CN104387150A - 苜蓿种子根瘤菌种衣剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苜蓿种子根瘤菌种衣剂及其制备方法。本发明所提供的苜蓿种子根瘤菌剂由含有根瘤菌剂、粘着剂和基质的原料制成，其中根瘤菌剂由根瘤菌菌液与根瘤菌吸附剂混匀而成，根瘤菌菌液的活性成分是苜蓿中华根瘤菌，根瘤菌剂中钼酸铵的质量百分含量为0.1％-0.2％，根瘤菌剂中钼酸铵和苜蓿中华根瘤菌的配比满足100g所述根瘤菌剂中钼酸铵的含量为(0.1-0.2)g，100g所述根瘤菌剂中所述苜蓿中华根瘤菌的含量为≥5×1011cfu。本发明将苜蓿根瘤菌与最佳浓度的钼元素相互配合，并在粘着剂中加入脱脂乳作为保护剂，制备的苜蓿种子丸衣剂不仅延长了根瘤菌的活性，促进植物结瘤固氮，而且大幅提高了苜蓿的产量，改善了苜蓿的品质。

Description

苜蓿种子根瘤菌种衣剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物领域中一种苜蓿种子根瘤菌种衣剂及其应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)性喜温暖、耐寒、适应性广，营养丰富、蛋白质含量高，适口性好，是当今世界分布最广的栽培牧草。苜蓿种子很小，自身携带的养分少，处于正常萌发状态的种子，对干旱、寒冷等不利播种条件的抵抗能力相应较弱。因此在种植之前，一般会对苜蓿种子进行丸衣化处理。
根瘤菌是一类革兰氏阴性需氧杆菌，能够与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气为植物提供营养。但是目前，根瘤菌在种子包衣中仍存在存活时间短、菌肥效果差的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高苜蓿(如紫花苜蓿)植株单株的结瘤数、瘤重和根瘤固氮酶活性，以及如何提高苜蓿(如紫花苜蓿)植株单株株高、单株鲜重(植株全株鲜重，下文同)、单株干重(植株全株干重，下文同)及产量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种苜蓿种子根瘤菌种衣剂。
本发明所提供的苜蓿种子根瘤菌种衣剂由含有根瘤菌剂、粘着剂和基质的原料制成，所述根瘤菌剂、所述粘着剂和所述基质这三种组分每种组分均独立包装；所述根瘤菌剂由根瘤菌菌液与根瘤菌吸附剂混匀而成，所述根瘤菌菌液的活性成分是苜蓿中华根瘤菌；所述根瘤菌吸附剂由菌剂载体、碳源、过磷酸钙、石灰、钼酸铵、硼酸和水组成；所述根瘤菌剂中钼酸铵的质量百分含量为0.1％-0.2％；所述根瘤菌剂中，所述根瘤菌菌液与所述根瘤菌吸附剂的配比满足100g所述根瘤菌剂中钼酸铵的含量为(0.1-0.2)g，100g所述根瘤菌剂中所述苜蓿中华根瘤菌的含量为≥5×1011cfu。
所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂中，所述根瘤菌菌液与所述根瘤菌吸附剂的配比具体满足所述根瘤菌剂中所述钼酸铵和所述苜蓿中华根瘤菌的配比为(0.1-0.2)g钼酸铵：5×1011cfu所述苜蓿中华根瘤菌。
所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂中，所述根瘤菌剂中所述苜蓿中华根瘤菌的含量为≥5×109cfu/克，如5×109cfu/克。
所述根瘤菌吸附剂中所述菌剂载体为草炭，所述碳源为蔗糖，所述根瘤菌吸附剂中菌剂载体、碳源、过磷酸钙、石灰、钼酸铵、硼酸和水的质量比为488.5g菌剂载体：1g碳源：0.5g过磷酸钙：10g石灰：(1-1.5)g钼酸铵：0.005g硼酸：(21-31)g水。
所述原料由所述根瘤菌剂、所述粘着剂和所述基质组成，所述根瘤菌剂、所述粘着剂和所述基质的质量比满足100：(1.6-2.0):300。
所述原料由所述根瘤菌剂、所述粘着剂、所述基质和脱脂乳组成，所述粘着剂为羧甲基纤维素钠或海藻酸钠，所述基质为膨润土；所述根瘤菌剂、所述粘着剂、所述基质和所述脱脂乳的质量比满足100：(1.6-2.0)：300：(0.02-0.04)。
所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂为A或B：
A、所述苜蓿中华根瘤菌为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631，所述根瘤菌剂中钼酸铵的质量百分含量为0.2％；
B、所述苜蓿中华根瘤菌为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676，所述根瘤菌剂中钼酸铵的质量百分含量为0.1％。
为解决上述技术问题，本发明还提供了苜蓿种子根瘤菌种衣剂的下述1)-6)中的任一种应用：
1)所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂在制备丸衣苜蓿种子中的应用；
2)所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂在提高苜蓿产量中的应用；
3)所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂在提高苜蓿单株根瘤数中的应用；
4)所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂在提高苜蓿单株根瘤重中的应用；
5)所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂在提高苜蓿根瘤的固氮酶活性中的应用；
6)所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂在提高苜蓿单株株高中的应用。
上述应用中，所述提高苜蓿产量可体现在提高苜蓿植株的重量。
所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂和苜蓿种子制成的丸衣苜蓿种子也属于本发明保护的范围。
上述丸衣苜蓿种子中，所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂与所述苜蓿种子的配比满足100g所述根瘤菌剂：1000g所述苜蓿种子。
上述文中，所述苜蓿可为紫花苜蓿。
本发明的实验证明，本发明的苜蓿种子根瘤菌种衣剂制备方法具有原料来源广泛，生产工艺简单，成本低廉的优点。使用本发明中含有苜蓿中华根瘤菌ACCC17631的苜蓿根瘤菌种衣剂制备的丸衣苜蓿种子(种衣剂A组)与含有苜蓿中华根瘤菌ACCC17631而不含有钼酸铵的丸衣苜蓿种子对照组1及不含有苜蓿中华根瘤菌ACCC17631而含有钼酸铵的丸衣苜蓿种子对照组2相比，其植株单株总根瘤菌数分别增加了70.31％和105.66％(种衣剂A组的植株单株总根瘤菌数为22.89±2.72个/株，对照组1的单株总根瘤菌数为13.44±0.93个/株，对照组2单株的总根瘤菌数为11.13±1.22个/株)；单株根瘤重分别增加了100.00％和100.00％(种衣剂A组的植株单株根瘤重为0.06±0.00g/株，对照组1的单株根瘤重为0.03±0.00g/株，对照组2的单株根瘤重为0.03±0.00g/株)；根瘤固氮酶活性分别提高了794.00％和558.47％(种衣剂A组的根瘤固氮酶活性为169.95±18.93μmol·mL-1·h-1，对照组1的根瘤固氮酶活性为19.01±3.49μmol·mL-1·h-1，对照组2的根瘤固氮酶活性为25.81±6.33μmol·mL-1·h-1)；单株干重分别提高了76.47％和114.29％(种衣剂A组的单株干重为0.30±0.03g/株，对照组1的单株干重为0.17±0.02g/株，对照组2的单株干重为0.14±0.01g/株)；单株株高分别提高了76.44％和59.37％(种衣剂A组的植株单株株高为42.01±1.64cm/株，对照组1的单株株高为23.81±1.03cm/株，对照组2的单株株高为26.36±0.94cm/株)，说明含有苜蓿中华根瘤菌ACCC17631的苜蓿根瘤菌种衣剂中的苜蓿中华根瘤菌ACCC17631与钼酸铵存在协同增效作用。使用本发明中含有苜蓿中华根瘤菌ACCC17676的苜蓿根瘤菌种衣剂制备的丸衣苜蓿种子(种衣剂B组)与含有苜蓿中华根瘤菌ACCC17676而不含有钼酸铵的丸衣苜蓿种子对照组3及不含有苜蓿中华根瘤菌ACCC17676而含有钼酸铵的丸衣苜蓿种子对照组4相比，其植株单株总根瘤菌数分别增加了98.18％和64.16％(种衣剂B组的植株单株总根瘤菌数为24.00±2.01个/株，对照组3的单株总根瘤菌数为12.11±2.13个/株，对照组4的单株总根瘤菌数为14.62±3.04个/株)；单株根瘤重分别增加了150.00％和150.00％(种衣剂B组的植株单株根瘤重为0.05±0.02g/株，对照组3的单株根瘤重为0.02±0.00g/株，对照组4的单株根瘤重为0.02±0.00g/株)；根瘤固氮酶活性分别提高了623.16％和385.10％(种衣剂B组的植株的根瘤固氮酶活性为277.33±15.95μmol·mL-1·h-1，对照组3的根瘤固氮酶活性为38.35±8.22μmol·mL-1·h-1，对照组4的根瘤固氮酶活性为57.17±14.36μmol·mL-1·h-1)；单株干重分别提高了76.19％和94.74(种衣剂B组的植株单株干重为0.37±0.04g/株，对照组3的单株干重为0.21±0.02g/株，对照组4的单株干重为0.19±0.01g/株)；单株株高分别提高了54.51％和72.57％(种衣剂B组的植株单株株高为44.16±2.83cm/株，对照组3的单株株高为28.58±1.03cm/株，对照组4的单株株高为25.59±1.86cm/株)，说明含有苜蓿中华根瘤菌ACCC17676的苜蓿根瘤菌种衣剂中的苜蓿中华根瘤菌ACCC17676与钼酸铵存在协同增效作用。本发明属于生物肥料，可以保护生态环境，是一种无公害的有机肥料，较高的实用性和可推广性，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
图1为接种含有苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的不同种衣配方下中苜一号紫花苜蓿生长情况对比(注：p＜0.05)：a为苜蓿植株单株株高对比；b为苜蓿植株单株鲜重的对比；c为苜蓿植株单株干重的对比。
图2为接种含有苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的不同种衣配方下中苜一号紫花苜蓿生长情况对比(注：p<0.05)：a为苜蓿植株单株株高对比；b为苜蓿植株单株鲜重的对比；c为苜蓿植株单株干重的对比。
图3为接种含有苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的不同种衣配方下中苜一号紫花苜蓿结瘤情况对比(注：p<0.05)：a为苜蓿植株单株根瘤数对比；b为苜蓿植株单株根瘤重对比；c为苜蓿根瘤固氮酶活性对比。
图4为接种含有苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的不同种衣配方下中苜一号紫花苜蓿结瘤情况对比(注：p<0.05)：a为苜蓿植株单株根瘤数对比；b为苜蓿植株单株根瘤重对比；c为苜蓿根瘤固氮酶活性对比。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17537、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17558、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)ACCC17617、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676均于本申请的申请日前收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(中国农业微生物菌种保藏管理中心)(简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)。自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得这5个菌株。该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的培养基均为无菌培养基。
下述实施例中的根瘤菌液体培养基：蔗糖20g、大豆粉2.4g、K2HPO4 0.25g、KH2PO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.1g、蒸馏水1000mL，pH 6.8-7.0。
YMA培养基:甘露醇10g、K2HPO4 0.25g、KH2PO4 0.25g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母粉0.8g、NaCl 0.1g、蒸馏水1000mL，pH 6.8-7.0。
水培营养液：KH2PO4 2.2g、KCl 15.5g、MgSO4·7H2O 25.0g、CaCl2·2H2O 21.5g、柠檬酸铁3.0g、NaNO3 3.0g、MnSO4·H2O 0.1g、ZnSO4·7H2O 0.025g、CuSO4·5H2O0.025g、Na2MoO4·2H2O 0.005g、H3BO3 0.025g，以上组分依次溶于500mL蒸馏水中，用时稀释200倍。
下述实施例中的根瘤固氮酶活性测定方法如下：采用乙炔(C2H2)还原法，用气相色谱分析仪测定固氮酶的活性。将冲洗好的植株根系，用滤纸吸去多余的水分后，用解剖刀切下根瘤，主根上的根瘤直接切下，侧根的根瘤切下时保留约0.5cm的根，以保存根瘤的活性。将切下的根瘤置于6mL的反应瓶中，盖上橡皮塞，抽取反应瓶中0.6mL气体，然后注入0.6mL高纯的乙炔气体，在28℃无光条件下反应1h后，抽取50μL待测气体，用上海天美GC7890F气相色谱仪测定乙烯释放量。测定条件如下：柱温180℃、进样口温度150℃，检测器温度170℃。N＝hx×C×V/hs×24.9×t(hx，样品峰面积；hs，标准C2H4峰面积；C，标准C2H4浓度(μmol/mL)；V，样品管体积；t，C2H2反应时间(h)；N，C2H4浓度(μmol·mL-1·h-1)计算得到各菌株的固氮酶活性。
实施例1、利用中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂制备丸衣苜蓿种子
本实施例公开了两种具体的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂，分别是中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A和B，并提供了两种中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A的对照：中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A对照1和中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A对照2；两种中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B的对照：中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B对照3和中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B对照4；以未经过根瘤菌种衣剂包衣的中苜一号紫花苜蓿种子作为对照。下面阐明这些中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂的组成、制备方法及其对苜蓿的影响。
1、利用中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A制备丸衣苜蓿种子
中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A，由根瘤菌剂A、作为粘着剂的羧甲基纤维素钠、作为基质的膨润土和脱脂乳组成，根瘤菌剂A、粘着剂、基质和脱脂乳这四种组分每种组分均独立包装。中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中，根瘤菌剂A、粘着剂、基质和脱脂乳的质量比满足100:1.6:300:0.02。上述根瘤菌剂A由根瘤菌菌液A与含钼根瘤菌吸附剂A混匀而成。根瘤菌菌液A的活性成分是苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631。每532.505g含钼根瘤菌吸附剂A由488.5g作为菌剂载体的草炭、1g作为碳源的蔗糖、0.5g过磷酸钙、10g石灰、1.5g钼酸铵、0.005g硼酸和31g水组成。根瘤菌剂A中，钼酸铵的质量百分含量为0.2％，苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的含量为5×109cfu/g。根瘤菌剂A中，根瘤菌菌液A与根瘤菌吸附剂A的配比满足根瘤菌剂A中钼酸铵和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的配比为0.2g钼酸铵：5×1011cfu苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631。中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A对照1为将中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵替换为相同质量的水，其余成分保持不变；中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A对照2为将中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌菌液A替换为相同体积的上述根瘤菌液体培养基，其余成分保持不变。
1.1、根瘤菌菌液A的制备
菌种活化：实验菌株为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631，将其在斜面培养基上28℃培养48h后,接种到根瘤菌液体培养基中，28℃，150r·min－1转速的摇床中震荡培养48h，收集菌液，该菌液即为根瘤菌菌液A。根瘤菌菌液A中苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的含量为1.73×1010cfu/g。
1.2、含钼根瘤菌吸附剂A的制备
每532.505g含钼根瘤菌吸附剂A由488.5g作为菌剂载体的草炭、1g作为碳源的蔗糖、0.5g过磷酸钙、10g石灰、1.5g钼酸铵，0.005g硼酸和31g水。121℃下灭菌30min，其中，草炭过100目筛。
1.3、根瘤菌剂的制备
1.3.1根瘤菌剂A的制备
将步骤1.1中的根瘤菌菌液A与步骤1.2中的含钼根瘤菌吸附剂A按29:71的质量比混匀，得到根瘤菌剂A，根瘤菌剂A中苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的含量为5×109cfu/克，钼酸铵的质量百分含量为0.2％。
1.3.2、根瘤菌剂A对照1的制备
将步骤1.2中的含钼根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵替换为相同质量的水得到不含钼的根瘤菌吸附剂。将步骤1.1中的根瘤菌菌液A与不含钼的根瘤菌吸附剂按29:71的质量比混匀，得到根瘤菌剂A对照1。
1.3.3、根瘤菌剂A对照2的制备
将步骤1.1中的根瘤菌菌液A替换为等体积的根瘤菌液体培养基与步骤1.2中的含钼根瘤菌吸附剂A按29:71的质量比混匀，得到根瘤菌剂A对照2。
1.4、丸衣苜蓿种子的制备
1.4.1中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A丸衣种子的制备
用95％乙醇浸泡中苜一号紫花苜蓿种子5min，再用新洁尔灭表面灭菌5min，最后用灭菌水清洗10次，得到无菌中苜一号紫花苜蓿种子。
取100g步骤1.3.1中的根瘤菌剂A，向其中加入40mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠作为粘着剂，并加入0.1％(0.1g/100mL)的脱脂乳20mL，搅拌均匀，再加入1000g无菌中苜一号紫花苜蓿种子，反复搅拌，使每粒种子上都粘上有根瘤菌剂A的粘着剂，最后加入300g膨润土作为基质再反复搅拌，使每粒种子都裹上一层丸衣材料，使其丸衣紧实，表面光洁，单粒率高。将丸衣种子放通风处，阴干待用。得到紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A丸衣种子。
1.4.2中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A对照1丸衣种子的制备
将步骤1.4.1中的根瘤菌剂A替换为根瘤菌剂A对照1，其它操作不变得到中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A对照1丸衣种子。
1.4.3中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A对照2丸衣种子的制备
将步骤1.4.1中的根瘤菌剂A替换为根瘤菌剂A对照2，其它操作不变得到中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A对照2丸衣种子。
2、利用中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B制备丸衣苜蓿种子
中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B，由根瘤菌剂B、作为粘着剂的海藻酸钠、作为基质的膨润土和脱脂乳组成，根瘤菌剂B、粘着剂、基质和脱脂乳这四种组分每种组分均独立包装。苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中，根瘤菌剂B、粘着剂、基质和脱脂乳的质量比满足100：2:300:0.04。上述根瘤菌剂B由根瘤菌菌液B与含钼根瘤菌吸附剂B混匀而成。根瘤菌菌液B的活性成分是苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)ACCC17676。每522.005g含钼根瘤菌吸附剂B由488.5g作为菌剂载体的草炭、1g作为碳源的蔗糖、0.5g过磷酸钙、10g石灰、1g钼酸铵、0.005g的硼酸和21g水组成。根瘤菌剂B中，钼酸铵的质量百分含量为0.1％，苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的含量为5×109cfu/g。根瘤菌剂B中，根瘤菌菌液B与根瘤菌吸附剂B的配比满足根瘤菌剂B中钼酸铵和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的配比为0.1g钼酸铵：5×1011cfu苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676。中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B对照3为将紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵替换为相同质量的水，其余成分保持不变；中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B对照4为将紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌菌液B替换为相同体积的上述根瘤菌液体培养基，其余成分保持不变。
2.1、根瘤菌菌液B的制备
菌种活化：实验菌株苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676，将其在斜面培养基上28℃培养48h后,接种到根瘤菌液体培养基中，28℃，150r·min－1转速的摇床中震荡培养48h，收集菌液，该菌液即为根瘤菌菌液B。根瘤菌菌液B中苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的含量为1.05×1010cfu/g。
2.2、含钼根瘤菌吸附剂B的制备
每522.005g含钼根瘤菌吸附剂由488.5g作为菌剂载体的草炭、1g作为碳源的蔗糖、0.5g过磷酸钙、10g石灰、1g钼酸铵、0.005g的硼酸和21g水组成组成，121℃下灭菌30min，其中，草炭过100目筛。
2.3、根瘤菌剂的制备
2.3.1根瘤菌剂B的制备
将步骤2.1中的根瘤菌菌液B与步骤2.2中的含钼根瘤菌吸附剂B按48:52的质量比混匀，得到根瘤菌剂B，根瘤菌剂B中苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的含量为5×109cfu/克，钼酸铵的质量百分含量为0.1％。
2.3.2、根瘤菌剂B对照3的制备
将步骤2.2中的含钼根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵替换为相同质量的水得到不含钼的根瘤菌吸附剂。将步骤2.1中的根瘤菌菌液B与不含钼的根瘤菌吸附剂按48:52的质量比混匀，得到根瘤菌剂B对照3。
2.3.3、根瘤菌剂B对照4的制备
将步骤2.1中的根瘤菌菌液B替换为等体积的根瘤菌液体培养基与步骤2.2中的含钼根瘤菌吸附剂B按48:52的比例混匀，得到根瘤菌剂B对照4。
2.4、丸衣苜蓿种子的制备
2.4.1中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B丸衣种子的制备
用95％乙醇浸泡中苜一号紫花苜蓿种子5min，再用新洁尔灭表面灭菌5min，最后用灭菌水清洗10次，得到无菌中苜一号紫花苜蓿种子。
取100g步骤2.3.1中的根瘤菌剂B，向其中加入50mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠作为粘着剂，并加入0.1％(0.1g/100mL)的脱脂乳40mL，搅拌均匀，再加入1000g无菌中苜一号紫花苜蓿种子，反复搅拌，使每粒种子上都粘上有根瘤菌剂B的粘着剂，最后加入300g膨润土作为基质再反复搅拌，使每粒种子都裹上一层丸衣材料，使其丸衣紧实，表面光洁，单粒率高。将丸衣种子放通风处，阴干待用。得到中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B丸衣种子。
2.4.2中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B对照3丸衣种子的制备
将步骤2.4.1中的根瘤菌剂B替换为根瘤菌剂B对照3，其它操作不变得到中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B对照3丸衣种子。
2.4.3中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B对照4丸衣种子的制备
将步骤2.4.1中的根瘤菌剂B替换为根瘤菌剂B对照4，其它操作不变得到中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B对照4丸衣种子。
3、丸衣种子对苜蓿生长及结瘤的影响
3.1、采集土样，风干，装入7cm×7cm盆中，加水使土壤含水量达25-30％。然后将步骤1.4.1中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A丸衣种子均匀播种至盆中，然后覆盖一层薄薄的细土，放置温室。随时观察，及时浇水，保持其土壤湿润。培养45天，观测单株总根瘤数、单株根瘤重、根瘤固氮酶活性、单株株高、单株鲜重、单株干重，将该处理组称为种衣剂A组。
3.2、将步骤3.1中的步骤1.4.1中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A丸衣种子替换为步骤1.4.2中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A对照1丸衣种子，其它操作不变，得到对照组1。
3.3、将步骤3.1中的步骤1.4.1中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A丸衣种子替换为步骤1.4.3中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A对照2丸衣种子，其它操作不变，得到对照组2。
3.4、采集土样，风干，装入7cm×7cm盆中，加水使土壤含水量达25-30％。然后将步骤2.4.1中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B丸衣种子均匀播种至盆中，然后覆盖一层薄薄的细土，放置温室。随时观察，及时浇水，保持其土壤湿润。培养45天，观测单株总根瘤数、单株根瘤重、根瘤固氮酶活性、单株株高、单株鲜重、单株干重。将该处理组称为种衣剂B组。
3.5、将步骤3.4中的步骤2.4.1中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B丸衣种子替换为步骤2.4.2中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B对照3丸衣种子，其它操作不变，得到对照组3。
3.6、将步骤3.4中的步骤2.4.1中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B丸衣种子替换为步骤2.4.3中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B对照4丸衣种子，其它操作不变，得到对照组4。
3.7、将步骤3.1中的步骤1.4.1中的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A丸衣种子替换为未经过根瘤菌种衣剂包衣的中苜一号紫花苜蓿种子，其它操作不变，得到对照组。
实验重复三次，每次重复上述3.1-3.7中的6个处理组，每个处理组9盆。
表1结果表明种衣剂A组的植株单株总根瘤数、单株根瘤重及根瘤固氮酶活性均高于对照组、对照组1和对照组2，其中单株总根瘤菌数分别比对照组、对照组1和对照组2高出347.95％、70.31％和105.66％(种衣剂A组的植株单株总根瘤菌数为22.89±2.72个/株，对照组的单株总根瘤菌数为5.11±0.72个/株，对照组1的单株总根瘤菌数为13.44±0.93个/株，对照组2单株的总根瘤菌数为11.13±1.22个/株)；单株根瘤重分别比对照组、对照组1和对照组2高出500.00％、100.00％和100.00％(种衣剂A组的植株单株根瘤重为0.06±0.00g/株，对照组的单株根瘤重为0.01±0.00g/株，对照组1的单株根瘤重为0.03±0.00g/株，对照组2的单株根瘤重为0.03±0.00g/株)；根瘤固氮酶活性分别比对照组、对照组1和对照组2高出687.17％、794.00％和558.47％(种衣剂A组的根瘤固氮酶活性为169.95±18.93μmol·mL-1·h-1，对照组的根瘤固氮酶活性为21.59±11.71μmol·mL-1·h-1，对照组1的根瘤固氮酶活性为19.01±3.49μmol·mL-1·h-1，对照组2的根瘤固氮酶活性为25.81±6.33μmol·mL-1·h-1)。表1结果表明种衣剂B组的植株单株总根瘤数、单株根瘤重及根瘤固氮酶活性均高于对照组、对照组3和对照组4，其中单株总根瘤菌数分别比对照组、对照组3和对照组4高出369.67％、98.18％和64.16％(种衣剂B组的植株单株总根瘤菌数为24.00±2.01个/株，对照组的单株总根瘤菌数为5.11±0.72个/株，对照组3的单株总根瘤菌数为12.11±2.13个/株，对照组4的单株总根瘤菌数为14.62±3.04个/株)；单株根瘤重分别比对照组、对照组3和对照组4高出400.00％、150.00％和150.00％(种衣剂B组的植株单株根瘤重为0.05±0.02g/株，对照组的单株根瘤重为0.01±0.00g/株，对照组3的单株根瘤重为0.02±0.00g/株，对照组4的单株根瘤重为0.02±0.00g/株)；根瘤固氮酶活性分别比对照组、对照组3和对照组4高出1184.53％、623.16％和385.10％(种衣剂B组的植株的根瘤固氮酶活性为277.33±15.95μmol·mL-1·h-1，对照组的根瘤固氮酶活性为21.59±11.71μmol·mL-1·h-1，对照组3的根瘤固氮酶活性为38.35±8.22μmol·mL-1·h-1，对照组4的根瘤固氮酶活性为57.17±14.36μmol·mL-1·h-1)。
表2结果表明种衣剂A组的植株单株株高、单株鲜重和单株干重均高于对照组、对照组1和对照组2，其中单株株高分别比对照组、对照组1和对照组2高出203.98％、76.44％和59.37％(种衣剂A组的植株单株株高为42.01±1.64cm/株，对照组的单株株高为13.82±0.66cm/株，对照组1的单株株高为23.81±1.03cm/株，对照组2的单株株高为26.36±0.94cm/株)；单株鲜重分别比对照组、对照组1和对照组2高出400.00％、83.91％和125.35％(种衣剂A组的单株分鲜重为1.60±0.12g/株，对照组的单株鲜重为0.32±0.04g/株，对照组1的单株鲜重为0.87±0.05g/株，对照组2的单株鲜重为0.71±0.05g/株)；单株干重分别比对照组、对照组1和对照组2高出150.00％、76.47％和114.29％(种衣剂A组的单株干重为0.30±0.03g/株，对照组的单株干重为0.12±0.01g/株，对照组1的单株干重为0.17±0.02g/株，对照组2的单株干重为0.14±0.01g/株)。表2结果表明种衣剂B组的植株单株株高、单株鲜重和单株干重均高于对照组、对照组3和对照组4，其中单株株高分别比对照组、对照组3和对照组4高出219.54％、54.51％和72.57％(种衣剂B组的植株单株株高为44.16±2.83cm/株，对照组的单株株高为13.82±0.66cm/株，对照组3的单株株高为28.58±1.03cm/株，对照组4的单株株高为25.59±1.86cm/株)；单株鲜重分别比对照组、对照组3和对照组4高出396.88％、74.73％和67.37(种衣剂B组的植株单株鲜重为1.59±0.18g/株，对照组的单株鲜重为0.32±0.04g/株，对照组3的单株鲜重为0.91±0.09g/株，对照组4的单株鲜重为0.95±0.07g/株)；单株干重分别比对照组、对照组3和对照组4高出208.33％、76.19％和94.74(种衣剂B组的植株单株干重为0.37±0.04g/株，对照组的单株干重为0.12±0.01g/株，对照组3的单株干重为0.21±0.02g/株，对照组4的单株干重为0.19±0.01g/株)。以上结果表明中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A丸衣种子和中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B丸衣种子能够提高中苜一号紫花苜蓿的植株单株结瘤数、单株瘤重和根瘤固氮酶活性，以及单株株高、单株鲜重和干重。
表1、丸衣苜蓿种子的结瘤指标的盆栽试验结果
表2、丸衣苜蓿种子的生长指标的盆栽试验结果
实施例2、中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂各组分的优化
本实施例包括如下3个步骤：1、筛选与中苜一号紫花苜蓿共生匹配性最好的苜蓿中华根瘤菌菌株；2、对于第一步筛选出的匹配性最佳的苜蓿中华根瘤菌菌株进行钼耐性试验；3、根据第二步供试菌株耐钼试验确定钼酸铵的浓度，设计不同的苜蓿种子根瘤菌种衣剂，进行苜蓿种子根瘤菌包衣剂的优化。具体实验方法和实验结果如下：
1、筛选与中苜一号紫花苜蓿共生匹配性最好的苜蓿中华根瘤菌菌种
采用水培的方法从苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17537、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17558、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)ACCC17617、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676中筛选中苜一号紫花苜蓿共生匹配性最好的苜蓿中华根瘤菌，具体操作步骤如下：
1)制作滤纸桥：将滤纸裁剪成长条状，宽度为1.3cm，折叠成M型，中间凹处根据幼苗的大小制成V型小孔，M型滤纸的高度为试管的长度减去4cm。
2)制备无菌水培营养液：按水培营养液的配方配置水培液分装入1.8cm×18cm试管中，每管22mL，然后将每管中放入滤纸条，用聚丙烯纤维塑料薄膜封口，121℃下灭菌30min，待用。
3)菌种活化：在斜面培养基上28℃培养48h后,接种到YMA液体培养基中,28℃，150r·min－1转速的摇床中震荡培养48h制成接种菌液。
4)种子的制备：用95％乙醇浸泡中苜一号紫花苜蓿种子5min，再用新洁尔灭表面灭菌5min，然后用无菌水清洗10次。将消毒后的种子播于铺有无菌湿润滤纸的平皿内，封好后置于25℃温箱中保温催芽48h。
5)接种:将催芽成功的种子放入活化的接种菌液中浸泡30min。
6)播种:用无菌镊子将中苜一号紫花苜蓿幼苗小心夹出放入水培液试管的滤纸桥中固定好，并在每个试管内加入2mL接种菌液。封口后于25℃(±1℃)，14h光照/10h黑暗的光照培养箱内培养，培养期间注意及时补充营养液，观察结瘤和生长情况。每株根瘤菌菌株处理重复6次。
7)数据测定：设不接种任何根瘤菌的处理为对照组。通过对中苜一号紫花苜蓿接种5株不同的根瘤菌菌株的结瘤试验，观察、测定各处理组合植株的结瘤部位、单株结瘤率、单株总根瘤数、单株有效根瘤数、单株株高、单株鲜重和单株干重等七项指标。筛选出根瘤菌与苜蓿品种的较优组合，为生产高效根瘤菌种衣剂奠定基础。
通过水培试验，观察生长45天后的植株根系的结瘤情况发现，结瘤部位主要集中在侧根部位，主根上也有少量生长，且主侧根上所结根瘤为浅粉色时为有效瘤。从表3可以看出，接种根瘤菌能够显著提高苜蓿的结瘤能力，且接种不同根瘤菌菌株后苜蓿结瘤效果存在差异。结瘤株数与调查株数之比为结瘤率。在中苜一号紫花苜蓿与5株苜蓿中华根瘤菌菌株接种的组合中，接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)ACCC17631和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的中苜一号紫花苜蓿的结瘤率都是100％，而接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)ACCC17558的中苜一号紫花苜蓿的结瘤率只有33.33％。接种苜蓿中华根瘤菌之后，中苜一号紫花苜蓿的总根瘤数和有效根瘤数均比对照组有所增加，其中以接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的中苜一号紫花苜蓿植株单株总根瘤数和单株有效根瘤数增加最显著，二者单株总根瘤数分别比对照组增加了620％和580％(接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的中苜一号紫花苜蓿植株单株总根瘤数为36个/株，接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的中苜一号紫花苜蓿植株单株总根瘤数为34个/株，对照组的单株总根瘤菌数为5个/株)；单株有效根瘤数比对照组增加了2600％和3100％(接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的中苜一号紫花苜蓿植株单株有效根瘤数为27个/株，接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的中苜一号紫花苜蓿植株单株有效根瘤数为32个/株，对照组的单株有效根瘤数为1个/株)。接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17537的中苜一号紫花苜蓿的单株总根瘤数和单株有效根瘤数分别比对照组增加了440％和2100％(接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17537的中苜一号紫花苜蓿的单株总根瘤数为27个/株，单株有效根瘤数为22个/株，对照组的单株总根瘤菌数为5个/株，对照组的单株有效根瘤数为1个/株)。由此可知，同一苜蓿品种接种不同根瘤菌菌株其结瘤效果不同，说明根瘤菌与苜蓿品种之间的结瘤存在选择性。
表3、中苜一号紫花苜蓿接种不同根瘤菌结瘤效果的比较
中苜一号紫花苜蓿接种不同根瘤菌水培生长45天后，单株株高、单株鲜重和单株干重与对照组相比均有所增加，而且增长率存在差异。从表4中可以看出，中苜一号紫花苜蓿与5株苜蓿中华根瘤菌菌株进行接种后，单株株高与对照组相比，增长最显著的是接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的苜蓿植株，株高增长率为181.34％，接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的株高增长率仅次于接种苜蓿中华根瘤菌ACCC17676的苜蓿植株，株高增长率为48.39％,而接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17558的苜蓿植株株高与对照组无显著差异(接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的中苜一号紫花苜蓿的单株株高为7.267cm/株，接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的中苜一号紫花苜蓿的单株株高为3.833cm/株，接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17558的中苜一号紫花苜蓿的单株株高为2.700cm/株，对照组的单株株高为2.583cm/株)。表4中接种不同苜蓿中华根瘤菌的中苜一号紫花苜蓿单株鲜重与对照组相比普遍提高，增长率的范围为31.58％～219.29％。其中接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676后对中苜一号紫花苜蓿单株鲜重的影响最大，比对照组增加了219.29％，接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)ACCC17631和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17537对中苜一号紫花苜蓿单株鲜重的影响次之，分别比对照组增加了91.23％和85.96％(接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的中苜一号紫花苜蓿单株鲜重为0.182g/株，接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631的中苜一号紫花苜蓿单株鲜重为0.109g/株，苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17537的中苜一号紫花苜蓿单株鲜重为0.106g/株，对照组单株鲜重为0.057g/株)。表4中接种不同苜蓿中华根瘤菌的中苜一号紫花苜蓿单株干重与对照组相比增长率也存在差异，接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676对中苜一号紫花苜蓿单株干重影响与其对单株株高和单株鲜重的影响一致，比对照组增加了465.08％，显著高于接种其它苜蓿中华根瘤菌后单株干重的增长率(接种苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的中苜一号紫花苜蓿单株干重为0.0356g/株，对照组单株干重为0.0063g/株)。在中苜一号紫花苜蓿与5株苜蓿中华根瘤菌菌株接种的组合中，不同组合在单株株高、单株鲜重及干重相对于对照组的增加率中均表现出差异，说明根瘤菌和苜蓿品种之间存在共生匹配的现象。根据接种5株苜蓿中华根瘤菌后植株各项生长指标的综合分析得出苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631与中苜一号紫花苜蓿的共生匹配性最优，因此选择苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676与苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631作为进一步苜蓿种子根瘤菌种衣试验的供试菌株。
表4中苜一号紫花苜蓿接种不同根瘤菌生长指标的比较
2、供试菌株的钼耐性试验
以筛选出的2株与中苜一号紫花苜蓿匹配性最佳的苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676作为供试菌株进行钼耐性试验(其中“钼”代表钼酸铵)。
YMA固体培养基:甘露醇10g，K2HPO4 0.25g，KH2PO4 0.25g，MgSO4·7H2O 0.2g，酵母粉0.8g，NaCl 0.1g，琼脂18-20g，蒸馏水1000mL，pH 6.8-7.0。
向YMA固体培养基中加入钼酸铵，使钼酸铵的终浓度为0.1g/100mL，得到0.1％钼酸铵培养基；向YMA固体培养基中加入钼酸铵，使钼酸铵的终浓度为0.2g/100mL，得到0.2％钼酸铵培养基；向YMA固体培养基中加入钼酸铵，使钼酸铵的终浓度为0.3g/100mL，得到0.3％钼酸铵培养基；向YMA固体培养基中加入钼酸铵，使钼酸铵的终浓度为0.4g/100mL，得到0.4％钼酸铵培养基；向YMA固体培养基中加入钼酸铵，使钼酸铵的终浓度为0.5g/100mL，得到0.5％钼酸铵培养基。
将培养48h的供试菌株用9mL无菌水刮洗，吸取0.1mL稀释倍数为1×106的稀释菌液，分别加入上述六种钼酸铵培养基进行均匀涂布接种，每组接种三皿，28℃恒温培养24h、48h和72h并进行观察记录，以不含钼酸铵的YMA固体培养基培养的菌落作为对照。本研究使用的两株供试菌株的耐钼测定结果见表5，不同的苜蓿中华根瘤菌对钼的耐受能力不同。钼酸铵浓度为0.4％时供试苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631受到较强的抑制；钼酸铵浓度为0.3％时供试苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676受到较强的抑制，实验说明钼酸铵浓度过高会对根瘤菌的产生较大的影响，并且苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)ACCC17631耐钼酸铵的能力略强于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)ACCC17676。在进行进一步试验时，苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)ACCC17631的根瘤菌剂中钼酸铵的浓度可为0.1％、0.2％和0.3％；在苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676的根瘤菌剂中钼酸铵的浓度可为0.05％、0.1％和0.2％。
表5、钼酸铵对供试菌株生长的影响
注：+++++表示生长好，++++表示生长较好，+++表示生长一般，++表示生长较差，+表示生长差，-表示不生长。统计钼酸铵对供试菌株ACCC17631生长的影响时p<0.01，统计钼酸铵对菌株ACCC17676生长的影响时p<0.05。
3、根瘤菌种衣剂配方筛选拟研制“根瘤菌+Mo”菌肥
供试菌株分别为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676。根据供试菌株耐钼试验确定钼酸铵的浓度，并在种子包衣过程中选择不同的粘着剂以及是否加入脱脂乳，共设计24种中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂配方，具体配方见表6，表6中Mo 0％、Mo 0.05％、Mo 0.1％、Mo 0.2％和Mo 0.3％表示根瘤菌剂中钼酸铵的质量百分含量分别为0％、0.05％、0.1％、0.2％和0.3％。所述24种试验配方为下述编号为A1-A12及B1-B12的配方:
A1为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵替换为相同质量的水，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A2为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵替换为相同质量的水，将40mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠替换为40mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A3为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵替换为相同质量的水，将40mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠替换为40mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A4为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.1％，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.1％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A5为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.1％，将40mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠替换为40mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.1％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A6为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.1％，将40mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠替换为40mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.1％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A7为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.2％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A8为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的40mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠替换为40mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.2％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A9为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的40mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠替换为40mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.2％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A10为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.3％，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.3％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A11为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.3％，将40mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠替换为40mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.3％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；A12为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A中的根瘤菌吸附剂A中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.3％，将40mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠替换为40mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.3％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；
B1为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵替换为相同质量的水，将50mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠替换为50mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；B2为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵替换为相同质量的水，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；B3为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵替换为相同质量的水，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；B4为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.05％，将50mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠替换为50mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.05％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；B5为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.05％，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.05％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；B6为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.05％，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.05％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；B7为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中50mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠替换为50mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠,将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.1％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；B8为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.1％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；B9即为实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B；B10为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.2％，将50mL浓度为4％(4g/100mL)的海藻酸钠替换为50mL浓度为4％(4g/100mL)的羧甲基纤维素钠，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.2％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；B11为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.2％，将脱脂乳去除，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.2％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂；B12为将实施例1中的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B中的根瘤菌吸附剂B中的钼酸铵的质量百分含量替换为0.2％，其余成分保持不变，得到钼酸铵质量百分数为0.2％的紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂。
编号为A1-A12的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂丸衣种子的制备方法同实施例1中中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂A丸衣种子的制备方法，得到中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂编号为A1-A12丸衣种子；编号为B1-B12的中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂丸衣种子的制备方法同实施例1中中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂B丸衣种子的制备方法，得到中苜一号紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂编号为B1-B12丸衣种子。
表6不同根瘤菌种子包衣配方
编号 ACCC17631 编号 ACCC17676
A1 Mo 0％+羧甲基纤维素钠 B1 Mo 0％+羧甲基纤维素钠
A2 Mo 0％+海藻酸钠 B2 Mo 0％+海藻酸钠
A3 Mo 0％+海藻酸钠+脱脂乳 B3 Mo 0％+海藻酸钠+脱脂乳
A4 Mo 0.1％+羧甲基纤维素钠 B4 Mo 0.05％+羧甲基纤维素钠
A5 Mo 0.1％+海藻酸钠 B5 Mo 0.05％+海藻酸钠
A6 Mo 0.1％+海藻酸钠+脱脂乳 B6 Mo 0.05％+海藻酸钠+脱脂乳
A7 Mo 0.2％+羧甲基纤维素钠 B7 Mo 0.1％+羧甲基纤维素钠
A8 Mo 0.2％+海藻酸钠 B8 Mo 0.1％+海藻酸钠
A9 Mo 0.2％+海藻酸钠+脱脂乳 B9 Mo 0.1％+海藻酸钠+脱脂乳
A10 Mo 0.3％+羧甲基纤维素钠 B10 Mo 0.2％+羧甲基纤维素钠
A11 Mo 0.3％+海藻酸钠 B11 Mo 0.2％+海藻酸钠
A12 Mo 0.3％+海藻酸钠+脱脂乳 B12 Mo 0.2％+海藻酸钠+脱脂乳
盆栽播种：采集土样，风干，装入7cm×7cm盆中，加水使土壤含水量达到25-30％。将紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂编号为A1-A12丸衣种子和紫花苜蓿种子根瘤菌种衣剂编号为B1-B12丸衣种子分别均匀播种至盆中，然后覆盖一层薄薄的细土，温室放置。随时观察，及时浇水，保持其土壤湿润。培养45天，观测单株总根瘤数、单株根瘤重、根瘤固氮酶活性、单株株高、单株鲜重、单株干重。实验重复三次，每个处理组9盆。数据均采用SAS version 9.1软件进行方差分析，图1-图4中不同字母间表示差异显著(p<0.05)。
通过盆栽试验，测定中苜一号紫花苜蓿植株单株株高、单株鲜重和单株干重三个生长指标，结果如图1、2所示，不同浓度钼酸铵对两种根瘤菌包衣的植株的单株株高、单株鲜重和单株干重均有显著影响。由图1可知，对接种苜蓿中华根瘤菌ACCC17631的植物而言，当钼酸铵的浓度为0.2％(A7、A8和A9处理)时，植株单株株高、单株鲜重和单株干重均达到最高，单株株高达到42.01cm(A9处理)，单株鲜重达到1.60g(A9处理)，单株干重达到0.30g(A8处理)，均显著优于其它钼酸铵的浓度种衣配方下的植株生长状况。当钼酸铵的浓度超过0.2％(A10、A11和A12处理)时，植株单株株高、单株鲜重和单株干重增长均大幅降低。
由图2可知，对接种苜蓿中华根瘤菌ACCC17676的植物而言，当钼酸铵的浓度达到0.1％时(B7、B8和B9处理)时，植株单株株高、单株鲜重和单株干重均显著高于种衣中添加其它浓度钼酸铵的处理，单株株高达到44.16cm(B8处理)；单株鲜重达到1.59g(B7处理)，单株干重达到0.37g(B8处理)。但当钼酸铵的浓度高于0.1％(B10、B11和B12处理)时，植株的生长受到严重抑制，其植株单株株高、单株鲜重和单株干重均低于未添加钼酸铵的对照组(B1、B2和B3处理)。
另外，无论是接种苜蓿中华根瘤菌ACCC17631或者是苜蓿中华根瘤菌ACCC17676的植株，不同类型的粘着剂对其生长状况均未产生显著影响，且钼酸铵与粘着剂的交互效应也不显著。
不同种衣剂配方处理下植物结瘤结果如图3和图4所示，不同浓度钼酸铵对两种根瘤菌包衣的植株的单株结瘤数、单株瘤重及根瘤固氮酶的活性均有显著影响。种衣剂中不同粘着剂对两种根瘤菌种衣的植株的单株结瘤数和单株瘤重均没有显著影响，且钼酸铵和粘着剂的交互作用对两种根瘤菌包衣的植株的单株结瘤数和单株瘤重影响也不显著；但是种衣剂中不同粘着剂对两种根瘤菌种衣的植株的根瘤固氮酶活性具有显著的影响。由图3可知，对于接种苜蓿中华根瘤菌ACCC17631的植株而言，不同的种衣剂配方下，钼酸铵浓度达到0.2％(A7、A8、A9处理)时，植株的单株结瘤数、单株瘤重和根瘤固氮酶活性均为最高，分别为22.89个/株(A9处理)，0.057g/株(A8处理)和169.95μmol·mL-1·h-1(A9处理)。由图3c可知，无论是选择羧甲基纤维素钠还是海藻酸钠作为种衣剂中的粘着剂对植株根瘤固氮酶的活性均无显著影响，但当在粘着剂中添加脱脂乳后能显著提高固氮酶的活性。当钼酸铵的浓度为0.2％时，添加脱脂乳的处理(A9)的固氮酶活性分别比不加脱脂乳的A7和A8处理高出35.24％和26.21％。当钼酸铵浓度大于0.2％(A10、A11、A12处理)时，接种苜蓿中华根瘤菌ACCC17631植株的单株结瘤数、单株瘤重和根瘤固氮酶活性均显著降低。
由图4可知，对于接种苜蓿中华根瘤菌ACCC17676的植株而言，不同的种衣剂配方下，钼酸铵浓度达到0.1％(B7、B8、B9处理)时，植物的单株结瘤数、单株瘤重和根瘤固氮酶活性均为最高，分别为24个/株(B8处理)、0.045g/株(B9处理)和277.33μmol·mL-1·h--(B9处理)。由图4c可知，无论是选择羧甲基纤维素钠还是海藻酸钠作为种衣剂中的粘着剂对植株根瘤固氮酶的活性均无显著影响，但当在粘着剂中添加脱脂乳后能显著提高固氮酶的活性。当钼酸铵的浓度为0.1％时，添加脱脂乳的处理(B9)的固氮酶活性分别比不加脱脂乳的B7和B8处理分别高出42.17％和38.17％。当钼酸铵的浓度超过0.1％(B10、B11、B12处理)时，接种苜蓿中华根瘤菌ACCC17676的植株的单株结瘤数、单株瘤重和根瘤固氮酶活性均大幅下降。
通过对不同配方的“根瘤菌+Mo”型种衣剂进行筛选，结果表明，在中苜一号紫花苜蓿种子种衣剂中加入适量的钼酸铵，能显著促进植株生长及结瘤固氮，但过量的钼酸铵又会抑制植物豆科植物的固氮酶活性，阻碍植物的固氮作用，最终影响植株的正常生长。另外，不同的粘着剂对根瘤菌的固氮效率也有显著的影响，经研究发现，当在种衣剂配方中加入适量的脱脂乳后，中苜一号紫花苜蓿的根瘤固氮酶活性大幅提高，有效的增强了植株结瘤固氮性能。经过土壤盆栽试验的验证，种衣配方A7、A8、A9及B7、B8、B9的效果较优，显著高于其它配方处理。
经过上述优化配方包衣的中苜一号紫花苜蓿种子长成的植株的单株结瘤数、单株瘤重及根瘤固氮酶活性都显著高于未经包衣的中苜一号紫花苜蓿种子长成的植株。此外，相比未经包衣的中苜一号紫花苜蓿，使用上述优化配方包衣的中苜一号紫花苜蓿的单株株高、单株鲜重和单株干重也有显著提高。上述试验证明优化后获得的苜蓿中华根瘤菌种子种衣剂配方不仅大幅提高中苜一号紫花苜蓿结瘤固氮能力，而且对中苜一号紫花苜蓿具有显著增产效果，具有较高的实用性和可推广性，具有非常广阔的应用前景。

Claims (10)

1.苜蓿种子根瘤菌种衣剂，由含有根瘤菌剂、粘着剂和基质的原料制成，所述根瘤菌剂、所述粘着剂和所述基质这三种组分每种组分均独立包装；所述根瘤菌剂由根瘤菌菌液与根瘤菌吸附剂混匀而成，所述根瘤菌菌液的活性成分是苜蓿中华根瘤菌；所述根瘤菌吸附剂由菌剂载体、碳源、过磷酸钙、石灰、钼酸铵、硼酸和水组成；所述根瘤菌剂中钼酸铵的质量百分含量为0.1％-0.2％；所述根瘤菌剂中，所述根瘤菌菌液与所述根瘤菌吸附剂的配比满足100g所述根瘤菌剂中钼酸铵的含量为(0.1-0.2)g，100g所述根瘤菌剂中所述苜蓿中华根瘤菌的含量为≥5×1011cfu。
2.根据权利要求1所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂，其特征在于：所述根瘤菌吸附剂中所述菌剂载体为草炭，所述碳源为蔗糖，所述根瘤菌吸附剂中菌剂载体、碳源、过磷酸钙、石灰、钼酸铵、硼酸和水的质量比为488.5g菌剂载体：1g碳源：0.5g过磷酸钙：10g石灰：(1-1.5)g钼酸铵：0.005g硼酸：(21-31)g水。
3.根据权利要求1或2所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂，其特征在于：所述原料由所述根瘤菌剂、所述粘着剂和所述基质组成。
4.根据权利要求3所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂，其特征在于：所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂中，所述根瘤菌剂、所述粘着剂和所述基质的质量比满足100：(1.6-2.0):300。
5.根据权利要求1-4中任一所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂，其特征在于：所述原料由所述根瘤菌剂、所述粘着剂、所述基质和脱脂乳组成，所述根瘤菌剂、所述粘着剂、所述基质和所述脱脂乳这四种组分每种组分均独立包装。
6.根据权利要求1-5中任一所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂，其特征在于：所述粘着剂为羧甲基纤维素钠或海藻酸钠，所述基质为膨润土。
7.根据权利要求5或6所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂，其特征在于：所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂中，所述根瘤菌剂、所述粘着剂、所述基质和所述脱脂乳的质量比满足100：(1.6-2.0)：300：(0.02-0.04)。
8.根据权利要求1-7中任一所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂，其特征在于：所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂为A或B：
A、所述苜蓿中华根瘤菌为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17631，所述根瘤菌剂中钼酸铵的质量百分含量为0.2％；
B、所述苜蓿中华根瘤菌为苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)ACCC17676，所述根瘤菌剂中钼酸铵的质量百分含量为0.1％。
9.权利要求1-8中任一所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂的下述1)-6)中的任一种应用：
1)权利要求1-8中任一所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂在制备丸衣苜蓿种子中的应用；
2)权利要求1-8中任一所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂在提高苜蓿产量中的应用；
3)权利要求1-8中任一所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂在提高苜蓿单株根瘤数中的应用；
4)权利要求1-8中任一所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂在提高苜蓿单株根瘤重中的应用；
5)权利要求1-8中任一所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂在提高苜蓿根瘤的固氮酶活性中的应用；
6)权利要求1-8中任一所述苜蓿种子根瘤菌种衣剂在提高苜蓿单株株高中的应用。
10.用权利要求1-8中任一所述的苜蓿种子根瘤菌种衣剂和苜蓿种子制成的丸衣苜蓿种子。
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