CN105948889B - 人工培育松露菌根苗接种专用复合剂及其制法和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于松露菌根苗培育技术领域，具体涉及人工培育松露菌根苗接种专用复合剂及其制法和使用方法。本发明提供了一种能够缩短松露菌根苗培育时间，提高根系侵染强度和移栽成活率的人工培育松露菌根苗接种专用复合剂，包括A剂和B剂，其中A剂是以硫酸钾、硝酸钾、硝酸铵或硫酸铵、硝酸钙或硫酸钙为主要原料，加水溶解制成；B剂是以保水剂、植物凝胶、过磷酸钙、松露子囊果、河沙为主要原料，混合制备而得。采用本发明接种专用复合剂，在相同培育条件下，可以缩短松露菌根苗的形成时间15～30天，提高根系的侵染强度15～20个百分点，显著提高植株的抗性和移栽成活率，根苗的品质明显提高。

Description

人工培育松露菌根苗接种专用复合剂及其制法和使用方法

技术领域

本发明属于松露菌根苗培育技术领域，具体涉及人工培育松露菌根苗接种专用复合剂及其制法和使用方法。

背景技术

松露(Truffle)又称块菌、块菇、无娘果、猪拱菌等，具有独特的香气，经济价值极高，欧洲、北美、东南亚是松露的主要分布区，在欧洲被誉为“地下条件下黄金”和“上帝的食物”。松露在中国主要分布在四川和云南两省，目前已经鉴定出很多种类，包括Tuberpseudoexcavatum、Tuber sinoaestivum、Tuber indicum、Tuber excavatum、Tuberhuidongense、Tuber umbilicatum、Tuber latisporum等种类。由于松露营养丰富，价格高昂，在利益驱使下出现了掠夺式采挖，加之生态条件的恶化，松露自然产量连年急剧下降。法国在19世纪中叶到19世纪末，年产量一度接近2000吨。但由于战火和环境的变化，导致松露的产量急剧下降，在1940年产量降到400吨左右。目前，法国、意大利和西班牙商业松露累积产量，年均也仅300余吨。据不完全统计，攀枝花市松露2010年的总产量已从20世纪90年代的200多吨下降至30余吨。可以看出，整体世界范围内由于人为因素和环境的变化导致天然松露的产量呈逐步下降的趋势，因此开展松露的保护和人工栽培工作变得急为迫切。

由于松露的生长必需与合适的宿主植物根系共生，否则将无法形成松露的子实体，这就意味着人工栽培松露无法离开活体宿主植物，因而要实现松露的人工栽培必须首先要突破松露菌根苗的生产培育技术。松露苗的生产在欧洲已经立法，需要授权生产。世界上真正掌握高品质松露苗生产技术的仅法国、意大利等少数发达国家。欧洲松露接种宿主植物后，需要6个月的生长，才能真正定植在宿主植物的根部，形成共生的菌根关系。因此，栽培需要特殊的基质，才能保证松露苗不被其它的外生菌根替代或者污染。这个特殊的培养基质和相关的接种技术，都属于高度的商业机密。澳大利亚在引进法国技术生产松露苗时，每株松露苗均需支付昂贵的知识产权费。因此，我国要实现松露成功栽培，培育健康的松露菌根苗是关键的第一步。然而在实际生产过程中，即使在条件适宜的情况下，从育苗至检测到菌根稳定形形成至少花费6个月。因此本发明的发明人欲寻找一种可缩短松露菌根苗培育时间，提高根系侵染强度和菌根苗移栽成活率的松露专用复合剂制备技术及其应用办法。

发明内容

本发明所解决的第一个技术问题是提供一种能够缩短松露菌根苗培育时间，提高根系侵染强度和移栽成活率的技术手段，具体的是提供一种人工培育松露菌根苗接种专用复合剂。

本发明专用复合剂包括A剂和B剂，其中A剂是混合的溶液制剂，B剂是混合的固态接种制剂。

所述A剂是以硫酸钾、硝酸钾、硝酸铵或硫酸铵、硝酸钙或硫酸钙为主要原料，加水溶解制成。其浓度分别为：硫酸钾550～750mg/L，硝酸钾400～600mg/L，硝酸铵或硫酸铵50～80mg/L，硝酸钙或硫酸钙700～1000mg/L。该A剂主要为宿主植物提供必须的生长元素及菌根形成所需的钙、磷、钾等元素。

其中，优选采用硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙为主要原料，加水溶解制成。其浓度分别为：硫酸钾550～750mg/L，硝酸钾400～600mg/L，硝酸铵50～80mg/L，硝酸钙700～1000mg/L。

所述B剂是以保水剂、植物凝胶、过磷酸钙、松露子囊果、河沙为主要原料，混合制备而得。其重量配比为：保水剂1.5～2.5份，植物凝胶0.5～1.0份，过磷酸钙1.0～2.0份，松露子囊果10.0～20.0份，河沙75.0～90.0份。

在B剂组分中，植物凝胶和保水剂的作用在于提高局部水分、吸持养分，以达到宿主植物根系向水生长及松露孢子萌发所需的营养、水分等环境要求，过磷酸钙主要在于加速宿主植株木质化，提供松露菌根形成所需要的磷、钙元素，松露子囊果为接种菌种，河沙在B剂组成中为分散组分浓度的介质。

所述保水剂为农林保水剂。所述农林保水剂为高吸水性树脂，是具有较高吸水性能和保水性能的高分子聚合物的总称。农林保水剂又称土壤保墒剂、抗蒸腾剂、贮肥蓄药剂或微型水库，不仅具有高的吸水性能，还具有保水释水性能，将水分提供给植物利用。

所述松露子囊果为Tuber indicum或Tuber sinoaestivum或Tuberpanzhihuanense或Tuber huidongense子囊果。

所述松露子囊果为破碎为粒径≤1.5mm的松露子囊果颗粒。

所述河沙的粒径为过50目网筛。

本发明所解决的第二个技术问题是提供本发明专用复合剂的制备方法。

本发明专用复合剂包括A剂和B剂，制备方法如下：

A、A剂制备：以硫酸钾、硝酸钾、硝酸铵或硫酸铵、硝酸钙或硫酸钙为主要原料，加水溶解制成；其浓度分别为：硫酸钾550～750mg/L，硝酸钾400～600mg/L，硝酸铵或硫酸铵50～80mg/L，硝酸钙或硫酸钙700～1000mg/L；

进一步优选，以硫酸钾、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙为主要原料，加水溶解制成；其浓度分别为：硫酸钾550～750mg/L，硝酸钾400～600mg/L，硝酸铵50～80mg/L，硝酸钙700～1000mg/L；

B、B剂制备：以保水剂、植物凝胶、过磷酸钙、松露子囊果、河沙为主要原料，混合制备而得；其重量配比为：保水剂1.5～2.5份，植物凝胶0.5～1.0份，过磷酸钙1.0～2.0份，松露子囊果10.0～20.0份，河沙75.0～90.0份。

C、制成A剂和B剂后，分别于低温储存备用。

步骤C所述低温储存的温度范围为2-5℃，优选4℃。

本发明所解决的第三个技术问题是提供本发明专用复合剂的使用方法：

1)所述A剂施用时直接进行灌根，单次约3.0ml～8.0ml灌注在宿主植株栽培培养基中；或与叶面喷施相结合；

2)所述B剂施用时是将其洒在宿主植株根系周围，，然后用无菌水适量浇灌；即直接在栽培容器基质横截面均匀撒放2.0～10.0g/株，随即在截面上部移宿主植株苗，移栽完成后，用无菌水适量浇灌。

其中，所述宿主植株为2～4月龄的无菌幼苗。在整个幼苗培育过程中，种子、育苗基质、环境等均经过严格消毒灭菌，保证不引入任何的外生菌根型真菌及其它竞争性杂菌。

本发明的复合制剂中的B剂的施用，需要与无菌宿主幼苗的移栽同步进行；A剂的使用，需在B剂使用后0.5～5个月施用3次以上，一方面确保宿主幼苗成活，另一方面使得树苗根系伸展初期就受到A剂的影响，结合保水剂等的持续作用，以达到水肥稳定，促进根系生长，增加根系侵染强度，缩短松露菌根苗培育时间，提高根系侵染强度和移栽成活率的作用。

使用过程中，保持基质含水量20～50％，环境温度20℃～35℃是接种成功的关键。本发明复合制剂中A剂和B剂需即配即用，如需短时保存，可密封于低温(4℃)保存，远离潮湿和高温环境。

本发明的有益效果：

本发明接种专用复合剂，在相同培育条件下，可以缩短松露菌根苗的形成时间15～30天，提高根系的侵染强度15～20个百分点，显著提高植株的抗性和移栽成活率，根苗的品质明显提高。

附图说明

图1为实施例1菌根形态图。

其中，图1a表示珊瑚状菌根，图1b表示二叉状菌根。

图2为实施例2菌根形态图。

其中，图2c表示成串的珊瑚状菌根，图2d表示单个珊瑚状菌根形态及外延菌丝。

图3为对比例1菌根形态图。

其中，图3e表示棒球状菌根，图3f表示二叉状菌根。

图4为对比例2菌根形态图。

其中，图4g表示宿主植株根系形态(无侵染)，图4h表示没有侵染的宿主植株根系，图4i表示没有侵染的宿主根系尖端。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。

本发明人工培育松露菌根苗接种专用复合剂，由农林保水剂、植物凝胶、硫酸钾、硝酸钾、硝酸铵、过磷酸钙、硝酸钙、松露子囊果、河沙按比例配制而成，最终制成了A和B两种制剂。施用前，将硫酸钾、硝酸钾、硝酸铵或硫酸铵、硝酸钙或硫酸钙按浓度制作成A剂对植株进行灌根和叶面喷施。保水剂、植物凝胶、过磷酸钙、松露子囊果、河沙按重量百分比混合，组成B剂，在移栽无菌宿主幼苗时，洒在其根系周围或根系下方，以达到接种的目的。通过A和B制剂的复合效应，以达到快速培育松露菌根苗，提高根系侵染和移栽成活率的作用。其中，A剂中硫酸铵、硫酸钙的效果略差于硝酸铵、硝酸钙，故优选，采用硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙为主要原料。

本发明人工培育松露菌根苗接种专用复合剂的重点在于B剂中的松露子囊果接种量和保水剂含量，保水剂梯度重量份设计0、0.5、1、1.5、2.5、3，松露子囊果接种量梯度重量份设计0、5、10、20、30、40。正交表设计如下，表中C/D分别代表保水剂和松露子囊果：

表1 保水剂和松露子囊果用量筛选正交设计表

A剂按照发明所述方法进行配制，B剂中保水剂和松露子囊果用量按照上述表1所述用量进行试验，B剂中其他原料按如下重量份计：植物凝胶1.0份，过磷酸钙2.0份，河沙90.0份。最终以宿主植物根系菌根侵染强度为指标，进行用量筛选，结果如下：当松露子囊果在B剂中的重量份为10.0-20.0份时，适宜菌根的形成。在松露子囊果用量固定时，保水剂对菌根形成有重要影响：保水剂吸足水分后，体积大幅增加，用量低于1.5重量份时，菌根侵染强度在75％左右，当含量达2.5重量份及其以上，保水剂极易冒出基质表面，引起菌剂的流失和宿主的烂根和徒长，得到较低的菌根侵染强度(低于40％)，综合保水剂含量及菌根侵染强度情况，筛选出保水剂含量在1.5～2.5重量份比较适宜菌根的形成。

进一步对其菌根形成侵染强度进行细致的分析测定，结果见表2：

表2保水剂和松露子囊果用量筛选结果

编号	菌根侵染强度(％)
		C1.5D0	0
C1.5D5	82.35
		C1.5D10	89.08
C1.5D20	95.72
		C1.5D30	96.89
C1.5D40	97.6
		C2.5D0	0
C2.5D5	85.69
		C2.5D10	92.25
C2.5D20	96.46
		C2.5D30	97.23
C2.5D40	97.95

结合表2中数据可知，在A剂和B剂中，保水剂添加量及松露子囊果接种量达到一定比例后，有助于提高菌根侵染强度，在接种量一定的时候，保水剂含水量在1.5～2.5重量份，即B剂重量配比为：保水剂1.5～2.5份，植物凝胶0.5～1.0份，过磷酸钙1.0～2.0份，松露子囊果10.0～20.0份，河沙75.0～90.0份时，菌根侵染强度都在90％以上，且菌根苗长势优良。

实施例1本发明人工培育松露菌根苗接种专用复合剂栽培实例

复合制剂包括A剂和B剂。

1)硫酸钾650mg/L，硝酸钾500mg/L，硝酸铵70mg/L，硝酸钙800mg/L，按浓度配制成A剂。

2)新鲜松露子囊果，超净工作台上酒精表面消毒，打碎成粒径≤1.5mm的颗粒，河沙用50目网筛过筛并经高温湿热灭菌，冷却待用。保水剂2.0kg，植物凝胶0.5kg，过磷酸钙1.5kg，打碎的松露子囊果20.0kg，河沙76.0kg，最终混合成一种B剂，施用时洒在宿主植株根系周围。

3)所述A剂施用时，直接进行灌根，单次6.0ml在宿主植物栽培培养基中；B剂施用时，直接在栽培容器基质横截面均匀撒放5.0g/株，即有效接种量为1.0g/株，随即在截面上部移栽宿主幼苗，移栽完成后，用无菌水适量浇灌。

4)宿主幼苗为2月龄的无菌幼苗，在整个幼苗培育过程中，种子、育苗基质、环境等均经过严格消毒灭菌，保证不引入任何的外生菌根型真菌及其它竞争性杂菌。

5)复合制剂中的B剂的施用与无菌宿主幼苗的移栽同步进行；A剂的使用在B剂使用后半个月、1个月、3个月时施用A剂侵染。

6)将接种后的华山松苗，保持基质含水量20～50％，放置在环境温度不低于25℃，不高于38℃，空气相对湿度70％～80％，光照自然的洁净大棚中，适时浇水，控制基质相对湿度20％～50％，接种2个月后开始检测菌根的形成情况，及华山松树苗的长势情况，接种6个月时对植株进行DNA分子鉴定为松露，使用体式显微镜和根系扫描仪对菌根侵染情况进行统计分析、形态观察和根体积进行分析，发现珊瑚状菌根数量较多，整个根系侵染强度在85.33％以上，全体植株侵染强度为100％，株高在16cm左右。树苗移栽后，成活率在92％左右。

实施例2 本发明人工培育松露菌根苗接种专用复合剂栽培实例

复合制剂包括A剂和B剂。

1)硫酸钾650mg/L，硝酸钾500mg/L，硝酸铵70mg/L，硝酸钙800mg/L，按浓度配制成A剂。

2)新鲜松露子囊果，超净工作台上酒精表面消毒，打碎成粒径≤1.5mm的颗粒，河沙用50目网筛过筛并经高温湿热灭菌，冷却待用。保水剂2.0kg，植物凝胶0.5kg，过磷酸钙1.5kg，打碎的松露子囊果20.0kg，河沙76.0kg，最终混合成一种B剂，施用时洒在宿主植株根系周围。

3)所述A剂施用时，直接进行灌根，单次6.0ml在宿主植物栽培培养基中；B剂施用时，直接在栽培容器基质横截面均匀撒放10.0g/株，即有效接种量为2.0g/株，随即在截面上部移栽宿主幼苗，移栽完成后，用无菌水浇适量定根水。

4)所述宿主幼苗为2月龄的无菌幼苗，在整个幼苗培育过程中，种子、育苗基质、环境等均经过严格消毒灭菌，保证不引入任何的外生菌根型真菌及其它竞争性杂菌。

5)复合制剂中的B剂的施用与无菌宿主幼苗的移栽同步进行，液体制剂)的使用，在B剂使用后半个月、1个月、3个月时施用A剂侵染。

6)将接种后的华山松苗，保持基质含水量20～50％，放置在环境温度不低于25℃，不高于38℃，空气相对湿度70％～80％，光照自然的洁净大棚中，适时浇自来水，控制基质相对湿度20％～50％，接种2个月后开始检测菌根的形成情况，及华山松树苗的长势情况，接种6个月时对植株进行DNA分子鉴定为松露，随着时间的推移，菌根逐渐老化呈浅褐色，使用体式显微镜和根系扫描仪对菌根侵染情况进行统计分析、形态观察和根体积进行分析，发现珊瑚状菌根数量较多，整个根系侵染强度在92.72％以上，全体植株侵染率为100％，株高在14cm左右。树苗移栽后，成活率在95％左右。

对比例1

实施专利申请号为200710048943.1中所述的技术方法，并严格按照其所述的培育方法进行重复试验，有效接种量为1.0g，接种2个月后开始检测菌根的形成情况，及华山松树苗的长势情况，接种6个月时对植株进行DNA分子鉴定为松露，随着时间的推移，菌根逐渐老化呈浅褐色，使用体式显微镜和根系扫描仪对菌根侵染情况进行统计分析、形态观察和根体积进行分析，发现二叉状和棒状菌根数量较多，珊瑚状菌根几乎没有，整个根系侵染强度在67.56％左右，全体植株侵染强度为98.57％，12月苗龄的华山松树苗，株高在19cm左右。树苗移栽后，成活率在56.2％左右。

对比例2

实施专利申请号为201310560468.1中所述的技术方法进行华山松无菌苗的培育，苗龄达3月便使用泥炭：蛭石：越西土＝1:1:1的无菌混合基质进行移栽即可，不做其它任何处理，幼苗的管理同实施例1。12月苗龄的华山松树苗株高约22cm。

由上述实例的菌根形态图如图1-图4可见，采用本发明菌剂培育菌根，能得到更多成串的菌根，植株壮实，有利于植株的生存，在相同培育时间内，整个根系侵染强度比对比例1高出15％～25％，可见在形成相同数量的菌根时，本发明培育方法花费的时间更短，通过A剂和B剂对松露宿主植物和松露子囊孢子的交互作用，最终实现培育高侵染强度并合格的松露菌根苗。

本发明接种专用复合剂，在相同培育条件下，可以缩短松露菌根苗的形成时间15～30天，提高根系的侵染强度15～20个百分点，显著提高植株的抗性和移栽成活率，根苗的品质明显提高；具有操作简单，组分便宜，效果理想的优点，是一种很实用的松露菌根苗培育技术，为公众提供了一种全新的选择。

Claims (9)

1.人工培育松露菌根苗接种专用复合剂，包括A剂和B剂，其特征在于：其中A剂是混合的溶液制剂，B剂是混合的固态接种制剂；

所述A剂是以硫酸钾、硝酸钾、硝酸铵或硫酸铵、硝酸钙或硫酸钙为主要原料，加水溶解制成；

所述B剂是以保水剂、植物凝胶、过磷酸钙、松露子囊果、河沙为主要原料，混合制备而得；所述B剂主要原料的重量配比为：保水剂1.5～2.5份，植物凝胶0.5～1.0份，过磷酸钙1.0～2.0份，松露子囊果10.0～20.0份，河沙75.0～90.0份。

2.根据权利要求1所述的人工培育松露菌根苗接种专用复合剂，其特征在于：所述A剂主要原料的浓度分别为：硫酸钾550～750mg/L，硝酸钾400～600mg/L，硝酸铵或硫酸铵50～80mg/L，硝酸钙或硫酸钙700～1000mg/L。

3.根据权利要求1所述的人工培育松露菌根苗接种专用复合剂，其特征在于：所述A剂是以硫酸钾、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙为主要原料，主要原料的浓度分别为：硫酸钾550～750mg/L，硝酸钾400～600mg/L，硝酸铵50～80mg/L，硝酸钙700～1000mg/L。

4.根据权利要求1-3任一项所述的人工培育松露菌根苗接种专用复合剂，其特征在于：至少满足以下任一项：

所述保水剂为农林保水剂；

所述松露子囊果为印度块菌或中华夏块菌或攀枝花块菌或会东块菌子囊果；

所述松露子囊果为破碎为粒径≤1.5mm的松露子囊果颗粒；

所述河沙的粒径为过50目网筛。

5.权利要求1所述的人工培育松露菌根苗接种专用复合剂的制备方法，其特征在于：

A、A剂制备：以硫酸钾、硝酸钾、硝酸铵或硫酸铵、硝酸钙或硫酸钙为主要原料，加水溶解制成；其浓度分别为：硫酸钾550～750mg/L，硝酸钾400～600mg/L，硝酸铵或硫酸铵50～80mg/L，硝酸钙或硫酸钙700～1000mg/L；

B、B剂制备：以保水剂、植物凝胶、过磷酸钙、松露子囊果、河沙为主要原料，混合制备而得；其重量配比为：保水剂1.5～2.5份，植物凝胶0.5～1.0份，过磷酸钙1.0～2.0份，松露子囊果10.0～20.0份，河沙75.0～90.0份；

C、制成A剂和B剂后，分别于低温储存备用。

6.根据权利要求5所述的人工培育松露菌根苗接种专用复合剂的制备方法，其特征在于：步骤A中的A剂以硫酸钾、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙为主要原料，加水溶解制成；其浓度分别为：硫酸钾550～750mg/L，硝酸钾400～600mg/L，硝酸铵50～80mg/L，硝酸钙700～1000mg/L。

7.权利要求1-4任一项所述的人工培育松露菌根苗接种专用复合剂的使用方法，其特征在于：

1)所述A剂施用时直接进行灌根，单次3.0ml～8.0ml灌注在宿主植株栽培培养基中；或与叶面喷施相结合；

2)所述B剂施用时是将其洒在宿主植株根系周围，然后用无菌水适量浇灌。

8.根据权利要求7所述的人工培育松露菌根苗接种专用复合剂的使用方法，其特征在于：步骤2)为直接在栽培容器基质横截面均匀撒放2.0～10.0g/株，随即在截面上部移栽宿主植株，移栽完成后，用无菌水适量浇灌。

9.根据权利要求7或8所述的人工培育松露菌根苗接种专用复合剂的使用方法，其特征在于：所述宿主植株为2～4月龄的无菌幼苗。