CN109136141A - 巨菌草根际促生菌及其应用 - Google Patents

巨菌草根际促生菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业微生物领域，具体涉及巨菌草根际促生菌及其应用，巨菌草根际促生菌，包括溶磷固氮菌株NP‑01、溶磷固氮菌株NP‑02、固氮产IAA菌株N‑01、固氮菌株N‑02、固氮菌株N‑03、固氮菌株YB‑08、溶磷菌株N‑06、溶磷菌株YB‑10、溶磷产IAA菌株YB‑07、溶磷固氮产IAA菌株YB‑09中的一种或多种，还提供了相应的促生菌剂和巨菌草生物有机肥，有机肥还包括组分A：巨菌草秸秆、新鲜牛粪、羊粪、鸡粪、生物有机腐熟剂，先将组分A混合，再高温干发酵，翻堆过程及时喷洒水分，将促生菌菌株制作成菌悬液，菌悬液发酵制作成菌剂后，等比例混合加入堆肥中，控制水分和温度，放置72h即可。本发明提供的巨菌草根际促生菌及菌剂和有机肥，能显著地促进植物的生长，提高产量和品质。

Description

巨菌草根际促生菌及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物领域，具体涉及巨菌草根际促生菌及其应用。
背景技术
目前，在最早研发的产品根瘤菌剂已在全世界范围推广应用，至少有70多个国家研究、生产和应用。随着研究的发展，固氮细菌、溶磷细菌等研究工作也在不断地深入，随着东欧等一些国家的科研人员对固氮菌肥料和溶磷细菌肥料的研究和应用，发现其促生的主要机制是这些促生菌在代谢过程中能产生促进植物生产的活性物质。而如今我国的微生物肥料研制单位相继推出联合固氮菌肥、硅酸盐菌剂、有机物料腐熟剂等适于农业发展需要的新品种，它们能够在农业中可持续发展，减少化肥的使用、促使农作物废弃物开发利用，对保护环境以及提高农作物产品品质和食品安全方面有重要的意义。
孙淑荣等研究报道接种植物促生菌(PGPR)复合菌剂进行试验，可使玉米较对照平均增产11.01％，增产幅度为7.35％～15.26％，并可替代部分的化肥。毛露甜等在蔬菜，崔美华等在水稻，李景慧等在棉花方面的研究表明，使用菌肥可提高这些作物的产量，对其生长有益。本发明主要取材为巨菌草，它在温度适宜地区为多年生植物，植株高大，抗逆性强，产量高，蛋白和糖分含量高，直立、丛生，根系发达，较强的分蘖能力，其创新点旨在从巨菌草根际筛选固氮菌、溶磷菌和产IAA菌，形成既能加快吸收土壤中营养物质的菌剂，又能补充氮磷的复合生物有机肥。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明提供了巨菌草根际促生菌及其应用。本发明提供了巨菌草促生菌及其菌剂和生物有机肥，其对作物根际区域及根围具有促进生长的积极影响，揭示出其在作物中的应用效果及作用机理，解决了陕北地区的生物有机肥缺口，并为陕北地区复合生物肥料的开发和应用提供一种新思路。
本发明提供的巨菌草根际促生菌及菌剂和有机肥，能显著地促进植物的生长，提高产量和品质；菌剂采用多菌株混接的方法，其促进植物生长的效果更好；巨菌草生物有机肥利用了巨菌草以及禽畜粪便作为载体，其中丰富的有机物含量，以及巨菌草根际促生菌，使其促生长效果更好；有机肥15天就可以制作完成，与市面上其他有机肥比较大大缩短了发酵和制备时间。
本发明的技术方案：巨菌草根际促生菌，包括溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02、固氮产IAA菌株N-01、固氮菌株N-02、固氮菌株N-03、固氮菌株YB-08、溶磷菌株N-06、溶磷菌株YB-10、溶磷产IAA菌株YB-07和溶磷固氮产IAA菌株YB-09中的一种或多种；
巨菌草样品取自于全国各地菌草种殖示范基地，取巨菌草根系，用无菌ddH2O洗涤，切成小块，称取1.5cm根段进行表面消毒，将截取的植物样品的根部清洗干净，用吸水纸吸干，75％酒精浸泡2-3min，无菌ddH2O洗涤3次后，再用5-20％NaClO溶液消毒表面5-10min，最后用无菌水继续洗涤3次；另取巨菌草根际土壤，与无菌ddH2O混合摇匀，按8个浓度梯度，10-2～10–9g/mL，涂于培养基上，各设重复3次，所有平板在28℃±2℃下培养72h，划线分离纯化后，得到根际土壤中的促生菌，分别挑选不同形状的菌落，编号，保存，检测；
溶磷细菌的筛选及分离纯化：取细菌悬液在溶磷细菌培养基上涂布，表面消毒后取根，均匀截取1.5cm，放入溶磷细菌培养基中，所有培养基均以28℃±2℃培养3-5d，分别挑选较大的透明环菌株，分离纯化，多次传代培养，选择生长较好的菌株进行保存；溶磷细菌的促生能力的测定：用钼蓝比色法测定处理液中的磷含量，取50μg/mL的磷标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，分别置于20mL具塞试管中，分别加蒸馏水至6mL，再加入1mol·L-1的硫酸溶液2.0mL，2.0mL铁-钼酸试剂，混匀；静置15min后，用比色计在660nm波长处测定吸光度；用所得数据绘制标准曲线，以测出的吸光度通过标准曲线方程计算待测样品溶液的磷含量；
固氮菌的筛选及分离纯化：分别称取巨菌草样品根5.0g，用无菌水冲洗干净，进行表面灭菌，步骤如下：1)在70％乙醇浸泡1min；2)无菌水漂洗1min；3)2％次氯酸钠浸泡10min，无菌水漂洗三次，然后用无菌剪刀剪成0.5cm的小块，放在阿须贝(Ashby)无氮培养基平板上，28℃培养直至组织块周围长出菌苔，用无菌水将菌苔清洗下来，梯度稀释至10-5，取10-3，10-4，10-5稀释度的菌溶液100μL涂至阿须贝固体培养基，28℃温箱中培养，最终挑选出生长较好的菌株进行保存；固氮菌的促生能力的测定：将待测菌株接入Ashby液体培养基中培养3d，在620nm处测其OD值，比较OD值的大小，初步确认各菌株固氮能力的大小，另将待测菌株接入盛有蛋白胨水(10g/L)培养液的试管中，28℃±2℃静置培养3d，在每个试管中加入0.5mLNessler’s试剂，出现黄褐色沉淀的结果则为产NH3阳性反应；
产IAA菌分离纯化及促生能力的测定：将每株菌株在IAA培养基中培养5d，取2mL培养液体，10000r/min离心15min，并且向每1mL上清液中加入0.5mLSalkowski试剂，并且在暗室温下显色1h后在530nm处测量OD值；以空白培养基作对照，并以标品IAA对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量；
按上述方法获得的促生能力强的10个菌种按其特征分别编号为：溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02、固氮产IAA菌株N-01、固氮菌株N-02、固氮菌株N-03、固氮菌株YB-08、溶磷菌株N-06、溶磷菌株YB-10、溶磷产IAA菌株YB-07和溶磷固氮产IAA菌株YB-09。
本发明还公开了巨菌草根际促生菌在制备促进植物生长的制品中的用途。
进一步的，所述促进植物生长的制品为微生物菌肥。
本发明还公开了一种植物促生菌剂，包括前面所述的巨菌草根际促生菌。
进一步的，所述巨菌草根际促生菌由溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02和固氮产IAA菌株N-01组成。
进一步的，所述巨菌草根际促生菌由溶磷产IAA菌株YB-07、固氮菌株YB-08、溶磷固氮产IAA菌株YB-09和溶磷菌株-10组成。
本发明公开了一种巨菌草生物有机肥，包括前面所述的巨菌草根际促生菌和组分A，所述组分A包括巨菌草秸秆、新鲜牛粪、新鲜羊粪、新鲜鸡粪和生物有机腐熟剂。
进一步的，所述巨菌草根际促生菌由溶磷产IAA菌株YB-07、固氮菌株YB-08、溶磷固氮产IAA菌株YB-09和溶磷菌株-10组成。
进一步的，按质量比，所述巨菌草根际促生菌为0.1-0.3％；所述组分A中巨菌草秸秆为45-55％、新鲜牛粪为10-20％、新鲜羊粪为10-20％、新鲜鸡粪为10-20％和生物有机腐熟剂为2-10％。
本发明还公开了一种制备前面所述的巨菌草生物有机肥的方法，包括：
(1)将新鲜牛粪、新鲜羊粪、新鲜鸡粪、粉碎的水份质量比为2-15％的巨菌草秸秆进行初步混合，混合后物料的含水量维持在55-65％，即拌好后，用手抓一把，捏在手中紧握，手指缝中有水印但以水不往下滴为适；
(2)在干燥、通风的地方开始堆积发酵；第3天，堆肥中肥料会从20℃升到50℃；采用高温干发酵，发酵温度在50-60℃，因此在50℃开始翻堆，每天一次，如堆温超过65℃，再翻堆，12h翻一次，以供应氧气、散热和物料发酵均匀，保持15d；
(3)在发酵过程中，翻堆过程中及时喷洒水分，保持物料的水分质量比为55-65％；
(4)将各巨菌草根际促生菌菌株制作成菌悬液，菌悬液发酵制作成菌剂后，等比例混合一次性加入堆肥中，物料水分质量比调节为30％以下，温度在30℃以下，放置72h；有机肥整个发酵过程15天即可完成。
附图说明
图1为实验取材地点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改或改动，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
巨菌草根际促生菌，包括溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02、固氮产IAA菌株N-01、固氮菌株N-02、固氮菌株N-03、固氮菌株YB-08、溶磷菌株N-06、溶磷菌株YB-10、溶磷产IAA菌株YB-07和溶磷固氮产IAA菌株YB-09中的一种或多种；
巨菌草样品取自于全国各地菌草种殖示范基地，取巨菌草根系，用无菌ddH2O洗涤，切成小块，称取1.5cm根段进行表面消毒，将截取的植物样品的根部清洗干净，用吸水纸吸干，75％酒精浸泡2-3min，无菌ddH2O洗涤3次后，再用5-20％NaClO溶液消毒表面5-10min，最后用无菌水继续洗涤3次；另取巨菌草根际土壤，与无菌ddH2O混合摇匀，按8个浓度梯度，10-2～10–9g/mL，涂于培养基上，各设重复3次，所有平板在28℃±2℃下培养72h，划线分离纯化后，得到根际土壤中的促生菌，分别挑选不同形状的菌落，编号，保存，检测；
溶磷细菌的筛选及分离纯化：取细菌悬液在溶磷细菌培养基上涂布，表面消毒后取根，均匀截取1.5cm，放入溶磷细菌培养基中，所有培养基均以28℃±2℃培养3-5d，分别挑选较大的透明环菌株，分离纯化，多次传代培养，选择生长较好的菌株进行保存；溶磷细菌的促生能力的测定：用钼蓝比色法测定处理液中的磷含量，取50μg/mL的磷标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，分别置于20mL具塞试管中，分别加蒸馏水至6mL，再加入1mol·L-1的硫酸溶液2.0mL，2.0mL铁-钼酸试剂，混匀；静置15min后，用比色计在660nm波长处测定吸光度；用所得数据绘制标准曲线，以测出的吸光度通过标准曲线方程计算待测样品溶液的磷含量；
固氮菌的筛选及分离纯化：分别称取巨菌草样品根5.0g，用无菌水冲洗干净，进行表面灭菌，步骤如下：1)在70％乙醇浸泡1min；2)无菌水漂洗1min；3)2％次氯酸钠浸泡10min，无菌水漂洗三次，然后用无菌剪刀剪成0.5cm的小块，放在阿须贝(Ashby)无氮培养基平板上，28℃培养直至组织块周围长出菌苔，用无菌水将菌苔清洗下来，梯度稀释至10-5，取10-3，10-4，10-5稀释度的菌溶液100μL涂至阿须贝固体培养基，28℃温箱中培养，最终挑选出生长较好的菌株进行保存；固氮菌的促生能力的测定：将待测菌株接入Ashby液体培养基中培养3d，在620nm处测其OD值，比较OD值的大小，初步确认各菌株固氮能力的大小，另将待测菌株接入盛有蛋白胨水(10g/L)培养液的试管中，28℃±2℃静置培养3d，在每个试管中加入0.5mLNessler’s试剂，出现黄褐色沉淀的结果则为产NH3阳性反应；
产IAA菌分离纯化及促生能力的测定：将每株菌株在IAA培养基中培养5d，取2mL培养液体，10000r/min离心15min，并且向每1mL上清液中加入0.5mLSalkowski试剂，并且在暗室温下显色1h后在530nm处测量OD值；以空白培养基作对照，并以标品IAA对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量；
按上述方法获得的促生能力强的10个菌种按其特征分别编号为：溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02、固氮产IAA菌株N-01、固氮菌株N-02、固氮菌株N-03、固氮菌株YB-08、溶磷菌株N-06、溶磷菌株YB-10、溶磷产IAA菌株YB-07和溶磷固氮产IAA菌株YB-09。
本发明还公开了巨菌草根际促生菌在制备促进植物生长的制品中的用途。
进一步的，所述促进植物生长的制品为微生物菌肥。
本发明还公开了一种植物促生菌剂，包括前面所述的巨菌草根际促生菌。
进一步的，所述巨菌草根际促生菌由溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02和固氮产IAA菌株N-01组成。
进一步的，所述巨菌草根际促生菌由溶磷产IAA菌株YB-07、固氮菌株YB-08、溶磷固氮产IAA菌株YB-09和溶磷菌株-10组成。
本发明公开了一种巨菌草生物有机肥，包括前面所述的巨菌草根际促生菌和组分A，所述组分A包括巨菌草秸秆、新鲜牛粪、新鲜羊粪、新鲜鸡粪和生物有机腐熟剂。
进一步的，所述巨菌草根际促生菌由溶磷产IAA菌株YB-07、固氮菌株YB-08、溶磷固氮产IAA菌株YB-09和溶磷菌株-10组成。
进一步的，按质量比，所述巨菌草根际促生菌为0.1-0.3％；所述组分A中巨菌草秸秆为45-55％、新鲜牛粪为10-20％、新鲜羊粪为10-20％、新鲜鸡粪为10-20％和生物有机腐熟剂为2-10％。
本发明还公开了一种制备前面所述的巨菌草生物有机肥的方法，包括：
(1)将新鲜牛粪、新鲜羊粪、新鲜鸡粪、粉碎的水份质量比为2-15％的巨菌草秸秆进行初步混合，混合后物料的含水量维持在55-65％，即拌好后，用手抓一把，捏在手中紧握，手指缝中有水印但以水不往下滴为适；
(2)在干燥、通风的地方开始堆积发酵；第3天，堆肥中肥料会从20℃升到50℃；采用高温干发酵，发酵温度在50-60℃，因此在50℃开始翻堆，每天一次，如堆温超过65℃，再翻堆，12h翻一次，以供应氧气、散热和物料发酵均匀，保持15d；
(3)在发酵过程中，翻堆过程中及时喷洒水分，保持物料的水分质量比为55-65％；
(4)将各巨菌草根际促生菌菌株制作成菌悬液，菌悬液发酵制作成菌剂后，等比例混合一次性加入堆肥中，物料水分质量比调节为30％以下，温度在30℃以下，放置72h；有机肥整个发酵过程15天即可完成。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品的采集:
菌草样品取自于全国各地菌草养殖基地，见附图1。将菌草连同根周围的土壤一起挖出，储存在4℃冰箱中。取菌草根系，用无菌ddH2O洗涤，切成小块，各称取约1.5cm根段进行表面消毒后放入筛选培养基培养以获得表面微生物。另取根际土壤，与无菌ddH2O混合摇匀，按8个浓度梯度(10-2～10–9g/mL)涂于培养基上，各设重复一次。所有平板在28℃±2℃下培养72h，划线分离纯化后，得到根际土壤中的促生菌，分别挑选不同形状的菌落，编号，保存，检测。
1.1.2主要培养基
(1)LB(luria-bertani)培养基(蛋白胨10g；NaCl 10.0g；酵母膏5.0g；H2O 1000mL；pH 7.0)。
(2)马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(土豆200.0g；葡萄糖20.0g；蒸馏水1000mL；琼脂20.0g；pH 7.2)。
(3)阿须贝(Ashby)无氮培养基(葡萄糖10.0g；KH2PO4 0.2g；MgSO4·7H2O 0.2g；NaCl 0.2g；CaSO4·2H2O 0.1g；CaCO3 5.0g；琼脂20.0g；H2O 1000mL；pH7.0)。
(4)溶磷细菌培养基(NaCl 0.3g；MgSO4·7H2O 0.3g；MnSO4·4H2O 0.03g；KCl0.3g；(NH4)2SO4 0.5g；Fe SO4·7H2O 0.03g；Ca3(PO4)25.0g；蔗糖10.0g；琼脂20.0g；H2O 1000mL；pH 7.0)。
(5)产IAA液体发酵培养基:蛋白胨5.0g，(NH4)2SO4 5.0g，葡萄糖10.0g，Na2HPO4·12H2O 4.0g，NaH2PO4·2H2O 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.2g，蒸馏水1 000mL，pH7.0，高压灭菌后用过滤器加入L－色氨酸100mg/L。
1.1.3菌剂及巨菌草生物有机肥制作所需的材料
供试菌种：NP-01、NP-02、N-01、N-02、N-03、N-06、YB-07、YB-08、YB-09、YB-10；
吸附载体：巨菌草秸秆；牛粪；羊粪；鸡粪。
1.2方法
1.2.1表面消毒的方法及步骤
将截取的植物样品的根部清洗干净，用吸水纸吸干，75％酒精浸泡2-3min，无菌ddH2O洗涤3次后，再用5-20％NaClO溶液消毒表面5-10min，最后用无菌水继续洗涤3次。
1.2.2溶磷细菌的筛选及分离纯化
取细菌悬液在溶磷细菌培养基上涂布，表面消毒后取根，均匀截取1.5cm，放入溶磷细菌培养基中，所有培养基均以28℃±2℃培养3-5d，分别挑选较大的透明环菌株，分离纯化，多次传代培养，选择生长较好的菌株进行保存，以供进一步研究。
1.2.3溶磷细菌的促生能力的测定
用钼蓝比色法测定处理液中的磷含量取50μg/mL的磷标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，分别置于20mL具塞试管中，分别加蒸馏水至6mL，再加入1mol·L-1的硫酸溶液2.0mL，2.0mL铁-钼酸试剂，混匀。静置15min后，用比色计在660nm波长处测定吸光度。用所得数据绘制标准曲线，以测出的吸光度通过标准曲线方程计算待测样品溶液的磷含量。
1.2.4固氮菌的筛选及分离纯化
分别称取菌草样品根5.0g，用无菌水冲洗干净，进行表面灭菌，步骤如下：1)在70％乙醇浸泡1min；2)无菌水漂洗1min；3)2％次氯酸钠浸泡10min，无菌水漂洗三次，然后用无菌剪刀剪成0.5cm的小块，放在阿须贝(Ashby)无氮培养基平板上，28℃培养直至组织块周围长出菌苔，用无菌水将菌苔清洗下来，梯度稀释至10-5，取10-3，10-4，10-5稀释度的菌溶液100μLl涂至阿须贝固体培养基，28℃温箱中培养，最终挑选出生长较好的菌株进行保存。
1.2.5固氮菌的促生能力的测定
将待测菌株接入Ashby液体培养基中培养3d,在620nm处测其OD值。比较OD值的大小,初步确认各菌株固氮能力的大小。另将待测菌株接入盛有蛋白胨水(10g/L)培养液的试管中,28℃±2℃静置培养3d,在每个试管中加入0.5mLNessler’s试剂,出现黄褐色沉淀的结果则为产NH3阳性反应。
1.2.6产IAA菌分离纯化及促生能力的测定
将每株菌株在IAA培养基中培养5d，取2mL培养液体，将10000r/min离心15min，，并且向每1mL上清液中加入0.5mL Salkowski(每升10.8mol/L H2SO4含有4.5g FeCl3)试剂，并且在暗室温下显色1h后在530nm处测量OD值。以空白培养基作对照，并以标品IAA(上海蓝季科技发展有限公司)对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量(mg/L)。
1.3结果
1.3.1功能菌之间的拮抗及结果
本实验对以上10种菌株两两相互划线在PDA培养基上进行培养，试验结果表明，10种菌株在PDA培养基上划线交叉处长势良好，均没有出现明显的生物拮抗现象。
1.3.2 PGPR菌株的筛选结果
本实验应用3种不同的培养基,分别从全国各地区巨菌草种植基地菌草根际中及土壤中分离、纯化出80株具有促生长作用的PGPR细菌。其中筛选出10株的菌株促生长能力比较强。这些菌株的数量和相关信息如表1所示。
表1所需的菌株种类
表2显示了选取菌株的促生能力，本试验采用钼蓝比色法测定溶磷量，溶磷量为20.1-45.1mg/100mL之间，其中NP-01溶磷量最高，达45.1mg/100mL；YB-09溶磷量最低，达20.1mg/100mL。产IAA能力最高的菌株为N-01，达26.5mg/L，并且含有固氮能力。
表2各类菌株的促生能力
注：“+++”到“+”表示不同颜色代表不同产氮量；“+++”：深褐色；“++”：黄褐色，“+”：浅黄色；表中数据表示平均值±标准偏差；对照的pH为7.02±0.04；不同字母代表不同显著性差异(Duncan-test,P<0.05)。
2 PGPR菌剂及巨菌草生物有机肥的研制
2.1菌剂制作
2.1.1 PGPR菌株菌悬液制作
分别接种促生效果高的各PGPR菌株于LB液体培养基中，于28℃,125r/min培养48h。待菌株充分生长后,利用紫外分光光度计测定各菌株菌悬液OD值。当OD值大于0.5(波长660nm)，发酵菌液中的细胞数目>109个/mL时调其OD值相等,并将菌株菌悬液等体积混合待各混合菌株菌悬液充分生长后即可用于各PGPR菌肥制作。
2.1.2 PGPR菌剂的制备
将150mL LB液体培养基放入300mL三角瓶中，灭菌，室温放置1–2d，检验无污染后分别接种15mL上述菌悬液，28℃，125r/min培养2-3d。测量发酵液的OD值，当OD值大于0.5(波长660nm)，且发酵液中的细胞数>109个/mL时，将发酵液注入装有灭菌刻度筒的灭菌玻璃瓶中，密封并室温保存。
2.2巨菌草生物有机肥制作
(1)首先将新鲜牛粪、新鲜羊粪、新鲜鸡粪、粉碎的巨菌草秸秆(水份质量比为10％左右)进行初步混合,所述各组分质量比为：菌草秸秆(50％)、新鲜牛粪(15％)、羊粪(15％)、鸡粪(15％)、生物有机腐熟剂(5％)，含水量为60％左右，即拌好后，用手抓一把，捏在手中紧握，手指缝中有水印但以水不往下滴为适；
(2)然后在干燥，通风的地方开始堆积发酵。第3d，堆肥中肥料会从20℃到50℃(这是由于堆肥过程中微生物极速繁殖，有机物在微生物的分解下散发出大量热量)。采用高温干发酵，发酵温度在50-60℃。因此需要在50℃开始翻堆，每天一次，如堆温超过65℃，再翻堆，12h翻一次，以供应氧气、散热和物料发酵均匀，保持15d；
(3)在发酵过程中，翻堆过程中及时喷洒水分，保持水分的55-65％；
(4)最后将所需的菌株制作成菌悬液，然后按照提前设计的菌株搭配方案，等比例混合一次性加入各实验组中(菌种所用质量比为0.2％)，水分质量比调节为30％以下，温度在30℃以下，放置72h。
表3生物有机肥产品技术指标
3盆栽试验
3.1盆栽试验土壤来源及处理:
盆栽试验土壤取自延安大学后山试验场，用孔径为5mm的筛子筛选，将处理后的土壤与细砂按土壤∶砂(W/W)＝2∶1的比例混合均匀，然后放入直径为12cm的塑料盆中，每盆含土约1.5kg。经检测土壤的理化性质为：全氮0.53％，全磷2036mg/kg，有效磷10.8mg/kg，速效钾154.1mg/kg，全碳1.44％。
3.2小麦种子处理
将饱满的豫农035小麦种子品种(河南省新农种业有限公司)用冷水浸泡4-6h，取出，用52-55℃的温水浸泡1–2min，使种子温度达到50℃，取出，放入56℃的温水中，水温保持在55℃，浸泡5min，取出，摊在浅板上均匀，盖上布，一天换水沥干两、三次，保持湿度，1-2d后，会长出胚芽。
3.3试验设计
本试验于2017年5月15日至5月30日进行土壤盆栽试验。盆栽采用15cm×16cm的圆筒形钵体，每盆土壤1.5kg。共设置2个试验组别,第一个试验组设立6个处理，每个处理重复3次；第二个试验组设立5个处理，每个处理重复3次。菌剂试验中菌剂5d加一次，每一盆一次剂量200mL；巨菌草生物有机肥试验组中7d加一次，每一盆中一次加500g。
具体试验设计见以下表格4：
表格4盆栽各试验组设计
测定各试验组和对照组小麦植株各形态参数，为期15d，包括株高(cm)、叶绿素含量(spad)、鲜重(g),自然风干后称其干重(g)，并做统计学分析。
4数据处理
实验数据采用Excel 2007进行统计学分析。
5盆栽试验结果
本试验对小麦为期2周多的观察，测量各试验组和对照小麦的各种形态学参数。
从表5可以看出，菌剂对小麦株高较对照增加明显，增加幅度为1.8％-30.4％，而且从整体来讲，增长幅度处于由低到高的层次，与巨菌草生物有机肥增长趋势恰好相反。与CK0比较，除了X2处理对小麦株高的促进作用不太明显，其它处理都较明显，X1处理最高在第9天增加到30.4％。除此之外，与CK1和CK2相较，X4在鲜重和干重增加较高，鲜重最高增加72.7％，干重达50.0％，而X1在叶绿素含量增加最高，达78.3％。
表5菌剂对小麦生态学参数的影响
注：表中数据表示平均值±标准偏差；不同字母代表不同显著性差异(Duncan-test,P<0.05).
从表6可以看出，巨菌草生物有机肥对小麦株高较对照增加明显，增加幅度为0.9％-37.9％，而且从整体来讲，增长幅度处于由高到低的层次。较CK1和CK2来说，Y1处理对小麦株高的促进作用达到了很高，最高增加了37.9％。另一方面，与CK1和CK2相较，Y3在鲜重和干重增加较高，鲜重最高增加45.0％，干重达33.3％而Y1在叶绿素含量增加最高，达38.3％。
表6巨菌草生物有机肥对小麦生态学参数
注：表中数据表示平均值±标准偏差；不同字母代表不同显著性差异(Duncan-test,P<0.05)。
6结论与讨论
(1)从方差分析当中，与相应的对照组与试验组相比，菌剂X1和X4效果极其显著，两者无明显差别；同样，巨菌草生物有机肥Y1效果较为显著。
(2)段秀梅等的测定结果在株高和干重分别增加了35.5％和28.9％,Hamdy EIZemrany等的结果在鲜重上增加34％。祁宏英的结果在叶绿素含量增加20.31％，而本实验施用PGPR菌剂，显著地促进小麦的生长，提高小麦的产量和品质，其中除了X2组外，其它实验组对小麦促进效应及其显著，尤其是X1和X4，与CK0相比，在株高、鲜重、干重和叶绿素含量增加了30.4％、72.7％、50.0％和78.3％，效果较为明显。对于巨菌草生物有机肥而言，与其对照组相比，Y1组促进效应较为显著，在株高、鲜重、干重和叶绿素含量增加了37.9％、45.0％、33.3％和38.3％。与之相比，相同之处在于本试验同样采用的是诸多文献中对于样品采集的方法、菌株的定性检测以及制备菌悬液，菌剂等一些方面有所雷同；不同之处，一方面在于取材，另一方面菌剂优势在于多菌株混接的方法从而得到更好的效果，而巨菌草生物有机肥则是利用了巨菌草以及禽畜粪便作为载体，其中丰富的有机物含量达到了试验的效果。

Claims (10)

1.巨菌草根际促生菌，其特征在于，包括溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02、固氮产IAA菌株N-01、固氮菌株N-02、固氮菌株N-03、固氮菌株YB-08、溶磷菌株N-06、溶磷菌株YB-10、溶磷产IAA菌株YB-07和溶磷固氮产IAA菌株YB-09中的一种或多种；
巨菌草样品取自于全国各地菌草种殖示范基地，取巨菌草根系，用无菌ddH2O洗涤，切成小块，称取1.5cm根段进行表面消毒，将截取的植物样品的根部清洗干净，用吸水纸吸干，75％酒精浸泡2-3min，无菌ddH2O洗涤3次后，再用5-20％NaClO溶液消毒表面5-10min，最后用无菌水继续洗涤3次；另取巨菌草根际土壤，与无菌ddH2O混合摇匀，按8个浓度梯度，10-2～10–9g/mL，涂于培养基上，各设重复3次，所有平板在28℃±2℃下培养72h，划线分离纯化后，得到根际土壤中的促生菌，分别挑选不同形状的菌落，编号，保存，检测；
溶磷细菌的筛选及分离纯化：取细菌悬液在溶磷细菌培养基上涂布，表面消毒后取根，均匀截取1.5cm，放入溶磷细菌培养基中，所有培养基均以28℃±2℃培养3-5d，分别挑选较大的透明环菌株，分离纯化，多次传代培养，选择生长较好的菌株进行保存；溶磷细菌的促生能力的测定：用钼蓝比色法测定处理液中的磷含量，取50μg/mL的磷标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，分别置于20mL具塞试管中，分别加蒸馏水至6mL，再加入1mol·L-1的硫酸溶液2.0mL，2.0mL铁-钼酸试剂，混匀；静置15min后，用比色计在660nm波长处测定吸光度；用所得数据绘制标准曲线，以测出的吸光度通过标准曲线方程计算待测样品溶液的磷含量；
固氮菌的筛选及分离纯化：分别称取巨菌草样品根5.0g，用无菌水冲洗干净，进行表面灭菌，步骤如下：1)在70％乙醇浸泡1min；2)无菌水漂洗1min；3)2％次氯酸钠浸泡10min，无菌水漂洗三次，然后用无菌剪刀剪成0.5cm的小块，放在阿须贝(Ashby)无氮培养基平板上，28℃培养直至组织块周围长出菌苔，用无菌水将菌苔清洗下来，梯度稀释至10-5，取10-3，10-4，10-5稀释度的菌溶液100μL涂至阿须贝固体培养基，28℃温箱中培养，最终挑选出生长较好的菌株进行保存；固氮菌的促生能力的测定：将待测菌株接入Ashby液体培养基中培养3d，在620nm处测其OD值，比较OD值的大小，初步确认各菌株固氮能力的大小，另将待测菌株接入盛有蛋白胨水(10g/L)培养液的试管中，28℃±2℃静置培养3d，在每个试管中加入0.5mLNessler’s试剂，出现黄褐色沉淀的结果则为产NH3阳性反应；
产IAA菌分离纯化及促生能力的测定：将每株菌株在IAA培养基中培养5d，取2mL培养液体，10000r/min离心15min，并且向每1mL上清液中加入0.5mLSalkowski试剂，并且在暗室温下显色1h后在530nm处测量OD值；以空白培养基作对照，并以标品IAA对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量；
按上述方法获得的促生能力强的10个菌种按其特征分别编号为：溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02、固氮产IAA菌株N-01、固氮菌株N-02、固氮菌株N-03、固氮菌株YB-08、溶磷菌株N-06、溶磷菌株YB-10、溶磷产IAA菌株YB-07和溶磷固氮产IAA菌株YB-09。
2.权利要求1所述的巨菌草根际促生菌在制备促进植物生长的制品中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述促进植物生长的制品为微生物菌肥。
4.一种植物促生菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的巨菌草根际促生菌。
5.根据权利要求4所述的植物促生菌剂，其特征在于，所述巨菌草根际促生菌由溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02和固氮产IAA菌株N-01组成。
6.根据权利要求4所述的植物促生菌剂，其特征在于，所述巨菌草根际促生菌由溶磷产IAA菌株YB-07、固氮菌株YB-08、溶磷固氮产IAA菌株YB-09和溶磷菌株-10组成。
7.一种巨菌草生物有机肥，其特征在于，包括权利要求1所述的巨菌草根际促生菌和组分A，所述组分A包括巨菌草秸秆、新鲜牛粪、新鲜羊粪、新鲜鸡粪和生物有机腐熟剂。
8.根据权利要求7所述的巨菌草生物有机肥，其特征在于，所述巨菌草根际促生菌由溶磷产IAA菌株YB-07、固氮菌株YB-08、溶磷固氮产IAA菌株YB-09和溶磷菌株-10组成。
9.根据权利要求7所述的巨菌草生物有机肥，其特征在于，按质量比，所述巨菌草根际促生菌为0.1-0.3％；所述组分A中巨菌草秸秆为45-55％、新鲜牛粪为10-20％、新鲜羊粪为10-20％、新鲜鸡粪为10-20％和生物有机腐熟剂为2-10％。
10.一种制备权利要求9所述的巨菌草生物有机肥的方法，其特征在于，包括：
(1)将新鲜牛粪、新鲜羊粪、新鲜鸡粪、粉碎的水份质量比为2-15％的巨菌草秸秆进行初步混合，混合后物料的含水量维持在55-65％，即拌好后，用手抓一把，捏在手中紧握，手指缝中有水印但以水不往下滴为适；
(2)在干燥、通风的地方开始堆积发酵；第3天，堆肥中肥料会从20℃升到50℃；采用高温干发酵，发酵温度在50-60℃，因此在50℃开始翻堆，每天一次，如堆温超过65℃，再翻堆，12h翻一次，以供应氧气、散热和物料发酵均匀，保持15d；
(3)在发酵过程中，翻堆过程中及时喷洒水分，保持物料的水分质量比为55-65％；
(4)将各巨菌草根际促生菌菌株制作成菌悬液，菌悬液发酵制作成菌剂后，等比例混合一次性加入堆肥中，物料水分质量比调节为30％以下，温度在30℃以下，放置72h；有机肥整个发酵过程15天即可完成。
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