CN103975852B - 一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法 - Google Patents

一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，该方法对获得新疆雪莲愈伤组织经继代、低大气压力预培养、超低温保存、解冻和再培养，明显提高超低温保存后愈伤组织的复活率。为新疆雪莲的种质保存提供技术依据，可用于新疆雪莲的种质保存。

Description

一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及植物愈伤组织的保存，具体涉及一种新疆雪莲(SaussureainvolucrataKar.etKir.)愈伤组织超低温保存的方法，通过低大气压力对新疆雪莲愈伤组织进行预处理，明显提高于愈伤组织超低温保存后组织的复活率，为新疆雪莲种质保存提供技术依据。
背景技术
新疆雪莲属菊科(Compositae)菜蓟族(Trib.CynareaeLess.)凤毛菊属(Saussureasp.)多年生草本植物，是一种名贵的高原药用植物。新疆雪莲具有散寒除湿、强筋助阳、抗炎镇痛、收缩子宫等功能，可治疗妇女小腹冷痛、阳痿、抗衰老及抑制癌细胞增生等作用。
新疆雪莲主要分布在海拔2400～4100m的高山冰渍石、流石滩石隙及高山草甸悬崖峭壁上，其生境的土壤极为贫瘠，再加上恶劣的高原环境，其生长速度缓慢，从种子发芽到开花结籽需3至5年时间。因此，野生的新疆雪莲资源非常有限，再加上近年来对雪莲的大规模、无计划的采挖，更是造成了该植物资源的急剧减少。1988年新疆雪莲的资源总量还有2830多万株，而现在可采集量仅为300万株，在《中国珍稀濒危保护植物名录》中，已被列为国家三级渐危物种。另一方面，对野生新疆雪莲的采挖必然造成周围环境和其它植被的破坏。因此，很有必要对现有的原生长地新疆雪莲进行种质资源保护。
常规的植物种质资源保存以田间种植、室内贮藏等形式为主,其需要大量的人力和物力等,这使其广泛应用于种质资源的保存受到了限制。近年来,在离体培养技术基础上发展起来的超低温保存技术,以其无菌培养、保存稳定、占用空间少等优点在植物种质资源的长期保存中受到了人们的重视,得到了广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
步骤一，新疆雪莲愈伤组织的获得：
取新疆雪莲种子，用浓度为0.1％的升汞进行表面灭菌，再转接到MS培养基上进行萌发；将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm2大小，然后接到含a-萘乙酸：2.5mg/L和6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为3000Lux、光周期16小时；培养35天后获得新疆雪莲愈伤组织；
步骤二，新疆雪莲愈伤组织的继代：
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到4％-6％，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养25天后可用于低大气压力预培养；
步骤三，新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养：
将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到40-60kP的容器中培养4-8天，然后直接作为超低温保存的材料：
步骤四，新疆雪莲愈伤组织的超低温保存：
将经过低大气压力预培养的新疆雪莲愈伤组织在室温下无菌转移到60％的玻璃化溶液(含有30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖)中处理30分钟，再在0℃下无菌转移到100％的玻璃化溶液中处理45分钟，再用100％的玻璃化溶液洗涤，然后装入冷冻管并立即投入液氮中保存。
步骤五，超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养：
从液氮中取出装有新疆雪莲愈伤组织的冻存管立即投入37℃温水中解冻3分钟，然后将解冻的愈伤组织在室温下用MS液体培养基洗涤3次，洗涤时间为每次3分钟。将洗涤后的愈伤组织转接到含有a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上培养，开始5天为暗培养，然后转移到光照下培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux、光周期16小时。总共培养40天后，在冻存愈伤组织的表面形成新的愈伤组织。
根据本发明，所述的步骤二中继代培养基中蔗糖的最佳浓度为4％；步骤三中新疆雪莲愈伤组织低压处理培养容器的最佳的压力值是50kP、最佳处理时间为6天。在此条件下，冻存的新疆雪莲愈伤组织解冻后培养40天其复活率可达到75％，是对照的3.3倍(没有经过低大气压力预培养的材料)。
本发明的新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，可用于新疆雪莲的种质保存，通过将新疆雪莲愈伤组织在40-60kP大气压力下预培养4-8天，然后再进行超低温保存程序，可明显提高愈伤组织的复活率，为新疆雪莲的种质保存提供技术依据。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
1、新疆雪莲愈伤组织的获得
取新疆雪莲种子，用浓度为0.1％的升汞进行表面灭菌，再转接到MS培养基上进行萌发。将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm2大小，然后接到含2.5mg/La-萘乙酸和0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为3000Lux，光周期16小时；培养35天后获得新疆雪莲愈伤组织；
2、新疆雪莲愈伤组织的继代
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux、光周期16小时；培养25天后可用于超低温保存；
3、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存
将新疆雪莲愈伤组织在室温下无菌转移到60％的玻璃化溶液(含有30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖)中处理30分钟，再在0℃下无菌转移到100％的玻璃化溶液中处理45分钟，再用100％的玻璃化溶液洗涤，然后装入冷冻管并投入液氮中保存。
4、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养
从液氮中取出装有新疆雪莲愈伤组织的冻存管立即投入37℃温水中解冻3分钟，然后将解冻的愈伤组织在室温下用MS液体培养基洗涤3次，洗涤时间为每次3分钟。将洗涤后的愈伤组织转接到含有2.5mg/La-萘乙酸、0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤MS培养基上培养，开始5天为暗培养，然后转移到光照下培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时。总共培养40天后，愈伤组织的复活率为23％。
实施例2：
1、新疆雪莲愈伤组织的获得
与实施例1相同；
2、新疆雪莲愈伤组织的继代
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到4％，培养条件与实施例1相同；培养25天后可用于低大气压力预培养；
3、新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养
将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到40kP的容器中培养4天。
4、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存
与实施例1相同；
5、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养
方法与实施例1相同。培养40天后，组织的复活率为42％。
实施例3：
1、新疆雪莲愈伤组织的获得
与实施例1相同；
2、新疆雪莲愈伤组织的继代
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到4％，培养条件与实施例1相同；培养25天后可用于低大气压力预培养；
3、新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养
将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到50kP的容器中培养6天。
4、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存
与实施例1相同；
5、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养
方法与实施例1相同。培养40天后，组织的复活率为48％。
实施例4：
1、新疆雪莲愈伤组织的获得
与实施例1相同；
2、新疆雪莲愈伤组织的继代
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到4％，培养条件与实施例1相同；培养25天后可用于低大气压力预培养；
3、新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养
将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到60kP的容器中培养8天。
4、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存
与实施例1相同；
5、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养
方法与实施例1相同。培养40天后，组织的复活率为39％。
实施例5：
1、新疆雪莲愈伤组织的获得
与实施例1相同；
2、新疆雪莲愈伤组织的继代
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到5％，培养条件与实施例1相同；培养25天后可用于低大气压力预培养；
3、新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养
将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到40kP的容器中培养8天。
4、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存
与实施例1相同；
5、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养
方法与实施例1相同。培养40天后，组织的复活率为56％。
实施例6：
1、新疆雪莲愈伤组织的获得
与实施例1相同；
2、新疆雪莲愈伤组织的继代
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到5％，培养条件与实施例1相同；培养25天后可用于低大气压力预培养；
3、新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养
将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到50kP的容器中培养6天。
4、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存
与实施例1相同；
5、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养
方法与实施例1相同。培养40天后，组织的复活率为75％。
实施例7：
1、新疆雪莲愈伤组织的获得
与实施例1相同；
2、新疆雪莲愈伤组织的继代
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到6％，培养条件与实施例1相同；培养25天后可用于低大气压力预培养；
3、新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养
将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到40kP的容器中培养4天。
4、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存
与实施例1相同；
5、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养
方法与实施例1相同。培养40天后，组织的复活率为66％。
实施例8：
1、新疆雪莲愈伤组织的获得
与实施例1相同；
2、新疆雪莲愈伤组织的继代
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到6％，培养条件与实施例1相同；培养25天后可用于低大气压力预培养；
3、新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养
将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到60kP的容器中培养8天。
4、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存
与实施例1相同；
5、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养
方法与实施例1相同。培养40天后，组织的复活率为51％。
实施例9：
1、新疆雪莲愈伤组织的获得
与实施例1相同；
2、新疆雪莲愈伤组织的继代
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含a-萘乙酸：2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养基中蔗糖浓度调节到5％，培养条件与实施例1相同；培养25天后可用于低大气压力预培养；
3、新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养
将培养25天的新疆雪莲愈伤组织转移到40kP的容器中培养8天。
4、新疆雪莲愈伤组织的超低温保存
与实施例1相同；
5、超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养
方法与实施例1相同。培养40天后，组织的复活率为65％。

Claims (4)

1.一种以子叶节为外植体的新疆雪莲愈伤组织超低温保存的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
步骤一，新疆雪莲愈伤组织的获得：
取新疆雪莲种子，用浓度为0.1％的升汞进行表面灭菌，再转接到MS培养基上进行萌发；将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm2大小，然后接到组成为2.5mg/La-萘乙酸和0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为3000Lux，光周期16小时；培养35天后获得新疆雪莲愈伤组织；
步骤二，新疆雪莲愈伤组织的继代：
将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到组成为a-萘乙酸2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养25天后可用于低大气压力预培养；
步骤三，新疆雪莲愈伤组织的低大气压力预培养：
将培养25天的新疆雪莲愈伤组织，转移到40kP～60kP低大气压力下的培养容器中，预培养4-8天，然后直接作为超低温保存的材料；
步骤四，新疆雪莲愈伤组织的超低温保存：
将经过低大气压力预培养的新疆雪莲愈伤组织在室温下无菌转移到60％的玻璃化溶液中处理30分钟，再在0℃下无菌转移到浓度为100％的玻璃化溶液中处理45分钟，再用100％的玻璃化溶液洗涤，然后装入冷冻管并投入液氮中保存；
步骤五，超低温冻存新疆雪莲愈伤组织的解冻和再培养：
从液氮中取出装有新疆雪莲愈伤组织的冻存管立即投入37℃温水中解冻3分钟，然后将解冻的愈伤组织在室温下用MS液体培养基洗涤3次，洗涤时间为每次3分钟，将洗涤后的愈伤组织转接到组成为a-萘乙酸2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上培养，开始5天为暗培养，然后转移到光照下培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时，总共培养40天后，在冻存愈伤组织的表面形成新的愈伤组织。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所述的用于新疆雪莲愈伤组织继代的培养基中的蔗糖浓度调节至4％-6％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤四中所述的60％的玻璃化溶液的组成是：30％甘油+15％乙二醇+15％二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤五中所述的冻存材料经过解冻后培养40天，在其表面形成新的愈伤组织，此时，冻存材料的复活率＝能够形成新愈伤组织的冻存愈伤组织块个数/冻存愈伤组织块的总个数×100％。
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