CN102754600A - 一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花的培育方法。其特点是以传统正品为亲本，运用诱导组培方法，成功培育出染色体加倍后的4倍体新苗种。该苗种根系发达，抗逆性强，持续时间长，耐干旱、抗盐碱、抗严寒，贴地生根，自行无限繁殖。在北纬40°以北地区种植，2年内根盘占地面积可达5平方米。一株可覆盖10m²以上的沙滩，根盘覆盖土地锁含水份达200公斤左右。花蕾大，有效药物含量吸收峰高于传统正品，根、茎、叶、花、藤皆可用于药品、饮品、保健品等的生产，经济价值极为可观。利用这一方法育苗，可绿化沙漠、荒山，让荒漠了的“不毛之地”产生自我造血功能，从根本上解决沙漠治理投入大、效益低、无法维持持循环发展的难题。

Description

一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花的培育方法

技术领域

本发明涉及一种金银花新品种的培育方法。特别涉及一种可用于荒漠化、沙漠化治理的专用金银花新品种的培育方法。属于植物育种领域。

背景技术

荒漠化、特别是沙漠化，与气候变化、生物多样性减少并称为全球三大生态环境问题。目前全球荒漠化面积已占陆地总面积的1/4，严重影响人类生存和可持续发展。我国是世界上荒漠化面积大、分布广、类型复杂、受害严重的国家之一，荒漠化面积占到国土面积的1/3，全国有4亿人口常年受到风沙危害。

荒漠化是由不合理的人类活动与脆弱的生态环境相互作用所造成的，表现为土地生产力下降，土地资源丧失、地表呈现类似沙漠景观的土地退化。中国沙漠化土地从东北经华北到西北形成一条不连续的弧形分布带，土地沙漠化速率不断加快。据监测，截至2009年底，全国荒漠化土地262.37万平方公里，沙化土地173.11万平方公里，分别占国土总面积的27.33%和18.03%。此外，全国还有约31万平方公里的土地呈现明显沙化趋势沙化危害突出，而且呈扩展态势。由于受超载放牧、滥采滥挖等人为因素及频发的极端自然灾害等共同影响，川西北高原、塔里木河下游等局部区域沙化土地处于扩展状态。包括甘肃民勤县在内的河西地区和内蒙古阿拉善盟已成为北方强度最大的沙尘暴策源地，民勤县生态的恶化，导致巴丹吉林沙漠和腾格里沙漠即将合拢。在北方地区尤其是内蒙古自治区八十八个旗县中，有六十七个旗县已经沙化。荒漠化地区草原植被趋于退化，生物资源锐减，草地生产力平均下降了60％—70％。风沙侵蚀与水土流失加剧，耕地肥力消耗殆尽，湖泊干涸，滩川地盐碱化，固定与半固定沙地严重沙化，沙尘天气与沙尘暴频发，直接威胁着国土生态安全和群众生活，成为我国经济社会可持续发展的重要制约因素。

长期以来，虽然党中央、国务院高度重视荒漠化防治，高度关注沙区经济社会发展，防沙治沙事业取得了显著成绩。但不容乐观的是，政府在荒漠化防治上投入巨大，如三北防护林工程（1978—2050年）总投资578.60亿元，京津风沙源治理工程（2001—2010年）总投资558.65亿元。由于资金投入大，工程效益低，使所投入的资金无法维持持续循环发展，单纯依靠国家对工程的直接投资来维系建设，致使国家及地方财政压力较大。目前虽然植被总体上处于初步恢复阶段，但自我调节能力弱，稳定性差，短期内难以形成稳定的生态系统，防治难度很大。土地荒漠化、沙化的严峻形势仍未得到根本改变，形势依然十分严峻。如离北京仅三百公里的浑善达克沙漠已严重威胁北京的整体生态，成为当前最为严重的生态问题。

坚持“防沙、治沙、用沙”相结合的原则，培育和选择适宜的种苗，充分开发沙漠潜能，利用沙地价值，努力把那些“不毛之地”发展成为名符其实的绿洲、绿色能源开发的基地、风光壮美的自然旅游景区。因此，如何获得多倍体植物已成为农业技术中的焦点，同时也是难点。

金银花,为忍冬科忍冬属植物，多年生落叶或半长绿藤本植物，首载于《名医别录》,名忍冬,因其凌冬不凋故名。宋代《履馋馋岩本草》始称金银花。别名有双花、二花、银花、忍冬。

金银花为忍冬科忍冬属植物，全世界有金银花200多种，我国有98种，全国种植的金银花正品与地方性非正品品种多达45～50种之多。近年来，国家卫生部对金银花收藏的植物来源有较大改变，《中国药典》1963年收录只有1种，1977年版增加到3种，2005年版将金银花分为忍冬(Lonicera japonica Thunb）和山银花，即“正品”和“非正品”，和1963年一样，只收录了1种，即忍冬(Lonicerajaponica Thunb）也称作大毛花，作为正品金银花的原植物。

本发明一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花新品种的培育方法。用该方法所培育出来的染色体加倍后的多倍体金银花，与其亲本大毛花（Lonicera japonica Thunb）相比具有明显的改变，得到了亲本大毛花所没有的优良经济性状。如根系发达，抗逆性强，持续时间长，抗干旱、耐贫瘠、抗盐碱、抗严寒，抗病虫害能力强；对地带性的生态条件适应性强，具有较强的繁殖能力和更新能力，可自行无限繁殖等生物学、生态学特性。在北纬40°以北地区种植，2年内根盘占地面积可达5平方米。一株可覆盖10㎡以上沙滩或荒山。根盘覆盖土地锁含水份达200公斤左右。利用这一方法培育新苗种，可绿化沙漠、荒山，保持水土，防止山区石漠化和防风沙、抗尘瀑。让荒漠了的“不毛之地”产生自我造血功能，从根本上解决沙漠治理资金投入大、效益低、无法维持持循环发展的难题。

该品种药食同源，枝节短、花蕾大、花壁厚、结花多、花期长、产量高，有效药物含量高，根、茎、叶、花、藤皆可用于药品、饮品、保健品。其经济价值极为可观。用该方法所培育出来的金银花干花与亲本外植体干花，经中国医药科学院药用植物研究所用［2000］版药典“高效液相色谱法”对比检验，有效药物含量吸收峰明显高于亲本大毛花，如图1所示，主要药物成分氯原酸含量为4.17％，亲本正品大毛花为1.90％。

红外光谱法对本发明方法所培育出来的染色体加倍后的四倍体金银花质量的整体评价为：本发明培育得到的金银花品系较亲本大毛花的品质高，是一种产量、品质都有明显优势的金银花新品种。

发明内容

本发明的目的是提供一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花新品种的培育方法。

本发明基本技术方案是：采用外植体选择、脱毒、培养基制备、诱导及生根培养、假植、定植、鉴定等工序组培而成。其具体步骤如下：

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

（1）选种：

选择传统大毛花植株的幼嫩芽、叶片、腋芽或花蕾作为外植体，放入消毒瓶中待用；

（2）脱毒：

将消毒瓶中的外植体用自来水冲洗后，用酒精溶液浸泡，再用氯化汞溶液消毒，最后用无菌水冲洗；

（3）诱导培养基、继代培养基以及生根培养基的制备：

所述的诱导培养基是按照以下方法制备得到的：按配制1L计算，称取45-55ml大量元素母液，4-6ml微量元素母液，4-6mlpH值为5.5～5.8的铁盐母液以及4-6ml有机元素母液，25-35g蔗糖，加入蒸馏水中，搅拌混匀后加入适量的培养基凝固剂，调节pH值为5.5～5.8，定容至1L，灭菌待用；

所述的继代培养基是按照以下方法制备得到的：按配制1L计算，用量筒或移液管从未加入培养基凝固剂的诱导培养基中吸取130mL溶液放入烧杯中，加入蒸馏水搅拌混匀，然后再加入2.4—D（二氯苯氧乙酸）以及NAA（萘已酸），加入适量的培养基凝固剂，使2.4—D（二氯苯氧乙酸）以及NAA（萘已酸）终浓度分别达到0.5mg/L和0.1mg/L，调节pH值为5.5～5.8，定容为1000mL，灭菌待用；

所述的生根培养基是按照以下方法制备得到的：按配制1L计算，用量筒或移液管从未加入培养基凝固剂的诱导培养基中吸取65mL溶液放入烧杯中，加入IBA（吲哚丁酸），加入适量的培养基凝固剂和蒸馏水，使IBA（吲哚丁酸）终浓度为100mg/L，调节pH值为5.5～5.8，定容为1000mL灭菌待用；

优选的，分别向各所述的培养基溶液中加入活性炭，活性炭的加入量为培养基总重量的0.5％-1.5％；

其中所述的大量元素母液中含有以下成分：

其中所述的微量元素母液中含有以下成分：

其中所述的铁盐母液中含有以下成分：

Na₂EDTA·2H₂O            7460mg/L

FeSO₄·7H₂O              5560mg/L

其中所述的有机元素母液中含有以下成分：

（4）诱导及生根培养：

①初代培养

在无菌条件下，将灭菌后的外植体种入装有诱导培养基的培养瓶中培养30-35d；

②继代培养

初代培养30-35d后，将诱导分化形成的带丛生芽的愈伤组织分割成小块，转接到继代培养基中培养25～30d；

③壮苗生根培养

将继代培养25～30d后的小苗插入生根培养基中进行壮苗生根培养；优选的，在将小苗转入生根培养基前，将小苗的根部在0.1mg/L的6BA（6—苄基腺嘌呤）溶液中浸泡0.5-1min，再插入生根培养基中，以促进小苗生根；

（5）移苗、驯化、假植及定植。

在本发明中，优选的，上述步骤（1）中所述的外植体为选自1年龄生发育成熟，品种纯、花色好、无病虫害的健康大毛花植株上部的淡绿色幼嫩芽顶，将叶柄两侧叶片用消毒剪刀剪去，并将其叶柄剪成1-0.5㎝的段，即得。

在本发明中，优选的，上述步骤（2）中脱毒所用的酒精溶液为75％酒精溶液，浸泡的时间为30s；所用的氯化汞溶液0.1％L氯化汞消毒液，消毒的时间为12min，所用的水均为无菌水，冲洗的次数为4～5遍。

在本发明中，优选的，上述步骤（3）中所述的培养基凝固剂包括琼脂、明胶及无机硅胶等。

在本发明中，优选的，上述步骤（4）中初代培养是在无菌条件下，将灭菌后的外植体，种入装有诱导培养基的培养瓶中，置于温度为20℃～25℃，湿度为70％～80％，光照强度为2000～3000lx，光照时间为14～16h/d的条件下培养。其中温度，光照强度、光照时间均是对无菌室内而言。

在本发明中，优选的，上述步骤（4）中继代培养是在初代培养后，将诱导分化形成的带丛生芽的愈伤组织分割成小块，转接到继代培养基中，置于温度为20℃～25℃，湿度为70％～80％，光照强度为2000～3000lx，光照时间为14～16h/d的条件下培养。其中温度，光照强度、光照时间均是对无菌室内而言。

在本发明中，优选的，上述步骤（4）中生根培养是在继代培养后，增殖体1～2㎝高时，切取增殖体上部0.5至1厘米，转入生根培养基中进行壮苗生根培养，生根阶段培养温度应降至20℃，光照改为室内自然散射光。

在本发明中，优选的，上述步骤（5）中驯化是在经15-25d的生根培养后，平均每个试瓶植株长出4～5条粗壮的侧根，根长1.5～2㎝时，将长有健壮根系的小苗连瓶不开盖放在温室栽植处，3至5天后，开瓶放置3～4d进行驯化炼苗。

在本发明中，优选的，上述步骤（5）中假植是待瓶内苗驯化炼苗3-4d后，将幼苗移出，用自来水小心洗净根部培养基，并用0.1％的多菌灵洗根，栽于小苗假植床里，密度为3㎝×5㎝，移栽完毕，再浇适量的水。更优选的，假植后用微喷法浇透水，前10天湿度保持80％，温度18℃～22℃。

在本发明中，优选的，上述步骤（5）中假植床设置为：下层为粗沙、中层为筛细的腐殖土、上层为细沙，并用0.2％高锰酸钾消毒。

在本发明中，优选的，当花苗长出3～4片叶后，可按5×4㎝将其移栽到土质疏松肥沃的假植床内。

在本发明中，优选的，其特征在于：上述步骤（5）中定植是指待苗高10㎝时，按30×20㎝株行距定植，并进行正常管理。从组培到定植的时间，大约需7～8个月的时间。

通过从亲本外植体、本方法组培的四倍体金银花植株上分别采集花粉观察比较花粉粒的大小，鉴定染色体基数证明按照本发明的方法培养得到的金银花品种为四倍体金银花，且该方法具有可重复性，即只要本领域技术人员按照本发明所述的方法进行大毛花的组织培养即可得到本发明所述的四倍体金银花（4n）。

具体而言，上述鉴定方法包括如下步骤：

a、从亲本外植体、本方法组培的四倍体金银花植株上分别采集花粉。

b、将采集到的花粉分别浸入45％冰醋酸。

d、用滴管分别各取一滴花粉粒悬浮液，移到载玻片上。

e、滴上碘化钾溶液，盖上盖玻片，制成花粉粒制片。

f、镜检多倍体及亲本外植体花粉粒大小。

g、用测微尺测定并记载其大小。

h、鉴定染色体基数，绘制出细胞染色体核型图。

用本发明方法组培的金银花新苗种产出的干花与亲本外植体干花，经中国医药科学院药用植物研究所用［2000］版药典“高效液相色谱法”对比检验，有效药物含量吸收峰明显高于传统正品，主要药物成分氯原酸含量为4.17％，传统亲本大毛花为1.90％。

本发明还提供了上述所得金银花的用途，本发明的金银花品种一株可以覆盖10㎡以上石山或沙滩，根盘覆盖土地含水份达200公斤，利用这一特性，可绿化沙漠、荒山，保持水土，防止山区石漠化和防风沙、抗尘瀑。让荒漠了的“不毛之地”产生自我造血功能，从根本上解决沙漠治理资金投入大、工程效益低、无法维持持循环发展的难题。

本发明还提供了上述所得金银花的药用价值，本发明的金银花品种药食同源，其有效药物含量吸收峰明显高于传统正品大毛花，根、茎、叶、花、藤皆可用于药品、饮品、保健品。

本发明方法所得染色体加倍后的四倍体金银花（4n）的特征：

1、生根力强：在根的生长习性方面，新品种金银花与亲本大毛花相比，具有明显的不同，表现为根系发达，主根深，细根多，生根力强。3年生主根系分布在15～30厘米深的表土层生长，须根在10～30厘米深的表土层生长，本发明方法培育的新品种金银花与亲本大毛花根系生长情况如实施例中表7所示。

2、花茎生长旺盛分枝多：茎的生长习性方面，新品种金银花在与亲本大毛花相比，具有明显的不同，表现在自然状态下，栽植三年龄可生长到3～5米的长度。叶枝色较亲本大毛花浓绿，中空，木质化枝条淡红竭色，枝条木质化程度高后，中空消失。花冠主干枝条与亲本大毛花不同，亲本大毛主干直立性较强，而新品种金银花分枝多，角度较开放，呈匍扑状直线贴地生长，落地生根，具有较强的繁殖能力和更新能力，可自行无限繁殖。本发明方法培育的新品种金银花与亲本大毛花不同分枝数和分枝长度如实施例中表10、11所示。

3、抗逆性强，适宜不同土壤；在抗逆性方面，新品种金银花与亲本大毛花相比，具有明显的改变，表现为抗干旱、耐贫瘠、抗盐碱、抗严寒，抗病虫害的能力强；对地带性的生态条件适应性强，更易适应生存条件的变化。特别适宜在北纬40°以北地区种植。即使在石灰岩地区的黑色石灰土混杂的土壤环境状况下，植株生长发育旺盛、健壮、花产量高、花的品质好。

4、根盘覆盖土地面积大，锁含水份多：在保持水土流失方面，新品种金银花与亲本大毛花相比，具有更强的生物学、生态学特性。表现在北纬40°以北地区种植，3年内根盘占地面积可达5平方米。一株可覆盖10㎡以上沙滩或荒山。根盘覆盖土地锁含水份达200公斤左右。利用这一方法培育新苗种，可绿化沙漠、荒山，保持水土，防止山区石漠化和防风沙、抗尘瀑。黄河沙滩种植两种金银花根盘土壤锁水量对比如实施例中表13所示。

5：叶片大，光合作用好：在叶的生长习性方面，新品种金银花与亲本大毛花相比，具有明显的改变。表现在叶片较大，光合作用好。其叶片长7.4cm，宽5.9cm，比亲本大毛花叶片长5．09cm，宽322cm，分别提高45.38％、83.3％；叶片厚度172mm，比亲本大毛花O88mm提高955％，叶片厚度增加近一倍。新品种金银花的上述叶部形态特性有利于形成较大的光合作用面积，增加光合产物与干物质的积累，这是新品种金银花的高产形态生理基础。新品种金银花的叶柄长O．75cm，比大毛花叶柄长05cm，增加50％。这一特征有利于其叶片疏散分布，增加对光能的吸收利用。本发明方法培育的新品种金银花与亲本大毛花叶茎特征对比如实施例表8所示。

6、花的分化期短，花期集中：在花的生长习性方面，新品种金银花与亲本大毛花相比，具有明显的改变。表现在花的分化期短，花期集中在四期。一级分枝，以长、中枝的比例大，坐花的节位多，一般长枝为10节，中枝5～9节，花蕾的数量高于后三期花。

7、产量高，经济性状好：在经济性状方面，新品种金银花与亲本大毛花相比具有明显的改变。表现为具有较大的营养器官和生殖器官，叶大、茎粗、枝节短、结花枝多、徒长枝少、单株花蕾数多、蕾花大、花壁厚、花针长，二白花期测量，花针长5.60cm，本发明新品种金银花与其亲本大毛花的花蕾比较如图3所示。本发明方法培育的新品种金银花与亲本大毛花花蕾特征与产量对比如实施例中表6、表9所示。

8、抵御病虫害能力强：在抵御病虫害能力方面，新品种金银花与亲本大毛花相比具有明显的提高。表现为幼茎及叶片绒毛浓密，粗硬而长，表现在抵御虫害入侵蚜虫和螨虫的能力强。可大大减少生长过程中农药的使用量，有利于按照GAP的标准进行金银花的绿色无公害栽培，少施或不施农药，增加金银花产品的药用安全性。

9、有效药物含量高：新品种金银花较亲本大毛花相比，在有效药物含量指标上较亲本大毛花相比，具有明显的提高。表现为用“高效液相色谱法”对比检验，有效药物成分氯原酸、皂苷含量吸收峰明显高于传统正品大毛花，如图2所示。

附图说明

图1为本发明品系金银花TLC指纹图谱鉴定图及染色体核型分析图；

图A为本发明品系金银花TLC指纹图谱鉴定图，图B为染色体核型分析图

图2为本发明品系金银花与亲本大毛花的红外光谱图（A）及叠加后的红外光谱图（B）；

a为本发明金银花品种；b为亲本大毛花

图3为本发明品系金银花与亲本大毛花的花蕾比较图。

A为本发明金银花品种；B为亲本大毛花

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

材料：

1、外植体金银花。

2003年3月4日，从平邑县精诚苗木有限公司主栽1年龄传统正品大毛花优良单株。

2、培养基药品等购自山东临沂化工市场。

3、工具

⑴解剖镜

⑵显微镜

⑶培养器皿

⑷托架天平

⑸电子分析天平

⑹移液管

⑺移液枪

⑻容量瓶  量筒  烧杯

⑼光照培养箱

⑽冰箱

⑾晾瓶架

⑿酸度仪

⒀刀、剪、镊

⒁测微尺

⒂染色体分析系统仪

⒃无菌工作台

⒄高压灭菌锅

4.方法

1）外植体选择及消毒处理，选择1年龄生发育成熟，品种纯、花色好、无病虫害的健康植株，沿主轴剪取株体上部淡绿色幼嫩芽顶。将叶柄两侧叶片用消毒剪刀剪去，并将其叶柄剪成0.5㎝的段，也可用叶片、茎或花蕾作外植体，用自来水冲洗干净，用70％乙醇溶液杀菌1.0min，用无菌水冲洗2遍后，放入0.1％L氯化汞溶液中消毒4min，用无菌水冲洗4～5遍后，放入消过毒的三角瓶中待用。

2）培养基的制备：

（1）NDT培养基母液的配制

本发明提供了一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花新品种的培育方法所使用的一种培养基，命名为NDT培养基，NDT培养基母液的配制包括以下步骤：

a、1号母液（大量元素）的配制步骤为，按表1中原量分别称取量，用蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合配成培养基母液，定容为1000mL。

b、2号母液（微量元素）的配制步骤为，按表2中原量分别称取量，用蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合配成培养基母液，定容为1000mL。

c、3号母液（铁盐元素）的配制步骤为，按表3中原量分别称取量，将Na₂EDTA·2H₂O和FeSO₄·7H₂O放置右装有45mL蒸馏水的溶量瓶中，适当加热并不停搅拌，待全部溶解后，再将两种溶液合在一起，调整PH值，最后加蒸馏水定容到1000mL。3号母液的PH值5.5～5.8；

d、4号母液（有机元素）的配制步骤为，按表4中原量分别称取量，用蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合配成培养基母液，定容为1000mL。

表1.1号母液（大量元素）的配制

表2.2号母液（微量元素）的配制

表3.3号母液（铁盐元素）的配制

表4.4号母液（有机元素）的配制

NDT母液的贮存：

a、装瓶各种母液配制完毕后，分别用倒入无菌玻璃瓶中贮存，并贴上标签，标签上注明母液编号、配制倍数与配制日期。

b、贮存将配制好的各种母液瓶储放在5℃左右的冰箱中保存。

（2）NDT—1诱导培养基的配制

以配制1LNDT—1培养基标准液为准，其步骤是：

a、每次使用时，取其1号母液的总量的1/20（50mL），取其2号、3号、4号母液各1/200（5mL）放入量杯中即成混合液待用；

b、溶化琼脂：同台架天平分别称取琼脂9g、蔗糖30g，放入1000mL搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直至溶液呈半透明状。然后再把配好的混合液加入煮沸的琼脂液中，最后加入蒸馏水定容1000mL，搅拌均匀即为NDT—1培养基标准液。

c、调整PH值：培养基的PH值应在5.5～5.8的范围内，为减少高压灭菌后PH值的变化幅度，向培养基溶液中加入活性炭。活性炭的加入量应控制在0.5％-1.5％。

d、灭菌：培养基在配制后的24h必须完成灭菌工序，其步骤是：先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的自来水；放回灭菌桶，并装入待灭菌的培养基；加盖，以对称的方式同时拧紧螺丝；待水沸腾时，打开排气阀，将锅内的冷空气排除。侍冷空气完全排净后，关上排气阀。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至工艺所需时间、压和温度。灭菌所需时间到后，切断电源让锅，让温度自然下降，待压力表压力降至0℃时，打开排气阀，旋松螺丝，打开锅盖，取出灭菌的培养基。然后，将灭菌的培养基放入37℃温箱中24h，经检验无杂菌生长，即可侍用。灭菌所需的压力为0.1～0.11MPa，锅内所需的温为121℃～125℃，灭菌所需的时间为15min～25min。

（3）NDT—2继代培养基的配制

a、生长调节剂母液的配制：将2.4—D（二氯苯氧乙酸）、NAA（萘已酸）、6BA（6—苄基腺嘌呤）三种植物生长调节剂分别配制成母液（0.1mg/mL）。其步骤是：称取3种物质各10mg，将2.4—D（二氯苯氧乙酸）、NAA（萘已酸）用1mL无水乙醇预溶，将6BA（6—苄基腺嘌呤）用少量1mL物质的量浓度为0.1mol/mL的NaOH溶液溶解，溶解过程需水浴加热，然后分别定容为100mL，即得到0.1mg/mL的母液待用。

b、诱导培养基的配制：其步骤是：用量筒或移液管从未加入琼脂的NDT—1培养基中吸取130mL溶液，然后再吸取2.4—D（二氯苯氧乙酸）5mL、NAA（萘已酸）1mL与NDT—1溶液一起放入烧杯中，再加入蒸馏水750mL，然后再把配好的混合液加入煮沸的琼脂液中（琼脂液的配制与上述步骤2相同），定容为1000mL待用。

c、调整PH值：培养基的PH值应在5.5～5.8的范围内，为减少高压灭菌后PH值的变化幅度，向培养基溶液中加入活性炭。活性炭的加入量应控制在0.5％-1.5％。

d、灭菌：继代培养基的灭菌方法参照NDT—1培养基的方法。

（4）NDT—3生根培养基的配制

具体配制方法为未加入琼脂的NDT—1培养基65ml,加入适量蒸馏水，加入IBA（吲哚丁酸），然后再把配好的混合液加入煮沸的琼脂液中（琼脂液的配制与上述步骤2相同），使吲哚丁酸终浓度为100mg/L，定容为1000mL待用。

调整PH值：培养基的PH值应在5.5～5.8的范围内，为减少高压灭菌后PH值的变化幅度，向培养基溶液中加入活性炭。活性炭的加入量应控制在0.5％-1.5％。

3）不定芽诱导及生根培养：

①初代培养

在无菌条件下，将剪成0.5㎝段的灭菌后的外植体叶柄，种入装有50mL NDT—1诱导芽培养基瓶中，置于温度为25℃，湿度为80％，光照强度2000lx，16h/d光照时间的条件下培养35d，期间每两周继代一次。

②继代培养

初代培养35d后，外植体叶柄便长出带有丛生芽的愈伤组织，将诱导分化形成的带丛生芽的愈伤组织分割成小块，转接到NDT—2继代培养基中，置于温度为25℃，湿度为80％，光照强度2000lx，16h/d光照时间的条件下培养25～30d，期间每两周继代一次，小苗增殖倍数可达10倍。

③壮苗生根培养

经过25d～30d后的继代培养，增殖体1～2㎝高时，再切取增殖体上部（小苗）0.5至1厘米，在将小苗转入生根培养基前，将小苗的根部在0.1mg/L的6BA（6—苄基腺嘌呤）溶液中浸泡0.5-1min，再插入NDT—3生根培养基中进行壮苗生根培养，4～5d可见根的分化，生根率可达95％以上。10d左右根数增多增长，颜色浓绿、粗壮、长势良好，经20d左右培养，平均每个试瓶植株长出4～5条粗壮的侧根时，可用于移载。生根阶段培养温度应降至20℃，光照改为室内自然散射光。

④驯化

当瓶内苗根长1.5～2㎝时，将长有健壮根系的小苗连瓶不开盖放在温室栽植处，3至5天后，开瓶放置3～4d进行驯化炼苗。

4）假植

待瓶内苗根长1.5～2㎝时，将幼苗移出，用自来水小心洗净根部培养基，并用0.1％的多菌灵洗根，栽于小苗假植床里。密度为3㎝×5㎝，移栽完毕，再浇适量的水。假植后用微喷法浇透水，前10天湿度保持80％，温度18℃～22℃。当花苗长出3～4片叶后，按3㎝×5㎝将其移栽到土质疏松肥沃的假植床内。

假植床设置为：下层为粗沙、中层为筛细的腐殖土、上层为细沙，并用0.2％高锰酸钾消毒。

5）定植

待苗高10㎝时，按30×20㎝株行距定植，并进行正常管理。从组培到定植的时间，大约需7～8个月。

5、鉴定

从亲本外植体、本方法组培的多倍体金银花植株上分别采集花粉观察比较花粉粒的大小，鉴定染色体基数。具体而言，包括如下步骤：

a、从亲本外植体、本方法组培的多倍体金银花植株上分别采集花粉。

b、将采集到的花粉分别浸入45％冰醋酸。

d、用滴管分别各取一滴花粉粒悬浮液，移到载玻片上。

e、滴上碘化钾溶液，盖上盖玻片，制成花粉粒制片。

f、镜检多倍体及亲本外植体花粉粒大小。

g、用测微尺测定并记载其大小。

h、鉴定染色体基数，绘制出细胞染色体核型图。

结果如图2所示。从图中可以看出经过本发明所述的方法培养后的金银花其染色体加倍，共具有4n=36条染色体。

实施例2

1、材料

1.1、外植体金银花。

2003年4月3日，从郑城镇母子山金银花科技园主栽1年龄传统正品大毛花优良单株。

1.2、培养基药品等购买自山东临沂化工市场。

1.3、工具

⑴解剖镜

⑵显微镜

⑶培养器皿

⑷托架天平

⑸电子分析天平

⑹移液管

⑺移液枪

⑻容量瓶  量筒  烧杯

⑼光照培养箱

⑽冰箱

⑾晾瓶架

⑿酸度仪

⒀刀、剪、镊

⒁测微尺

⒂染色体分析系统仪

⒃无菌工作台

⒄高压灭菌锅

2.方法

1）外植体选择及消毒处理，选择1年龄生发育成熟，品种纯、花色好、无病虫害的健康植株，剪取株体幼嫩叶片。去除叶片主叶脉后，将叶片剪成1cm×1cm的小块，用自来水冲洗干净，用75％乙醇溶液杀菌0.5min，用无菌水冲洗2遍后，放入0.1％L氯化汞溶液中消毒10min，用无菌水冲洗4～5遍后，放入消过毒的三角瓶中待用。

2）培养基的制备：

（1）NDT培养基母液的配制

本发明提供了一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花新品种的培育方法所使用的一种培养基，命名为NDT培养基，NDT培养基母液的配制包括以下步骤：

a、1号母液（大量元素）的配制步骤为，按上表1中原量分别称取量，用蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合配成培养基母液，定容为1000mL。

b、2号母液（微量元素）的配制步骤为，按上表2中原量分别称取量，用蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合配成培养基母液，定容为1000mL。

c、3号母液（铁盐元素）的配制步骤为，按上表3中原量分别称取量，将Na₂EDTA·2H₂O和FeSO₄·7H₂O放置右装有45mL蒸馏水的溶量瓶中，适当加热并不停搅拌，待全部溶解后，再将两种溶液合在一起，调整PH值，最后加蒸馏水定容到1000mL。3号母液的PH值5.5～5.8；

d、4号母液（有机元素）的配制步骤为，按上表4中原量分别称取量，用蒸馏水将药品分别溶解，然后依次混合配成培养基母液，定容为1000mL。

（2）NDT—1诱导培养基的配制

以配制1LNDT—1培养基标准液为准，其步骤是：

a、每次使用时，取其1号母液的总量的1/20（50mL），取其2号、3号、4号母液各1/200（5mL）放入量杯中即成混合液待用；

b、溶化琼脂：同台架天平分别称取琼脂9g、蔗糖30g，放入1000mL搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直至溶液呈半透明状。然后再把配好的混合液加入煮沸的琼脂液中，最后加入蒸馏水定容1000mL，搅拌均匀即为NDT—1培养基标准液。

c、调整PH值：培养基的PH值应在5.5～5.8的范围内，为减少高压灭菌后PH值的变化幅度，向培养基溶液中加入活性炭。活性炭的加入量应控制在0.5％-1.5％。

d、灭菌：培养基在配制后的24h必须完成灭菌工序，其步骤是：先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的自来水；放回灭菌桶，并装入待灭菌的培养基；加盖，以对称的方式同时拧紧螺丝；待水沸腾时，打开排气阀，将锅内的冷空气排除。侍冷空气完全排净后，关上排气阀。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至工艺所需时间、压和温度。灭菌所需时间到后，切断电源让锅，让温度自然下降，待压力表压力降至0℃时，打开排气阀，旋松螺丝，打开锅盖，取出灭菌的培养基。然后，将灭菌的培养基放入37℃温箱中24h，经检验无杂菌生长，即可侍用。灭菌所需的压力为0.1～0.11MPa，锅内所需的温为121℃～125℃，灭菌所需的时间为15min～25min。

（3）NDT—2继代培养基的配制

a、生长调节剂母液的配制：将2.4—D（二氯苯氧乙酸）、NAA（萘已酸）、6BA（6—苄基腺嘌呤）三种植物生长调节剂分别配制成母液（0.1mg/mL）。其步骤是：称取3种物质各10mg，将2.4—D（二氯苯氧乙酸）、NAA（萘已酸）用1mL无水乙醇预溶，将6BA（6—苄基腺嘌呤）用少量1mL物质的量浓度为0.1mo l/mL的NaOH溶液溶解，溶解过程需水浴加热，然后分别定容为100mL，即得到0.1mg/mL的母液待用。

b、诱导培养基的配制：其步骤是：用量筒或移液管从未加入琼脂的NDT—1培养基中吸取130mL溶液，然后再吸取2.4—D（二氯苯氧乙酸）5mL、NAA（萘已酸）1mL与NDT—1溶液一起放入烧杯中，再加入蒸馏水750mL，然后再把配好的混合液加入煮沸的琼脂液中（琼脂液的配制与上述步骤2相同），定容为1000mL待用。

c、调整PH值：培养基的PH值应在5.5～5.8的范围内，为减少高压灭菌后PH值的变化幅度，向培养基溶液中加入活性炭。活性炭的加入量应控制在0.5％-1.5％。

d、灭菌：继代培养基的灭菌方法参照NDT—1培养基的方法。

（4）NDT—3生根培养基的配制

具体配制方法为未加入琼脂的NDT—1培养基65ml，加入适量蒸馏水，加入IBA（吲哚丁酸），然后再把配好的混合液加入煮沸的琼脂液中（琼脂液的配制与上述步骤2相同），使吲哚丁酸终浓度为100mg/L，定容为1000mL待用。

调整PH值：培养基的PH值应在5.5～5.8的范围内，为减少高压灭菌后PH值的变化幅度，向培养基溶液中加入活性炭。活性炭的加入量应控制在0.5％-1.5％。

3）不定芽诱导及生根培养：

①初代培养

在无菌条件下，将剪成1cm×1cm小块的灭菌后的外植体叶片，种入装有50mLNDT—1诱导芽培养基瓶中，置于温度为25℃，湿度为80％，光照强度2000lx，16h/d光照时间的条件下培养35d，期间每两周继代一次。

②继代培养

初代培养35d后，外植体上便长出带有丛生芽的愈伤组织，将诱导分化形成的带丛生芽的愈伤组织分割成小块，转接到NDT—2继代培养基中，置于温度为25℃，湿度为80％，光照强度2000lx，16h/d光照时间的条件下培养25～30d，期间每两周继代一次，小苗增殖倍数可达10倍。

③壮苗生根培养

经过25d～30d后的继代培养，增殖体1～2㎝高时，再切取增殖体上部（小苗）0.5至1厘米，转入NDT—3生根培养基中进行壮苗生根培养，4～5d可见根的分化，生根率可达95％以上。10d左右根数增多增长，颜色浓绿、粗壮、长势良好，经20d左右培养，平均每个试瓶植株长出4～5条粗壮的侧根时，可用于移载。生根阶段培养温度应降至20℃，光照改为室内自然散射光。

④驯化

当瓶内苗根长1.5～2㎝时，将长有健壮根系的小苗连瓶不开盖放在温室栽植处，3至5天后，开瓶放置3～4d进行驯化炼苗。

4）假植

待瓶内苗根长1.5～2㎝时，将幼苗移出，用自来水小心洗净根部培养基，并用0.1％的多菌灵洗根，栽于小苗假植床里。密度为3㎝×5㎝，移栽完毕，再浇适量的水。假植后用微喷法浇透水，前10天湿度保持80％，温度18℃～22℃。当花苗长出3～4片叶后，按3㎝×5㎝将其移栽到土质疏松肥沃的假植床内。

假植床设置为：下层为粗沙、中层为筛细的腐殖土、上层为细沙，并用0.2％高锰酸钾消毒。

5）定植

待苗高10㎝时，按30×20㎝株行距定植，并进行正常管理。从组培到定植的时间，大约需7～8个月。

5、鉴定

从亲本外植体、本方法组培的多倍体金银花植株上分别采集花粉观察比较花粉粒的大小，鉴定染色体基数。具体而言，包括如下步骤：

a、从亲本外植体、本方法组培的多倍体金银花植株上分别采集花粉。

b、将采集到的花粉分别浸入45％冰醋酸。

d、用滴管分别各取一滴花粉粒悬浮液，移到载玻片上。

e、滴上碘化钾溶液，盖上盖玻片，制成花粉粒制片。

f、镜检多倍体及亲本外植体花粉粒大小。

g、用测微尺测定并记载其大小。

h、鉴定染色体基数，绘制出细胞染色体核型图。

实施例3本发明培育得到的金银花与传统大毛花的有效药物含量的比较

用本发明实施例1方法组培的金银花新苗种产出的干花与亲本外植体干花，经中国医药科学院药用植物研究所用［2000］版药典“高效液相色谱法”对比检验，结果如图1所示。

从图1A结果可以看出两种金银花均在3399,2923,2852,1736,1637（1634），1549,1403,1317,1260,1102,1051,764（763）cm^-1波数处有特征吸收峰，两种金银花的主要吸收峰的峰位和峰形大致相同，说明两者其中的化学成分基本相同，没有明显差异（见图1A所示）。其中3399cm^-1是O-H键的伸缩振动峰，2923,2852cm^-1归属于CH₂，CH₃的骨架伸缩振动，1736cm^-1是挥发油，脂肪酸的C=O的伸缩振动峰,1634是C=C的伸缩振动峰，1403,1260,1317cm^-1是黄酮类物质C=O的伸缩振动峰，764cm^-1是C-H键的弯曲振动峰，而最高峰是1051cm^-1峰，归属于黄酮、苷类等物质的C-O键的伸缩振动峰。因此，通过对金银花红外光谱的整体分析，可以明确金银花中主要化学成分的存在情况。

与b的谱圈相比，虽然a的谱图的峰形和峰位没有发生明显变化，但其中某些吸收峰的相对峰强有明显差异(见图1B)，说明a和b中各组分的相对含量是不一致的。最明显的是a在1051cm^-1波数处的吸收峰明显增加，此外，1403^-1，1260cm^-1，1634cm^-1波数处吸收峰的强度也较高，而这些峰都是黄酮类物质的特征吸收峰。说明a中的黄酮类物质的含量较b高，与试验报告一致。

此外，a的1736cm^-1峰的强度也较b高，说明挥发油、酸酐类物质的含量也较高。通过对本发明方法培育得到的金银花的红外光谱曲线与其亲本大毛花的红外光谱曲线进行叠加能够明显看出，本发明的金银花品种，相较于其亲本大毛花来说其主要药物成份含量吸收峰明显高于传统正品，其中主要药物成分氯原酸含量为4.17％，传统亲本大毛花为1.90％。是一种产量、品质都有明显优势的金银花新品种。

此外，对本发明的新品种金银花的不同花期的产量和药量进行了统计，其结果如表5所示。

表5本发明新品种金银花不同花期的产量与药量统计

实施例4本发明培育得到的金银花与传统大毛花的产量及性状的比较

将按照本发明实施例1方法培育得到金银花品种与其亲本种植于平邑农业科技园，种植面积均为66.7平方米，生长环境及管理措施等均相同，分别在种植2年及3年后对其产量进行评估，结果如表6所示。

表6本发明品系金银花与亲本大毛花产量对比表

生长到相同阶段，对比本发明培育得到的金银花品种与其亲本大毛花的性状，包括根系特征（表7所示），叶茎特征（表8所示）、花蕾特征（表9所示）以及分支数和分支长度（表10、11所示）进行了观察统计，直观比较图如图3所示，数据统计结果如下所示。

表7包头市哈林格尔镇黄河沙滩种植两种金银花根系生长对比

表8本发明金银花品种与亲本大毛花叶茎特征对比表

表9本发明金银花品种与亲本大毛花花蕾特征对比表

表10包头市哈林格尔镇黄河沙滩种植两种金银花不同分枝数对比

表11包头市哈林格尔镇黄河沙滩种植两种金银花不同分枝长度对比

实施例5本发明培育得到的金银花的土壤适应性

曾先后在内蒙古包头、鄂尔多斯、阿拉善等不同地区，不同土壤类型进行本发明培育得到的金银花品种的试种，试种效果如表12所示。

表12一年龄不同土壤类型本发明金银花新品种生长开花比较

说明本发明的金银花新品种与亲本大毛花相比在抗逆性方面具有明显的改变，现为抗干旱、耐贫瘠、抗盐碱、抗严寒，抗病虫害能力强；对地带性的生态条件适应性强，更易适应生存条件的变化。

实施例5本发明培育得到的金银花在防沙固沙中的应用

将本发明的新品种金银花以及其亲本大毛花在包头市哈林格尔镇黄河沙滩种植，通过对该两品种的根盘土壤锁水量的测定（表13所示），进而比较该两种金银花品种在保持水土流失方面的作用。

表13包头市哈林格尔镇黄河沙滩种植两种金银花根盘土壤锁水量对比

研究结果表明较亲本大毛花相比，本发明的品种具有较强的生物学、生态学特性。表现在北纬40°以北地区种植，3年内根盘占地面积可达5平方米。一株可覆盖10㎡以上沙滩或荒山。根盘覆盖土地锁含水份达200公斤左右。利用这一方法培育新苗种，可绿化沙漠、荒山，保持水土，防止山区石漠化和防风沙、抗尘瀑。

Claims (10)

1.一种荒漠化、沙漠化治理专用金银花的培育方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）选种：

选择传统大毛花植株的幼嫩芽、叶片、腋芽或花蕾作为外植体，放入消毒瓶中待用；

（2）脱毒：

将消毒瓶中的外植体用自来水冲洗后，用酒精溶液浸泡，再用氯化汞溶液消毒，最后用无菌水冲洗；

（3）诱导培养基、继代培养基以及生根培养基的制备：

所述的诱导培养基是按照以下方法制备得到的：按配制1L计算，称取45-55ml大量元素母液，4-6ml微量元素母液，4-6m l pH值为5.5～5.8的铁盐母液以及4-6ml有机元素母液，25-35g蔗糖，加入蒸馏水中，搅拌混匀后加入适量的培养基凝固剂，调节pH值为5.5～5.8，定容至1L，灭菌待用；

所述的继代培养基是按照以下方法制备得到的：按配制1L计算，用量筒或移液管从未加入培养基凝固剂的诱导培养基中吸取130mL溶液放入烧杯中，加入蒸馏水搅拌混匀，然后再加入2.4—D（二氯苯氧乙酸）以及NAA（萘已酸），加入适量的培养基凝固剂，使2.4—D（二氯苯氧乙酸）以及NAA（萘已酸）终浓度分别达到0.5mg/L和0.1mg/L，调节pH值为5.5～5.8，定容为1000mL，灭菌待用；

所述的生根培养基是按照以下方法制备得到的：按配制1L计算，用量筒或移液管从未加入培养基凝固剂的诱导培养基中吸取65mL溶液放入烧杯中，加入IBA（吲哚丁酸），加入适量的培养基凝固剂和蒸馏水，使IBA（吲哚丁酸）终浓度为100mg/L，调节pH值为5.5～5.8，定容为1000mL灭菌待用；

优选的，分别向各所述的培养基溶液中加入活性炭，活性炭的加入量为培养基总重量的0.5％-1.5％；

其中所述的大量元素母液中含有以下成分：

其中所述的微量元素母液中含有以下成分：

其中所述的铁盐母液中含有以下成分：

Na₂EDTA·2H₂O        7460mg/L

FeSO₄·7H₂O          5560mg/L

其中所述的有机元素母液中含有以下成分：

（4）诱导及生根培养：

①初代培养

在无菌条件下，将灭菌后的外植体种入装有诱导培养基的培养瓶中培养30-35d；

②继代培养

初代培养30-35d后，将诱导分化形成的带丛生芽的愈伤组织分割成小块，转接到继代培养基中培养25～30d；

③壮苗生根培养

将继代培养25～30d后的小苗插入生根培养基中进行壮苗生根培养；优选的，在将小苗转入生根培养基前，将小苗的根部在0.1mg/L的6BA（6—苄基腺嘌呤）溶液中浸泡0.5-1min，再插入生根培养基中；

（5）移苗、驯化、假植及定植。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的外植体为1年龄生发育成熟，品种纯、花色好、无病虫害的健康大毛花植株上部的淡绿色幼嫩芽顶，将叶柄两侧叶片用消毒剪刀剪去，并将其叶柄剪成1-0.5㎝的段，即得。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中脱毒所用的酒精溶液为75％酒精溶液，浸泡的时间为30s；所用的氯化汞溶液0.1％L氯化汞消毒液，消毒的时间为12min，无菌水洗的次数为4～5遍。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的培养基凝固剂包括琼脂、明胶及无机硅胶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中初代培养是在无菌条件下，将灭菌后的外植体，种入装有诱导培养基的培养瓶中，置于温度为20℃～25℃，湿度为70％～80％，光照强度为2000～3000lx，光照时间为14～16h/d的条件下培养。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中继代培养是在初代培养后，将诱导分化形成的带丛生芽的愈伤组织分割成小块，转接到继代培养基中，置于温度为20℃～25℃，湿度为70％～80％，光照强度为2000～3000l x，光照时间为14～16h/d的条件下培养。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中生根培养是在继代培养后，增殖体1～2㎝高时，切取增殖体上部0.5至1厘米，转入生根培养基中进行壮苗生根培养，生根阶段培养温度降至20℃，光照改为室内自然散射光，培养25～30d。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中驯化是在经15-25d的生根培养后，平均每个试瓶植株长出4～5条粗壮的侧根，根长1.5～2㎝时，将长有健壮根系的小苗连瓶不开盖放在温室栽植处，3至5天后，开瓶放置3～4d进行驯化炼苗。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中假植是待瓶内苗驯化炼苗3-4d后，将幼苗移出，用自来水小心洗净根部培养基，并用0.1％的多菌灵洗根，栽于小苗假植床里，密度为3㎝×5㎝，移栽完毕，再浇适量的水；优选的，假植床设置为：下层为粗沙、中层为筛细的腐殖土、上层为细沙，并用0.2％高锰酸钾消毒。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中定植是指待苗高10㎝时，按30×20㎝株行距定植，并进行正常管理。

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