CN110484473A - 一种促进鹤羽田戴尔福特菌在植物根际定殖的方法 - Google Patents

一种促进鹤羽田戴尔福特菌在植物根际定殖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进鹤羽田戴尔福特菌在植物根际定殖的方法。本发明提供了粘酸在促进戴尔福特菌在植物根际定殖方面、以及在制备促进戴尔福特菌在植物根际定殖的制剂方面的应用。本发明从植物根系分泌物中筛选出一种促进戴尔福特菌在植物根际定殖的信号分子‑粘酸，研究发现，粘酸对戴尔福特菌有显著的趋化作用和群游作用，能够显著促进戴尔福特菌在植物根际定殖；另外，当粘酸和戴尔福特菌共同作用时，可显著促进戴尔福特菌在植物根际繁殖，植物的总鲜重、总根重、株高叶绿素含量和根系nifH基因丰度显著升高，对植物的促生作用进一步显著增强，具有极好的应用价值和广阔的发展空间。

Description

一种促进鹤羽田戴尔福特菌在植物根际定殖的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种促进鹤羽田戴尔福特菌在植物根际定殖的方法。
背景技术
植物病害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织(FAO)统计，每年因植物遭受病害造成的减产平均损失为总产量的10％～15％。植物病害的损失除导致减产、作物品质降低外，防治病害所用农药还会使农业成本增加并造成环境污染、产生公害等。因此，对植物病害的科学防治始终是农业生产中的一项重要工作。近年来，人们越来越重视使用植物根际促生细菌(PGPR)，由于植物根际促生细菌功能菌株可以进行固氮作用、产生植物生长激素、溶磷和控制植物病害的发生，因而具有减少农业化学物质施用量、保持生物多样性的应用潜力。
植物内生细菌(Endophytic Bacteria)是指能在健康植物组织内栖居并能使植物获益的细菌，通过固氮作用促进植物生长或诱导植物抗病性等，与植物建立了和谐联合关系的微生物。鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)是植物内生细菌的一种，它被认为具有固氮活性、并可以拮抗多种植物病原菌，它能同时拮抗14株植物病原菌，对水稻三大病害病原菌和一些蔬菜病原菌都表现出了很强的拮抗活性。因此，鹤羽田戴尔福特菌在制备具有生防功能的植物促生菌剂方面有着很大的潜在应用价值。
而植物内生细菌对植物的定殖是否成功，很大程度上取决于它们对植物释放的化学物质刺激的响应。如果不明确细菌定殖于特定宿主的确切机制，那么在实验中展现出良好固氮能力及植物病原菌拮抗性的鹤羽田戴尔福特菌，可能就无法在实际种植中显著增加植物的氮含量、生物量以及发挥拮抗性。因此，为数量不多的高效固氮生防菌找到其根际定殖的信号分子，是其实际推广应用的重要一环。
目前已有研究发现，作为信号分子，黄酮类是吸引根瘤菌到根表并调控其nod基因表达的信号物质；西红柿根释放柠檬酸和富马酸吸引荧光假单胞菌根际定殖；拟南芥根系分泌苹果酸能选择性定殖枯草芽抱杆菌；豆科植物红气叶草能分泌酚类物质，刺激铁载体分泌菌生长，抑制根际中其他微生物生长；西瓜根系分泌的苹梁酸和柠檬酸诱导了多粘类芽抱杆菌在根际定殖；西红柿根系分泌物苹果酸、柠檬酸、玻拍酸、富马酸显著导致解淀粉芽抱杆菌的趋化作用和群游效应。因此，如何为高效固氮生防菌-鹤羽田戴尔福特菌找到促进其根际定殖的信号分子，是制约其推广应用的技术瓶颈。
但是，目前未有任何有关利用粘酸作为信号分子诱导鹤羽田戴尔福特菌在植物根际定殖的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有利用粘酸作为信号分子诱导鹤羽田戴尔福特菌在植物根际定殖的技术空白，提供一种促进鹤羽田戴尔福特菌(Delftiatsuruhatensis)在植物根际定殖的方法。
本发明的第一个目的是提供粘酸在促进戴尔福特菌(Delftia sp.)在植物根际定殖方面的应用。
本发明第二个目的是提供粘酸在促进鹤羽田戴尔福特菌(Delftiatsuruhatensis)在植物根际定殖方面的应用。
本发明第三个目的是提供粘酸在制备促进鹤羽田戴尔福特菌(Delftiatsuruhatensis)在植物根际定殖的制剂方面的应用。
本发明第四个目的是提供一种促进鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)在植物根际定殖的制剂。
本发明第五个目的是提供一种促进鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)在植物根际定殖的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究发现，粘酸对鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)有显著的趋化作用和群游作用；在植物根际添加粘酸后，粘酸会显著诱导鹤羽田戴尔福特菌在植物根际定殖；粘酸和鹤羽田戴尔福特菌有显著的协同增效作用，同时接种鹤羽田戴尔福特菌和在植物根际添加粘酸后，植物的总鲜重、总根重、株高叶绿素含量和根系nifH基因丰度显著升高，对植物的促生作用进一步显著增强。
因此，以下内容均应在本发明的保护范围之内：
粘酸在促进戴尔福特菌(Delftia sp.)在植物根际定殖方面的应用。
粘酸在制备促进戴尔福特菌(Delftia sp.)在植物根际定殖的制剂方面的应用。
优选地，所述戴尔福特菌(Delftia sp.)为鹤羽田戴尔福特菌(Delftiatsuruhatensis)。
更优选地，所述鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)为鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)10492，该菌株已于2012年1月6日保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CICC NO：10492。
所述鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)10492在无氮培养基和固氮培养基中均表现出较强的固氮酶活性，可高效固氮并通过细胞膜氮通道把氨氮外排至发酵液中，接种到植物根际可为其提供氮素并促进植物生长。
本发明还提供了一种促进鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)在植物根际定殖的制剂，所述制剂包含粘酸。
本发明还提供了一种促进鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)在植物根际定殖的方法，在植物根际添加粘酸和/或在能够分泌粘酸的植物的根际接种鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)。
优选地，一种促进鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)在植物根际定殖的方法，在植物根际添加粘酸和在能够分泌粘酸的植物的根际接种鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)。
优选地，所述鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)为鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)10492，该菌株已于2012年1月6日保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CICC NO：10492。
优选地，所述粘酸的浓度为20～40μM。
更优选地，所述粘酸的浓度为30μM。
优选地，所述粘酸的添加量为100～300μL/g根。
更优选地，所述粘酸的添加量为200μL/g根。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种促进鹤羽田戴尔福特菌在植物根际定殖的方法。本发明研究发现，粘酸对戴尔福特菌有显著的趋化作用和群游作用，粘酸能够显著促进戴尔福特菌在植物根际定殖，当粘酸和戴尔福特菌共同作用时，可显著促进戴尔福特菌在植物根际繁殖，植物的总鲜重、总根重、株高叶绿素含量和根系nifH基因丰度显著升高，对植物的促生作用进一步显著增强。因此，粘酸在促进戴尔福特菌在植物根际定殖方面、以及在制备促进戴尔福特菌在植物根际定殖的制剂方面，均具有极好的应用价值和广阔的发展空间。
附图说明
图1是不同根系分泌物中的有机酸对鹤羽田戴尔福特菌10492的趋化作用影响结果图；其中，不同字母代表单因素方差分析存在显著差异(p＜0.05)。
图2是不同根系分泌物中的有机酸对鹤羽田戴尔福特菌10492的群游作用影响结果图；其中，不同字母代表单因素方差分析存在显著差异(p＜0.05)。
图3是粘酸对鹤羽田戴尔福特菌10492在土培盆栽全红苋菜根的定殖作用的影响结果图；其中，不同字母代表单因素方差分析存在显著差异(p＜0.05)。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下用已公开保藏的鹤羽田戴尔福特菌10492为具体的菌株，研究粘酸对鹤羽田戴尔福特菌在植物根际定殖的影响。
所述鹤羽田戴尔福特菌10492已于2012年1月6日保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CICC NO：10492，保藏地址为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼。所述鹤羽田戴尔福特菌10492在无氮培养基和固氮培养基中均表现出较强的固氮酶活性，可高效固氮并通过细胞膜氮通道把氨氮外排至发酵液中，接种到植物根际可为其提供氮素并促进植物生长。
实施例1 不同根系分泌物中的有机酸对鹤羽田戴尔福特菌10492的趋化作用
本发明在前期研究的基础上，选取10种有机酸(L-奎尼酸、D-果糖、D-苹果酸、L-丙氨酸、D-半乳糖醛酸、L-乳酸、丙酸、粘酸、3-羟基丁酸和L-谷氨酸)，研究其对鹤羽田戴尔福特菌的趋化作用，具体的实验方法和实验结果如下：
1、实验方法
用移液器吸取100μL的鹤羽田戴尔福特菌10492菌液，用注射器吸取200μL浓度为30μm/L的有机酸溶液，设置无菌水为空白对照。将注射器插入移液器枪头后，静置于超净台2h，取出注射器中的有机酸溶液并用无菌水稀释10、102、103、104、105、106倍，涂布至LB培养基，设置3个平行，放置于生化培养箱中，28℃培养2d后，计算3个平行的平均值，并将其作为每个处理对鹤羽田戴尔福特菌趋化作用的影响。
2、实验结果
不同根系分泌物中的有机酸对鹤羽田戴尔福特菌10492的趋化作用影响结果如图1所示，可以看出，10种有机酸吸引的菌落数均高于对照组，对鹤羽田戴尔福特菌10492均呈正趋化作用；其中，L-奎尼酸、D-苹果酸、D-半乳糖醛酸、L-乳酸、粘酸、3-羟基丁酸和L-谷氨酸吸引的菌落数均显著高于对照组，粘酸吸引的菌落数是对照组的5.3倍；因此，粘酸对鹤羽田戴尔福特菌的趋化作用最强。
实施例2 不同根系分泌物中的有机酸对鹤羽田戴尔福特菌10492的群游作用
本发明选取12种有机酸(L-苹果酸、乙酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、D-葡萄糖酸、丙酸、D-奎尼酸、L-精氨酸、酒石酸、α-酮戊二酸、L-焦谷氨酸和粘酸)，研究其对鹤羽田戴尔福特菌的群游作用，具体的实验方法和实验结果如下：
1、实验方法
配制含30μm/L有机酸(空白对照为无菌水)的LB固体培养基，放置8mm的无菌滤纸片于固体培养的中心，并吸取5μL鹤羽田戴尔福特菌10492的菌悬液于滤纸片中央。设置3个平行，放置于生化培养箱中于28℃培养4d后，从3个不同方向测量直径，计算3个平行的平均值，并将其作为每个处理对鹤羽田戴尔福特菌群游作用的影响。
2、实验结果
不同根系分泌物中的有机酸对鹤羽田戴尔福特菌10492的群游作用影响结果如图2所示，可以看出，与对照组相比，在12种有机酸诱导下的鹤羽田戴尔福特菌10492的群游直径均增大；其中，在L-苹果酸、乙酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、丙酸、D-奎尼酸、L-精氨酸、酒石酸、α-酮戊二酸和粘酸诱导下，鹤羽田戴尔福特菌10492的群游直径显著增大，在粘酸诱导下的鹤羽田戴尔福特菌10492的群游直径是对照组的1.3倍；因此，粘酸对鹤羽田戴尔福特菌的群游作用最强。
实施例3 粘酸对鹤羽田戴尔福特菌10492在全红苋菜根的定殖作用的影响
根据实施例1和2的结果，将对鹤羽田戴尔福特菌10492具有最强趋化作用和群游作用的粘酸、以及趋化作用和群游作用次之的苹果酸进行体外诱导实验，具体的实验方法和实验结果如下：
1、实验方法
配制l/4浓度的全霍格兰营养液，每个组培瓶加入50mL霍格兰营养液与1％的琼脂制成固体培养基。将全红苋菜种子用2％次氯酸钠溶液浸泡30min，放置于组培瓶中心处，培养2d。待长出嫩叶后，吸取10μL鹤羽田戴尔福特菌10492的菌液于距植物根部2mm处，并分别添加20μL浓度为30μm/L粘酸溶液、30μm/L苹果酸溶液(空白对照为无菌水)在植物根表面处，培养2周后，收集全红苋菜，剪掉根部，用无菌水洗涤根组织表面，称重，放入离心管中并加入1mL无菌水于组织破碎仪中涡旋5min，用无菌水稀释10、102、103、104、105、106倍，涂布至LB培养基，设置3个平行，后放置于生化培养箱中，28℃培养4d，计算3个平行的平均值，并将其作为每个处理对鹤羽田戴尔福特菌10492在全红苋菜根的定殖作用的影响。
2、实验结果
粘酸对鹤羽田戴尔福特菌10492在全红苋菜根的定殖作用的影响结果如图3所示，可以看出，在全红苋菜根际添加粘酸后，全红苋菜根的菌落数平均值高达6.3×107CFUs·groot-1，其菌落数是对照组的2.2倍，显著高于添加苹果酸或对照组的菌落数；说明粘酸显著诱导鹤羽田戴尔福特菌在全红苋菜根的定殖作用。
实施例4 添加粘酸和接种鹤羽田戴尔福特菌10492对土培盆栽全红苋菜的促生效果
1、实验方法
选取华南地区常见蔬菜全红苋菜作为供试作物，盆栽实验在广州番禺区某校温室进行，土壤理化性质：全磷3.164mg/kg、速效磷2.538mg/kg，速效钾66.099mg/kg、全钾2567.387mg/kg。全红苋菜种子育苗后，取8颗长势相近的幼苗移栽到盆栽中，设置对照组(AC)、接种鹤羽田戴尔福特菌10492组(AD)、添加粘酸后接种鹤羽田戴尔福特菌10492组(D+S)三种处理。在移苗后的5d、10d、15d和30d接种鹤羽田戴尔福特菌10492，每次接种量为5mL(CFUs/mL＞109)；在盆栽中全红苋菜根系滴加粘酸(30μM)。45d后测定植物的各项理化指标，nifH基因控制固氮酶铁蛋白的合成，其丰度可作为固氮活性的重要指标，故采用qPCR法测定全红苋菜的根系的nifH基因丰度。
2、实验结果
添加粘酸和接种鹤羽田戴尔福特菌10492对土培盆栽全红苋菜的促生效果测定结果如表1所示，可以看出，与对照组相比，AD组即全红苋菜接种鹤羽田戴尔福特菌10492后，全红苋菜的总鲜重、总根重、株高叶绿素含量和根系nifH基因丰度均显著升高；AD+S组即全红苋菜接种鹤羽田戴尔福特菌10492同时在全红苋菜根系滴加粘酸后，与AD组相比，全红苋菜的总鲜重、总根重、株高叶绿素含量和根系nifH基因丰度均进一步显著升高；说明接种鹤羽田戴尔福特菌10492对全红苋菜有显著的促生作用。进一步地，接种鹤羽田戴尔福特菌10492同时外源添加信号分子粘酸后，对全红苋菜的促生作用进一步显著增强；说明粘酸能促进鹤羽田戴尔福特菌在植物根部的定殖，粘酸和鹤羽田戴尔福特菌有显著的协同增效作用。
表1添加粘酸和接种鹤羽田戴尔福特菌10492对全红苋菜的促生效果测定结果
注：不同字母代表单因素方差分析存在显著差异(p＜0.05)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.粘酸在促进戴尔福特菌(Delftia sp.)在植物根际定殖方面的应用。
2.粘酸在制备促进戴尔福特菌(Delftia sp.)在植物根际定殖的制剂方面的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述戴尔福特菌(Delftia sp.)为鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述鹤羽田戴尔福特菌(Delftiatsuruhatensis)为鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)10492，该菌株已于2012年1月6日保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CICC NO：10492。
5.一种促进鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)在植物根际定殖的制剂，其特征在于，所述制剂包含粘酸。
6.一种促进鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)在植物根际定殖的方法，其特征在于，在植物根际添加粘酸和/或在能够分泌粘酸的植物的根际接种鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述粘酸的浓度为20～40μM。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述粘酸的添加量为100～300μL/g根。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述鹤羽田戴尔福特菌(Delftiatsuruhatensis)为鹤羽田戴尔福特菌(Delftia tsuruhatensis)10492，该菌株已于2012年1月6日保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CICC NO：10492。
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