CN101984067A

CN101984067A - 一种检测植物根际促生菌促生效果的方法

Info

Publication number: CN101984067A
Application number: CN 201010511686
Authority: CN
Inventors: 郭岩彬; 吴文良; 位婉; 孟凡乔; 周华宁; 焦子伟
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: ZHANGJIAKOU GENLIDUO ECOLOGICAL AGRICULTURAL TECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2010-10-19
Filing date: 2010-10-19
Publication date: 2011-03-09
Anticipated expiration: 2030-10-19
Also published as: CN101984067B

Abstract

本发明提供了一种快速检测植物促生效果的方法，包括如下步骤：1)制备根际促生菌的菌液，将催芽后的种子置于菌液中浸泡2～4个小时；2)将步骤1)中的浸泡过菌液的种子放入用菌液浸湿的双层滤纸中间，将滤纸包裹成筒状放入盛有营养液的试管中；3)在放入人工气候箱培养3～4天，测量茎长、根长和干鲜重。该方法可以应用与植物促生菌的快速筛选，植物促生物质促生效果快速测定等，将植物促生菌的筛选工作由温室的一个月时间缩减到一周，对新型生物菌肥的研究与产业发展具有重要作用。

Description

一种检测植物根际促生菌促生效果的方法

技术领域

本发明涉及一种检测植物根际促生菌促生效果的方法。

背景技术

植物根际促生菌(Plant growth-promoting Rhizobacteria，PGPR)泛指存在于植物根际，叶围或与植物关系密切的其他生境中的，所有能促进植物生长的细菌。PGPR菌主要是通过和植物根系间的相互作用关系来改变土壤和植物体的微生态环境，从而达到促进植物生长的目的，其作用机制主要分为以下三种：一是直接给植物提供植物激素等促生物质(如IAA，嗜铁素，溶磷物质)和固氮作用，增强植物对营养物质的吸收利用；二是通过与根际病原菌抢占生态位点，竞争营养物质，来达到抑菌的效果；三是诱导植物的生理生化变化和抗病性等。同时，PGPR在根际的定殖一定程度上促进了菌根真菌的生长；对受污染的土壤也有一定的生物修复功能。

自从二十世纪七十年代末，Kloepper和coworkers第一次使用PGPR这个术语以来，对于PGPR的研究以一种飞快的速率增加着，发展到如今已成为国际上的热门课题。由于化肥、农药对环境造成严重污染，化肥生产成本高涨、能源紧缺，澳大利亚、加拿大、美国、欧共体组织和日本等国，都开展了PGPR的专项研究。并且，已在促进植物生长、增加作物产量，生物防治，生物修复方面积累了大量的材料。枯草芽孢杆菌Ar13是最早成功应用和商业化生产的PGPR，用Ar13处理种子，可以提高胡萝卜产量48％，燕麦产量33％和花生产量37％。中国科学院沈阳应用生态研究所研究的PGPR——海洋放线菌MB297于2000年获得农业部产品认证并开始商品化生产与销售，在重茬大豆上应用已达2.0×10⁴hm²，增产15％左右。这表明PGPR研究已成为当前农业微生物研究的热点之一，PGPR制剂的广泛应用对农业生产的发展和环境保护具有重大的经济和生态价值。

PGPR广泛存在于多种植物根际中，其发挥作用的前提是与植物间建立一种密切的互作关系。因此，在研究非生防PGPR和植物间互作关系的实验中，从大量的微生物菌株中筛选获得优良促生性状的菌株是工作基础，需要做大量的筛选工作，如何在短时间内筛选获得促生效果极佳的促生菌株是科研单位和企业面临的难题之一。现有的植物促生检测方法可分为短期的实验室检测，温室检测和长期的大田检测两个阶段进行。短期检测方法因为快捷，影响因素少往往是实验中首先选用的检测手段。通常采用无土栽培，大体分为以下五种方式：(1)幼苗生长法。挑选大小一致的植物种子分别播入铺有两层滤纸/蛭石/纱布的培养皿中，加入适宜浓度的菌液/药剂，在人工气候箱在培养一周后测定茎长，根长，干鲜重。(2)萝卜/黄瓜子叶扩张法。萝卜/黄瓜种子催芽后，挑选大小一致的子叶放入铺有两层滤纸的培养皿中，加入适宜浓度的菌液/试剂，用人工气候箱培育，测定子叶鲜重。(3)黄瓜子叶生根法。黄瓜种子催芽并光照培养3天后，挑选大小一致的子叶放入铺有两层滤纸/蛭石/纱布的培养皿中，加入适宜浓度的菌液/药剂，人工气候箱培养，测定每对子叶的生根数量。(4)绿豆下胚轴生根法。将绿豆种子催芽后，光照培养10d，挑选生长整齐的绿豆幼苗，在子叶节下3cm处切去下胚轴和主根，将带有子叶和3cm长的下胚轴的幼苗切段放入装有适宜浓度的菌液/试剂的小瓶中，在人工气候箱中培养，观察根的生长状况并测定每株生根数。(5)沙培。将植物种子催芽后，种到装有无菌沙的试管或培养皿中，再浇入适宜浓度的菌液/试剂以接种，在人工气候箱中培养1-2周测量植株茎长，根长。(6)水培。将植物种子催芽，育苗后，放入装有营养液的专门容器和培养室中进行培养，观察整株植物的生长状况，测定茎长，根长，干鲜重等。其中，方法(2)，(3)，(4)检测数据太少，培养时间太长。方法(1)和(5)是现在比较常用的两种检测方式，但方法(1)中的根在培养皿中不能直立伸长，影响根系的测量和观察效果。用方法(5)可以完整的取到植物的茎和根，利于观察和测量；但取根操作麻烦，并且期间需要浇水，会影响到菌在植物根部的定殖。如果采用(6)水培，则菌不易定殖在植物根系上，不能说明菌和植物间的关系，且成本较高。

发明内容

本发明目的是提供一种快速，高效检测植物根际促生菌(PGPR)促生效果的方法。弥补传统短期检测方法中的不足，以缩短整体实验的时间，提高促生菌株筛选效率。

本发明提供的快速检测植物根际促生菌促生效果的方法，包括如下步骤：

1)制备根际促生菌的菌液，将催芽后的种子置于菌液中浸泡2～4个小时；

2)将步骤1)中浸泡过菌液的种子放入用菌液浸湿的双层滤纸中间，将滤纸包裹成筒状放入盛有营养液的试管中；

3)再放入人工气候箱培养3～4天，测量茎长、根长和干鲜重。

其中，所述的制备的根际促生菌菌液浓度为10⁷～10⁸CFU/ml，优选为10⁷CFU/ml。

其中，将催芽后的种子置于菌液中浸泡的时间优选为3小时。

其中，放入滤纸中的种子优选的数量为3～4颗。

其中，所述的营养液的用量优选为试管体积的1/3，优选的营养液为Hoagland营养液，

所述种子优选为作物种子，更为优选的是绿豆、玉米、小麦。

其中，所述步骤3)放入人工气候箱内培养的时间优选为4天。

按照本发明中的方法检测PGPR菌CNA9和MOB 13对绿豆的促生效果，实验室结果显示，茎长比清水对照分别伸长了19.67％和18.62％，根长分别伸长了38.91％和43.61％。

按照本发明的方法将CNA9菌株接种到玉米植株上，避光培养4天后，其根长和干重，鲜重分别增加了15.4％，28.8％和21.5％。

通过温室培养的方式接种CAN9菌株，玉米在根长和干重，鲜重分别增加了16.6％，32.9％和32.5％。

试管苗实验和温室实验的促生效果基本一致，证明本方法可以替代温室促生效果测定，而且本发明的方法能大大节省时间和降低材料成本，提高了促生菌的筛选效率。

附图说明

图1为不同接种方式对绿豆促生效果的影响。

图2为系列浓度梯度菌液对绿豆促生效果的影响。

图3为不同培养时间对绿豆根长的影响。

图4为不同培养时间对绿豆茎长的影响。

图5为不同菌液摇培时间对绿豆促生效果的影响。

图6为两种菌株的短期促生效果。

图7为温室实验中菌株对玉米植株的促生效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1材料与设备

供试植物：绿豆(绿珍珠，购自山西博大种苗有限公司)；玉米(农大108)，可市售获得。

供试菌株：CNA9(Arthrobacter globiformis)，CGMCC No.4217，MOB13(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，CGMCC No.2763。

供试药剂：70％酒精；Solution I：10mM磷酸；Solution II：1mL0.5M FeCl₃溶于50mL 35％HClO₄

供试培养基：LB液体培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，(琼脂15.0g/L)，

蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2。121℃高压灭菌30min

供试材料：滤纸，大试管，试管架，人工气候箱，手提式压力蒸汽消毒器，生化培养箱，电子天平，数码相机，超净工作台，离心机，紫外与可见光分光光度计。

实施例2

选取健全的绿豆种子，浸入70％酒精中消毒30s，用无菌水冲洗3遍，将种子用两层纱布包好放入大培养皿中，清水浸湿，使纱布表面形成一层水膜。放入28℃培养箱中，培养18h左右待种子露白。将CNA9菌株平板划线活化后，接种到LB培养基中摇培3天，将菌液浓度调整到10⁷CFU/mL。

将发芽的种子进行如下浸种，浸纸，浸种+浸纸三种方式处理，并以清水处理作为对照。

1)选取露白程度一致的绿豆种子若干，放入菌液中浸种3小时。将20cm×30cm的双层滤纸卷成筒状，插入装有菌液的大试管中，待菌液将滤纸完全浸湿。将浸种后的绿豆种子放入浸纸后的两层滤纸之间，再将滤纸卷回筒状，插到装有1/3体积Hoagland营养液的大试管中，每个试管卷入3颗种子，每组3管重复。放入人工气候箱内培养(26℃，相对湿度为80％)。

2)选取露白程度一致的绿豆种子若干，放入菌液中浸种3小时。将20cm×30cm的双层滤纸卷成筒状，插入装有清水的大试管中，待菌液将滤纸完全浸湿。将浸种后的绿豆种子放入浸纸后的两层滤纸之间，再将滤纸卷回筒状，插到装有1/3体积Hoagland营养液的大试管中，每个试管卷入3颗种子，每组3管重复。

3)选取露白程度一致的绿豆种子若干，放入清水浸种3小时。将20cm×30cm的双层滤纸卷成筒状，插入装有菌液的大试管中，待菌液将滤纸完全浸湿。将浸种后的绿豆种子放入浸纸后的两层滤纸之间，再将滤纸卷回筒状，插到装有1/3体积Hoagland营养液的大试管中，每个试管卷入3颗种子，每组3管重复。

4)选取露白程度一致的绿豆种子若干，放入清水浸种3小时。将20cm×30cm的双层滤纸卷成筒状，插入装有清水的大试管中，待菌液将滤纸完全浸湿。将浸种后的绿豆种子放入浸纸后的两层滤纸之间，再将滤纸卷回筒状，插到装有1/3体积Hoagland营养液的大试管中，每个试管卷入3颗种子，每组3管重复。

将接种好的试管苗放入人工气候箱内避光培养4天(26℃，相对湿度为80％)。收获后，测量茎高，根长，通过变异系数来比较不同接种方法的精密度。

结果如图1和表1所示，用浸种和浸纸结合的方法处理绿豆，数据的变异系数最小，表示这一处理下各个数据变异程度最小，试验精密度高。所以选择浸种+浸纸的接种方式。

表1不同接种方式对绿豆促生效果的影响

实施例3

将摇培3天后的CNA9菌液稀释到10¹⁰，10⁹，10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹CFU/mL共10个浓度梯度，同时设清水做空白对照。按浸种和浸纸的方式将发芽的绿豆种子接种上不同浓度的菌液(方法同实施例2)。放入人工气候箱内避光培养4天(26℃，相对湿度为80％)。收获后，测量茎高，根长。结果如图2和表2所示。

结果表明，在高浓度菌液中，绿豆植株在的茎长和根长都表现出抑制效果，而10⁷～10⁸CFU/mL浓度菌液对绿豆茎长和根长促进作用最显著，其中最适接种浓度为10⁷CFU/mL。

表2系列浓度梯度菌液对绿豆促生效果的影响

注：^a：6次重复之间的标准误差

实施例4

将CNA9菌株活化，摇培3天后，采用实施例2确定的浸种和浸纸结合的接种方式和实施例3确定的10⁷CFU/mL菌液浓度进行接种，分别在人工气候箱内避光培养(26℃，相对湿度为80％)3天，4天，5天。为保证各个处理间差异最小，所有培养天数不同的试管苗在同一天收获，测量茎高，根长。

结果如图3、图4所示，培养时间越长(如第5天)，菌液对绿豆茎长的促生效果越明显；而菌液对绿豆根长的促生效果是在最初的第3天最显著，随培养时间的增加效果不明显。考虑到在效果明显的基础上尽量缩短培养天数，所以选择4天是最适培养时间。

实施例5

将CNA9菌株活化后接种到LB培养基中，分别摇培1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天后，将不同摇培天数下的菌液统一稀释到10⁷CFU/mL，并采用浸种和浸纸结合(实施例2)的方式接种，并在人工气候箱中避光培养4天(26℃，相对湿度为80％)。收获后，测量茎高，根长。为保证各个处理间差异最小，所有摇培天数不同的菌株在同一天接种。

结果如图5和表3所示，摇培3，4，5天后的菌液促生效果最好，其他摇培天数下的菌液可能由于促生物质代谢量少或者产生其他抑生物质等因素达不到促生效果。为尽量缩短摇培时间，所以选择摇培3天为最适摇培时间。

表3不同菌液摇培时间对绿豆促生效果的影响

实施例6

通过以上实验将菌液的摇培时间，菌液浓度，接种方式和培养时间四个条件进行摸索后，该发明方法中的主要参数都已确定：菌种活化后在LB培养基中摇培3天；将菌液浓度稀释到10⁷CFU/mL；该浓度菌液通过同时浸纸和浸种的方式进行接种；接种后的绿豆在人工气候箱(26℃，相对湿度为80％)中避光培养4天。

用该发明方法对CNA9和MOB13两个菌株进行实验室内短期促生效果检测。将两株菌株分别接种到绿豆，观察其促生效果。

绿豆的促生效果结果如图6和表4所示，绿豆的茎长和根长都有显著的增长效果，茎长分别比对照增加了19.67％，18.62％，根长分别增加了38.91％，43.61％。

按该方法将CNA9菌株接种到玉米植株上，避光培养4天后，其根长和干重，鲜重分别增加了15.4％，28.8％和21.5％；MOB13接种到玉米植株上，其根长和干重，鲜重分别增加了12.3％，22.7％和19.5％通过以上检测结果显示，该方法可适用于不同的菌株，不同植物。

表4两种菌株的短期促生效果

实施例7

将玉米种子催芽到露白，选取发芽一致的种子备用。将CNA9和MOB13菌株摇培3天，取10⁷CFU/mL菌液拌到灭菌沙中，每盆装6kg灭菌沙，同时设清水对照。共三组处理，每组处理10个重复。温室培养，隔天浇水，一个周后每周浇一次Hoagland营养液，待四个周后收获植株，测量其株高，根长，干鲜重。

如图7和表5中结果所示，接种CNA9的玉米植株茎长和接种两种菌株的地上部分和地下部分干鲜重都比对照有明显的增加。

表5温室实验中菌株对玉米植株的促生效果

两次试验中的结果基本相符，说明用该发明方法在短期内可达到温室长期培养的效果，即可替代温室检测方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种检测植物根际促生菌促生效果的方法，包括如下步骤：

3)再放入人工气候箱培养3～4天，测量茎长、根长和干鲜重。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的根际促生菌菌液浓度为10⁷～10⁸CFU/ml。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的根际促生菌菌液浓度为10⁷CFU/ml。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述的种子在菌液中浸泡的时间为3小时。

5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述的放入滤纸中的种子为3～4颗。

6.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述的营养液的用量为试管体积的1/3。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的营养液为Hoagland营养液。

8.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述的人工气候箱内培养的时间为4天。

9.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述的种子为作物种子。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的种子选自绿豆、玉米、小麦。