CN102823582A

CN102823582A - 百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法

Info

Publication number: CN102823582A
Application number: CN2012103496298A
Authority: CN
Inventors: 申晓辉; 李晓丹; 任丽; 张荻
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2012-09-18
Filing date: 2012-09-18
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2032-09-18
Also published as: CN102823582B

Abstract

本发明涉及超低温保存领域，具体涉及一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法，为对百子莲胚性愈伤组织进行低温-高渗预处理后，依次置于装载液和玻璃化溶液中进行脱水处理，最后将脱水处理后的胚性愈伤组织重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中进行保存。本发明通过对玻璃化超低温保存过程中处理方法、条件、试剂的特殊设计实现了百子莲胚性愈伤组织的超低温保存，为百子莲种质资源的保存提供了技术保证，为体细胞胚发生成苗以及新品种培育材料供给提供了一条有效途径，将对热带或含水量较高的植物资源的保存以及无性扩繁技术体系的完善起到指导作用。

Description

百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法

技术领域

本发明涉及超低温保存领域，具体涉及一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法。

背景技术

百子莲（Agapanthus praecox ssp.orientalis）又称‘蓝百合’，为多年生根茎类花卉，原产非洲南部地区。百子莲叶形秀丽，花朵姿态优美，花色淡雅，花期持续时间长，具备抗逆性强，观赏性强的特点，从其叶片及根茎的药用成分利用到花的观赏，从庭院栽培到切花生产，拥有较高的观赏价值及应用价值，是西方发达国家高档鲜切花、盆花和沿海公园地被材料，也是除玫瑰花之外最能表达爱意的爱情花。为了快速繁殖引进的优良种质资源，需要开展百子莲优良种质资源无性扩繁技术研究。但发现百子莲胚性愈伤组织增殖速率在继代3周左右达到最大，以后开始逐渐下降。为维持较高的细胞增殖速率，必须每隔2～3周继代一次，但长时间连续继代在高浓度激素增殖培养基上会引起细胞胚性丧失或胚胎败育等问题。而胚性细胞长时间继代培养引起胚性丧失是植物体细胞胚胎发生中普遍存在的一个问题。重复启动胚性愈伤组织诱导不仅费时、费力、费钱，还有可能引起体细胞变异，无法为新品种的培育提供充分的材料。因此，研究建立一套细胞存活率高、遗传性稳定的百子莲胚性愈伤组织超低温保存技术体系是亟待解决的技术问题。

超低温保存（Cryopreservation）是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。玻璃化法（Vitrification）超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。该方法具有简便、成本低、保存材料遗传性稳定等优点。国内外先后对200多种植物的不同外植体进行了超低温保存技术研究，但有些植物（如热带植物或者含水量高的植物）恢复培养后成活率不高或根本不能成活，百子莲属于热带植物，其胚性愈伤组织含水量较高，是较难保存的植物材料，百子莲超低温保存技术也尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有无性扩繁技术的不足，提供一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法，用于百子莲种质资源的保存，为体细胞胚发生成苗以及新品种培育材料供给提供了一条有效途径，将对热带及含水量较高的植物资源的保存以及无性扩繁技术体系的完善起到指导作用。

本发明首先公开了一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法，为对百子莲胚性愈伤组织进行低温-高渗预处理后，依次置于装载液和玻璃化溶液中进行脱水处理，最后将脱水处理后的胚性愈伤组织重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中进行保存。

较优的，所述百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法具体步骤如下：

1）低温-高渗预处理：将百子莲胚性愈伤组织置于预处理培养基中，4℃培养；

2）脱水处理：将步骤1）预处理后的百子莲胚性愈伤组织置于装载液内脱水处理后，吸除表面的装载液，再置于玻璃化溶液中，于0℃进一步脱水处理；

3）液氮保存：除去步骤2）进一步脱水处理所使用的玻璃化溶液，重新添加新的玻璃化溶液后，迅速转入液氮中进行保存。

较优的，步骤1）所述百子莲胚性愈伤组织是指：继代培养20d，易碎、松散的百子莲胚性愈伤组织。

更优的，所述继代培养的培养基为含有1～1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基。

较优的，步骤1）所述预处理培养基是蔗糖含量为0.3～0.7M的MS固体培养基；预处理的培养时间为1～5d。

更优的，步骤1）所述预处理培养基为含有0.5M蔗糖的MS固体培养基；预处理的培养时间为2d。

步骤1）所使用的预处理培养基的其他成分与MS固体培养基相同，仅将MS固体培养基中3wt%的蔗糖含量替换为0.3～0.7M的蔗糖含量。

较优的，步骤2）所述装载液为含有2M丙三醇、0.4M蔗糖、10mM KN0₃的MS培养液。

较优的，步骤2）所述玻璃化溶液为含有30wt%丙三醇、15wt%乙二醇、15wt%二甲基亚砜、0.4M蔗糖的MS培养液。

较优的，步骤2）装载液脱水处理的时间为20～80min，玻璃化溶液脱水处理的时间为20～80min。

更优的，步骤2）装载液脱水处理的时间为60min，玻璃化溶液脱水处理的时间为40min。

本发明另一方面公开了一种针对上述百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存的解冻及恢复培养方法，为将玻璃化超低温保存的胚性愈伤组织从液氮中取出，置于35～40℃水浴中快速解冻，然后用洗涤液洗涤，再吸干表面的洗涤液，最后转入恢复培养基中进行恢复培养。

较优的，35～40℃水浴中快速解冻的时间为1～2min，优选的为2min。

较优的，所述洗涤液为含有1.2M蔗糖和10mM KNO₃的MS培养液。

较优的，使用洗涤液洗涤2～4次，每次8～12min。优选的，使用洗涤液洗涤3次，每次10min。

较优的，所述恢复培养基为含有1～1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基。

更优的，所述恢复培养基为含有1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基。

本发明所使用的恢复培养基的其他成分与MS固体培养基相同，仅增加了1～1.5mg/L含量的毒莠定。

较优的，所述恢复培养的条件为黑暗环境，恢复培养的温度为23～27℃。

更优的，所述恢复培养的条件为黑暗环境，恢复培养的温度为25℃。

本发明所述MS固体培养基的组成为现有的MS固体培养基组成，本发明所述MS培养液的组成比MS固体培养基的组成少了蔗糖和琼脂两种成分，其他组成不变；并且本发明的MS培养液还可以根据需要添加外源物质，例如醇类、蔗糖等。

本发明所使用的MS固体培养基为1L培养基中含有1900mg KNO₃，1650mg NH₄NO₃，170mgKH₂PO₄，370mg MgSO₄·7H₂O，440mg CaCl₂·2H₂O，37.3mg Na₂-EDTA，27.8mg FeSO₄·7H₂O，100mg肌醇，0.5mg烟酸，0.5mg盐酸吡哆醇，0.1mg盐酸硫胺素，2mg甘氨酸，0.83mgKI，6.2mg H₃BO₃，22.3mg MnSO₄·4H₂O，8.6mg ZnSO₄·7H₂O，0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg CuSO₄·5H₂O，0.025mg CoCl₂·6H₂O，30g蔗糖，10g琼脂粉，余量为水，调整培养基pH为5.8。

本发明所使用的MS培养液为1L培养基中含有1900mg KNO₃，1650mg NH₄NO₃，170mg KH₂PO₄，370mg MgSO₄·7H₂O，440mg CaCl₂·2H₂O，37.3mg Na₂-EDTA，27.8mg FeSO₄·7H₂O，100mg肌醇，0.5mg烟酸，0.5mg盐酸吡哆醇，0.1mg盐酸硫胺素，2mg甘氨酸，0.83mgKI，6.2mg H₃BO₃，22.3mg MnSO₄·4H₂O，8.6mg ZnSO₄·7H₂O，0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg CuSO₄·5H₂O，0.025mgCoCl₂·6H₂O，余量为水，调整培养基pH为5.8。

在液氮中保存时间的长短对胚性愈伤组织存活率没有影响，因此，可以实现百子莲胚性愈伤组织长期保存的目的。

本发明通过对玻璃化超低温保存过程中处理方法、条件、试剂的特殊设计实现了百子莲胚性愈伤组织的超低温保存，为百子莲种质资源的保存提供了技术保证，为体细胞胚发生成苗以及新品种培育材料供给提供了一条有效途径，将对热带或含水量较高的植物资源的保存以及无性扩繁技术体系的完善起到指导作用。

附图说明

图1：恢复培养30d胚性愈伤组织增殖状态

图2：恢复培养65d胚性愈伤组织增殖状态

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例1

1.实验材料

1.1实验对象：百子莲胚性愈伤组织在含有1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基中，25℃增殖20d，获得的易碎、松散的胚性愈伤组织作为玻璃化超低温保存的实验对象（制备方法可参考文献“蓝百合快速繁殖技术的研究”，范现丽，2009，上海交通大学硕士学位论文）。

1.2实验试剂

1.2.1装载液为含有2M丙三醇、0.4M蔗糖、10mM KNO₃的MS培养液。

1.2.2玻璃化溶液为含有30wt%丙三醇、15wt%乙二醇、15wt%二甲基亚砜、0.4M蔗糖的MS培养液。

1.2.3洗涤液为含有1.2M蔗糖和10mM KNO₃的MS培养液。

1.2.4预处理培养基是蔗糖含量分别为0.3M、0.5M、0.7M的MS固体培养基

1.2.5恢复培养基为含有1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基。

1.2.6MS固体培养基:1L培养基中含有1900mg KNO₃，1650mg NH₄NO₃，170mg KH₂PO₄，370mgMgSO₄·7H₂O，440mg CaCl₂·2H₂O，37.3mg Na₂-EDTA，27.8mg FeSO₄·7H₂O，100mg肌醇，0.5mg烟酸，0.5mg盐酸吡哆醇，0.1mg盐酸硫胺素，2mg甘氨酸，0.83mgKI，6.2mg H₃BO₃，22.3mgMnSO₄·4H₂O，8.6mg ZnSO₄·7H₂O，0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg CuSO₄·5H₂O，0.025mg CoCl₂·6H₂O，30g蔗糖，10g琼脂粉，余量为水，调整培养基pH为5.8。

1.2.7MS培养液：1L培养基中含有1900mg KNO₃，1650mg NH₄NO₃，170mg KH₂PO₄，370mgMgSO₄·7H₂O，440mg CaCl₂·2H₂O，37.3mg Na₂-EDTA，27.8mg FeSO₄·7H₂O，100mg肌醇，0.5mg烟酸，0.5mg盐酸吡哆醇，0.1mg盐酸硫胺素，2mg甘氨酸，0.83mgKI，6.2mg H₃BO₃，22.3mgMnSO₄·4H₂O，8.6mg ZnSO₄·7H₂O，0.25mg Na₂MoO₄·2H₂O，0.025mg CuSO₄·5H₂O，0.025mg CoCl₂·6H₂O，余量为水，调整培养基pH为5.8。

2.实验方法

2.1低温-高渗预处理培养基的筛选

通过蔗糖调节预处理培养基的渗透压，使预处理培养基成分为分别含有0.3、0.5、0.7M蔗糖的MS培养基，取三份相同的百子莲胚性愈伤组织分别在上述三种含不同蔗糖浓度的MS培养基中4℃条件下预处理2d后，放入装载液中室温下脱水处理40min，吸除愈伤组织表面的装载液，再放入玻璃化溶液中于0℃进一步脱水40min、换上新的玻璃化溶液后，迅速放入液氮保存1h。

超低温保存1h后，将三组胚性愈伤组织从液氮中取出，置于40℃水浴中快速解冻，然后用培养液洗涤3次，再用无菌滤纸吸干表面的培养液，最后转入恢复培养基中进行恢复培养，恢复培养为黑暗条件25℃。

表1不同渗透压培养条件对玻璃化超低温保存百子莲胚性愈伤组织相对存活率的影响

组别	0.3M蔗糖组	0.5M蔗糖组	0.7M蔗糖组
				相对存活率	7.29%	25.4%	5.73%

通过TTC法（TTC法可参考文献Towill LE,Mazur P.Studies on the reduction of2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a viability assay for plant tissue cultures[J].Can.J.Bot.,1975,53(7):1097-1102.）测定三组百子莲胚性愈伤组织的相对存活率，实验结果见表1。由表1可知，含0.5M蔗糖的MS培养基预处理后相对存活率最高，达到25.4%。

2.2装载液脱水处理时间的筛选

取三份相同的百子莲胚性愈伤组织在含0.5M蔗糖浓度的MS培养基中4℃条件下预处理2d后，放入装载液中室温下脱水处理，三组实验材料分别脱水处理20min、40min、60min、80min，吸除愈伤组织表面的装载液，再放入玻璃化溶液中于0℃进一步脱水40min、换上新的玻璃化溶液后，迅速放入液氮保存1h。

表2装载液脱水时间对玻璃化超低温保存百子莲胚性愈伤组织相对存活率的影响

组别	脱水20min	脱水40min	脱水60min	脱水80min
					相对存活率	7.10%	25.50%	56.88%	29.65%

通过TTC法测定三组百子莲胚性愈伤组织装载液处理时间（20min，40min，60min和80min）的单因素筛选，实验结果见表2。由表2可知，最佳的时间是60min。

2.3玻璃化溶液脱水处理时间的筛选

取三份相同的百子莲胚性愈伤组织在含0.5M蔗糖浓度的MS培养基中4℃条件下预处理2d后，放入装载液中室温下脱水处理60min，吸除愈伤组织表面的装载液，三组实验材料分别放入玻璃化溶液中于0℃进一步脱水20min、40min、60min、80min，换上新的玻璃化溶液后，迅速放入液氮保存1h。

表3玻璃化溶液脱水时间对玻璃化超低温保存百子莲胚性愈伤组织相对存活率的影响

组别	脱水20min	脱水40min	脱水60min	脱水80min
					相对存活率	29.58%	56.88%	18.40%	0.58%

通过TTC法测定三组百子莲胚性愈伤组织在0℃条件下用玻璃化溶液处理中，经过不同处理时间（20min，40min，60min和80min）的单因素筛选，对玻璃化超低温保存后百子莲胚性愈伤组织存活率的影响，实验结果见表3。由表3可知，玻璃化溶液脱水处理最佳的时间是40min。

培养结果如图1-2所示，为百子莲胚性愈伤组织按照上述步骤进行玻璃化超低温保存后，经恢复培养30d后愈伤组织开始增殖（图1），65d后胚性愈伤组织增殖速度最大（图2），可见采用本发明的玻璃化超低温保存方法能够得到稳定保存的百子莲胚性愈伤组织。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims

1.一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法，为对百子莲胚性愈伤组织进行低温-高渗预处理后，依次置于装载液和玻璃化溶液中进行脱水处理，最后将脱水处理后的胚性愈伤组织重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中进行保存。

2.如权利要求1所述的超低温保存方法，其特征在于，具体步骤如下：

3.如权利要求2所述的超低温保存方法，其特征在于，步骤1）所述百子莲胚性愈伤组织为继代培养20d，易碎、松散的百子莲胚性愈伤组织。

4.如权利要求3所述的超低温保存方法，其特征在于，所述继代培养的培养基为含有1～1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基。

5.如权利要求2所述的超低温保存方法，其特征在于，步骤1）所述预处理培养基是蔗糖含量为0.3～0.7M的MS固体培养基；预处理的培养时间为1～5d。

6.如权利要求1或2任一权利要求所述的超低温保存方法，其特征在于，所述装载液为含有2M丙三醇、0.4M蔗糖、10mM KNO₃的MS培养液；所述玻璃化溶液为含有30wt%丙三醇、15wt%乙二醇、15wt%二甲基亚砜、0.4M蔗糖的MS培养液。

7.如权利要求1或2任一权利要求所述的超低温保存方法，其特征在于，装载液脱水处理的时间为20～80min，玻璃化溶液脱水处理的时间为20～80min。

8.一种针对权利要求1-7任一权利要求所述百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法的解冻及再培养方法，为将玻璃化超低温保存的百子莲胚性愈伤组织从液氮中取出，置于35～40℃水浴中快速解冻，然后用洗涤液洗涤，再吸干表面的洗涤液，最后转入恢复培养基中进行恢复培养。

9.如权利要求8所述的解冻及再培养方法，其特征在于，所述洗涤液为含有1.2M蔗糖和10mM KNO₃的MS培养液。

10.如权利要求8所述的解冻及再培养方法，其特征在于，所述恢复培养基为含有1～1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基，所述恢复培养的条件为黑暗环境，恢复培养的温度为23～27℃。