷冻保存程序，保存材料的选择，保存后材料的解冻方式
2.根据权利要求1所述的新疆雪莲细胞系的超低温冷冻保存过程主要包括以下几个特征：
(1)：细胞系液态营养液为：MS+0.1-2.0mg/L NAA+0.1-2.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖：
(2)：冷冻保护剂的配置：所用冷冻保护剂为含有15％DMSO、15％PEG、30％甘油以及0.4M蔗糖或山梨醇的细胞系液态营养液；
(3)冷冻保护前期处理试剂为含有0.2M山梨醇的液态营养液A和含有0.4M山梨醇的液态营养液B
(4)细胞洗涤液为含有0.8-1.2M蔗糖的液态营养液
(5)配置好的培养基密封好后，采用高压蒸汽的方式进行灭菌，灭菌时间为15-30min；
(6)用于超低温保存的细胞系为经过继代培养10-15天的新疆雪莲细胞
3.根据权利要求所述的新疆雪莲超低温冷冻保存的程序如下：
(1)预处理：将选择好的细胞系按10g/瓶投入到A处理液中摇床培养，培养温度为(25±1)℃，摇床转速为80-130r/min。24-72小时后取上清，加入B处理液同样条件培养24-72h
(2)保护剂处理：加入全剂量冷冻保护剂0℃处理10min后，快速投入到液氮当中
(3)冷冻细胞的解冻：取出冷冻管快速投入到37℃的水浴锅中解冻2min，当其全部融化后，将细胞转入到含有1.2M蔗糖的液态营养液中进行洗涤，完成后转入固态培养基进行培养。
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