CN104255711B - 一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法，为采用含有碳纳米材料的玻璃化溶液处理百合胚性愈伤组织以提高其保存效果，具体包括：预培养、装载液处理、玻璃化溶液处理和液氮保存步骤，其中所述玻璃化溶液含有0.1~0.5g/L碳纳米管。本发明中公开的方法对百合胚性愈伤组织的保存效果优化显著，通过添加碳纳米管作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。
Description
技术领域
本发明涉及植物或其局部的保存领域，具体涉及一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法。
背景技术
超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，是近十年来用于优良种质资源中长期保存的首选方法。
百合是百合科百合属的草本植物，为世界著名的球根花卉，具有花色丰富、姿态优美的特色。百合被广泛运用在园林布景、切花、鲜花和盆栽观赏等方面。中国作为百合分布中心，种质资源丰富，但多数野生种仍属于濒危植物。百合作为多年生球茎草本，不能通过低温种子库进行保存，目前主要的保存方式为田间种植保存，易在保存过程中出现褐变、腐烂，百合的中长期保存问题亟待解决。
国外关于百合的超低温研究开始于上世纪90年代，利用百合茎尖为外植体，通过超低温保存的成活率仅为8.45％，随着对超低温体系的不断改进，在玻璃化溶液PVS2出现后，成活率显著提升，开始被应用于不同类型的材料。国内的相关研究起步较晚，已初步摸索出百合超低温保存各关键步骤的保存条件，丰富了百合超低温保存体系。但关于百合胚性愈伤组织作为材料进行超低温保存的研究还很少，还未建立百合胚性愈伤组织的超低温保存体系。因此建立百合胚性愈伤组织超低温保存体系并加以优化，提高百合胚性愈伤组织冻后存活率，对百合的研究与产业发展具有很重要的作用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种新的提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法，以克服现有技术中植物及其组织中长期保存难以实现，以及超低温保存的植物或其组织恢复生长率低的缺点。
为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的。
一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法，采用玻璃化法超低温保存的方法对百合胚性愈伤组织进行保存，具体步骤如下：
1)预培养：将百合胚性愈伤组织置于预培养基上，在0～10℃下预培养1～4天；
2)装载液处理：室温下，将百合胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理40～60分钟后移除装载液；
3)玻璃化溶液处理：在0～25℃下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理百合胚性愈伤组织40～60分钟；
4)液氮保存：保持百合胚性愈伤组织在玻璃化溶液中浸泡的状态，并置于液氮中保存；
所述玻璃化溶液为含有0.1～0.5g/L碳纳米管的玻璃化冷冻保护液。
优选地，所述MS培养液含有1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，37.3mg/LNa2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，余量为水，所述MS培养液的pH为5.8。
优选地，所述预培养的培养基为含有0.4～0.8mol/L蔗糖的MS固体培养基。
优选地，所述预培养的培养基为含有0.7mol/L蔗糖的MS固体培养基。
本发明中所述MS固体培养基含有1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，37.3mg/LNa2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，10g/L琼脂粉，余量为水。所述MS固体培养基的pH为5.8。
优选地，上述步骤1)中在预培养基上培养的方法为：将百合胚性愈伤组织在4℃下置于预培养基上1～4天。
更优选地，上述步骤1)中在预培养基上培养的方法为：将百合胚性愈伤组织在4℃下置于预培养基上2天。
优选地，所述装载液为含有1～2mol/L丙三醇、0.3～0.5mol/L蔗糖和5～10mmol/LKNO3的MS培养液。
优选地，所述装载液为含有2mol/L丙三醇、0.4mol/L蔗糖和10mmol/LKNO3的MS培养液。
优选地，上述步骤2)中，室温下，将百合胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理60分钟后移除装载液；
优选地，上述步骤3)中，在0℃下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理百合胚性愈伤组织60分钟。
优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.1～0.5g/L碳纳米管的MS培养液。
更优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.1～0.3g/L碳纳米管的MS培养液。
一种百合胚性愈伤组织的解冻及再培养方法，所述百合胚性愈伤组织为采用如上述所述方法保存的百合胚性愈伤组织，所述百合胚性愈伤组织的解冻及再培养方法为将百合胚性愈伤组织从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，最后转入恢复培养基中恢复培养。
优选地，水浴解冻的条件为在30～40℃的水浴中解冻60～120s。
更优选地，水浴解冻的条件为在40℃的水浴中解冻90s。
优选地，所述洗涤液为含有1.0～1.5mol/L蔗糖和5～10mmol/LKNO3的MS培养液。
优选地，所述洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖和10mmol/LKNO3的MS培养液。洗涤工艺为：用洗涤液在室温下将百合胚性愈伤组织浸泡10～30分钟。
洗涤工艺为：用洗涤液在室温下将百合胚性愈伤组织浸泡30分钟，每10分钟更换一次洗涤液。
优选地，所述恢复培养基为含有0.1～3.0mg/L毒莠定、0.1～2.0mg/L6-苄基腺嘌呤和30g/L蔗糖的MS培养基。
优选地，所述恢复培养基为含有0.5mg/L毒莠定、0.5mg/L6-苄基腺嘌呤和30g/L蔗糖的MS培养基。
更优选地，室温下，将百合胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理60分钟后移除装载液。
更优选地，在0℃下使用玻璃化溶液浸泡处理百合胚性愈伤组织60分钟。
本发明中公开的方法中适合应用于现有技术中所有的百合胚性愈伤组织。
优选地，百合胚性愈伤组织的制备方法参考文献：SomaticembryogenesisandplantregenerationinLiliumlongiflorumThunb(A.Tribulato,P.C.Remotti,H.J.M.Loffler,PlantCellReport,1997)。
更优选地，所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.1～0.3g/L碳纳米管的MS培养液。
更优选地，为了证明本发明中方法的保存效果，采用相对成活率来统计，具体地，在恢复培养30天后利用氯化三苯四氮唑(缩写为TTC)法统计百合胚性愈伤组织相对成活率，并辅以荧光素二乙酸酯(缩写为FDA)染色法观察。
根据纳米科学原理，向冷冻保护剂中添加纳米材料能够有效提高冷冻保护剂的粘度和热导率，改变冰晶的形成状况、减少对细胞的伤害。本发明对百合胚性愈伤组织在玻璃化超低温条件下保存，先进行预培养，然后依次用装载液、玻璃化溶液处理，最后在液氮中超低温保存，其中玻璃化溶液又为添加了碳纳米管的玻璃化溶液，这种外源物质的添加配合方法中的其他工艺，能够有效的提高百合胚性愈伤组织的保存效果。按照本发明公开的保存方法，采用浓度为0.1～0.5g/L的碳纳米管作为外源物质使用时，百合胚性愈伤组织玻璃化超低温保存后的恢复生长率显著提高，本发明中公开的方法对百合胚性愈伤组织的保存效果优化显著，通过添加碳纳米管作为外源物质对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。
附图说明
图1为实验组和对照组中百合胚性愈伤组织超低温保存恢复生长的FDA染色照片。FDA能够进入活细胞原生质体内产生荧光，可以作为判断细胞死活的标志。
图1中从左到右分别为对照组超低温保存后的百合胚性愈伤组织、实验组组1中超低温保存后的百合胚性愈伤组织、实验组组2中超低温保存后的百合胚性愈伤组织、实验组组3中超低温保存后的百合胚性愈伤组织。如图1所示，亮度越大表示荧光强度越强，细胞活力越高。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明实施例中所用的百合胚性愈伤组织参照SomaticembryogenesisandplantregenerationinLiliumlongiflorumThunb(A.Tribulato,P.C.Remotti,H.J.M.Loffler,PlantCellReport,1997)中记载方法，获得百合胚性愈伤组织。
本发明实施例中实验试剂的配方如下：
1)MS培养液为：MS培养液含有1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，37.3mg/LNa2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，余量为水，所述MS培养液的pH为5.8。
2)MS固体培养基为：MS固体培养基含有1900mg/LKNO3，1650mg/LNH4NO3，170mg/LKH2PO4，370mg/LMgSO4·7H2O，440mg/LCaCl2·2H2O，37.3mg/LNa2-EDTA，27.8mg/LFeSO4·7H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，0.83mg/LKI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/LMnSO4·4H2O，8.6mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，0.025mg/LCuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，30g/L蔗糖，10g/L琼脂粉，余量为水，所述MS固体培养基的pH为5.8。
3)预培养基为含有0.7mol/L蔗糖的MS培养基。
4)装载液为：含有2mol/L丙三醇、0.4mol/L蔗糖和10mmol/LKNO3的MS培养液。
5)玻璃化溶液为：含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.1g/L碳纳米管的MS培养液。
6)洗涤液为含有1.2mol/L蔗糖和10mmol/LKNO3的MS培养液。
7)恢复培养基为含有1.5mg/L毒莠定、0.5mg/L6-苄基腺嘌呤和30g/L蔗糖的MS培养基。
实施例
1)将继代培养20天的百合胚性愈伤组织在含有0.7mol/L蔗糖的MS固体培养基上在4℃下低温预培养2天；
2)转至装载液中室温浸泡处理60分钟；
3)转入玻璃化溶液中在0℃条件下脱水处理60分钟；
4)最后置于液氮中超低温保存。
步骤3)结束后，无需除去玻璃化溶液，直接将浸泡于玻璃化溶液中的百合胚性愈伤组织置于液氮中超低温保存。
按照上述步骤将百合胚性愈伤组织分为实验组和对照组。
实验组的玻璃化溶液中分别含有0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L的碳纳米管。
实验组组1的玻璃化溶液中含有0.1g/L的碳纳米管；实验组组2的玻璃化溶液中含有0.3g/L的碳纳米管；实验组组3的玻璃化溶液中含有0.5g/L的碳纳米管；
对照组中不同之处在于玻璃化溶液不含有碳纳米管，其他与实验组相同。
在液氮中保存1h后，取出，快速放入40℃水浴锅中，解冻90s，并不时轻轻摇动；将玻璃化溶液吸除，加入洗涤液，室温处理30min，每隔10min换一次洗涤液；洗涤后的百合胚性愈伤组织移到恢复培养基培养30天后，计算并比较实验组和对照组内百合胚性愈伤组织的相对成活率。
实验组与对照组的百合胚性愈伤组织的相对成活率见表1。
表1
实验结果
由表1可知，采用很有0.1g/L、0.3g/L和0.5g/L碳纳米管的百合胚性愈伤组织超低温保存的玻璃化溶液使百合胚性愈伤组织恢复生长率由6.34％提高到32.45％、20.56％和14.75％。其中，以添加0.1g/L碳纳米管的提高效果最为显著，具体效果见图1。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (5)
1.一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法，其特征在于，采用玻璃化法超低温保存的方法对百合胚性愈伤组织进行保存，具体步骤如下：
1)预培养：将百合胚性愈伤组织置于预培养基上，在0～10℃下预培养1～4天；
2)装载液处理：室温下，将百合胚性愈伤组织在装载液中浸泡处理40～60分钟后移除装载液；
3)玻璃化溶液处理：在0～25℃下使用玻璃化溶液浸泡脱水处理百合胚性愈伤组织40～60分钟；
4)液氮保存：保持百合胚性愈伤组织在玻璃化溶液中浸泡的状态，并置于液氮中保存；
所述百合胚性愈伤组织预培养基为含有0.4～0.8mol/L蔗糖的MS固体培养基；
所述装载液为含有1～2mol/L丙三醇、0.3～0.5mol/L蔗糖和5～10mmol/LKNO3的MS培养液；
所述玻璃化溶液为含有300g/L丙三醇，150g/L乙二醇，150g/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖和0.1～0.5g/L碳纳米管的MS培养液。
2.一种百合胚性愈伤组织的解冻及再培养方法，所述百合胚性愈伤组织为采用如权利要求1所述方法保存的百合胚性愈伤组织，所述百合胚性愈伤组织的解冻及再培养方法为将百合胚性愈伤组织从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，最后转入恢复培养基中恢复培养。
3.如权利要求2所述解冻及再培养方法，其特征在于，水浴解冻的条件为在30～40℃的水浴中解冻60～120s。
4.如权利要求2所述解冻及再培养方法，其特征在于，所述洗涤液为含有1.0～1.5mol/L蔗糖和5～10mmol/LKNO3的MS培养液洗涤，洗涤工艺为：用洗涤液在室温下将百合胚性愈伤组织浸泡10～30分钟。
5.如权利要求2所述解冻及再培养方法，其特征在于，所述恢复培养基为含有0.1～3.0mg/L毒莠定、0.1～2mg/L6-苄基腺嘌呤和30g/L蔗糖的MS培养基。
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