CN107926549B - 一种利用印度梨形孢提高作物对除草剂苄嘧磺隆抗性的方法 - Google Patents

一种利用印度梨形孢提高作物对除草剂苄嘧磺隆抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了印度梨形孢(Piriformospora indica)在提高作物对除草剂苄嘧磺隆抗性中的应用，属于作物种植技术领域。印度梨形孢不受苄嘧磺隆抑制，建立的印度梨形孢‑作物共培养体系，可以显著提高作物对苄嘧磺隆的抗性，减少药害；印度梨形孢作为有益的内生真菌，定殖作物后，不产生副作用，同时确保对环境的安全性。所述作物为水稻、油菜、向日葵、烟草、小麦、玉米。本发明还提供了一种提高水稻对除草剂苄嘧磺隆抗性的方法，包括将水稻幼苗置于含有印度梨形孢的水稻培养液中共培养，获得定殖有印度梨形孢的水稻幼苗，再将定殖有印度梨形孢的水稻幼苗移栽至大田，培育至收获。

Description

一种利用印度梨形孢提高作物对除草剂苄嘧磺隆抗性的方法
技术领域
本发明涉及作物种植技术领域，具体涉及一种利用印度梨形孢提高作物对除草剂苄嘧磺隆抗性中的方法。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，稻田杂草是造成水稻减产的主要因素，除草剂的应用在保证粮食增产和稳产中起到了重要的作用，是目前世界范围内采取最为普遍的除草方式。
苄嘧磺隆(Bensulfuron-methyl,BSM；商品名：农得时)是由美国杜邦公司开发的选择性内吸传导型磺酰脲类除草剂，是目前被认为药效强、低毒、环境安全的稻田磺酰脲类除草剂，在世界各地均有应用，其中以中国、日本、韩国及东南亚地区应用面积最大。尤其在我国，BSM是近年来首选的稻田除草剂，这主要因为我国是水稻生产大国，水稻播种面积和产量均居世界首位。
为了满足国家粮食需求，在今后一个较长的时期内BSM还将具有广泛应用前景。然而由于这类除草剂具有极高的活性和极强的选择性，土壤中少量的残留即可对后茬敏感作物产生药害。且近年来，由于除草剂大量、高频率的不合理使用，造成了严重的水稻药害，因此提高水稻对苄嘧磺隆的抗性迫在眉睫。
缓解水稻的药害一直是农业生产中十分重要的环节，然而目前降低水稻的药害并没有好的方法，通常只能控制除草剂的用量或在水稻毒害后施加一些缓解剂以减少药害造成的损失。
印度梨形孢(Piriformospora indica)是一种重要的有益内生真菌，能够定殖在多种植物根的表皮和皮层细胞内和细胞间隙，提高植物对生物和非生物逆境的抗性。现有研究(吴金丹等，印度梨形孢诱导水稻促生、抗逆、抗病作用及其机理的初步研究，浙江大学学位论文)证明，印度梨形孢定殖于水稻根表皮的胞间与胞内，能够显著提升水稻各方面的性能，如：1、能够促进水稻地上部的生长，提高水稻产量；2、提高了水稻对镉胁迫的耐性，显著降低水稻地上部对镉的积累；3、可以增强水稻对盐胁迫的耐性；4、诱导水稻对纹枯病、细菌性条斑病和白叶枯病的抗性。印度梨形孢诱导植物抗逆的机制涉及提高植物抗氧化能力，诱导抗逆基因表达，并进一步诱导植物产生系统抗病性。印度梨形孢不同于丛枝菌根真菌，它可以在培养基上生长，这就为该菌在农业和园艺上的大面积应用提供可能。但是，利用印度梨形孢应用到水稻中以提高其抗药性的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高作物对除草剂苄嘧磺隆抗性的方法，以解决因施用除草剂苄嘧磺隆对作物造成药害的问题。
本发明在研究中首次发现，将印度梨形孢(Piriformospora indica)定殖于水稻根部，建立了印度梨形孢-水稻的共培养体系，该体系能够显著提高水稻对除草剂苄嘧磺隆的抗性。由于苄嘧磺隆是近年来首选的稻田除草剂，提高水稻对苄嘧磺隆的抗药性以减少药害损失对农业生产具有重要意义。该方法同样适用其他作物，如油菜、向日葵、烟草、小麦、玉米等。
因此，本发明提供了印度梨形孢(Piriformospora indica)在提高作物对除草剂苄嘧磺隆抗性中的应用。
作为优选，所述作物为水稻、油菜、向日葵、烟草、小麦、玉米。
在作物幼苗期，利用印度梨形孢(Piriformospora indica)菌丝液对作物幼苗进行灌根处理，使印度梨形孢定殖于作物根部。
本发明还提供了一种提高水稻对除草剂苄嘧磺隆抗性的方法，包括：
(1)将水稻种子萌发培育10-12天后，置于含有印度梨形孢(Piriformosporaindica)的水稻培养液中共培养；
(2)共培养期间，保持水稻培养液中印度梨形孢的浓度为0.5-1g/100mL，获得定殖有印度梨形孢的水稻幼苗；
(3)将定殖有印度梨形孢的水稻幼苗移栽至大田，培育至收获。
本发明根据印度梨形孢(Piriformospora indica)在水稻根部的定殖过程以及田间除草剂的使用及作用时期，合理设计操作步骤，具体为：印度梨形孢一般需要两周才能定殖到水稻根部，此时水稻处于3叶期，与苄嘧磺隆在田间作用时期大致吻合。
作为优选，步骤(1)中，所述水稻种子经消毒后再进行萌发培养。
所述萌发培育分两个阶段，第一阶段：将消毒过的水稻种子置于水中浸泡后，于35～38℃条件下暗培养24～48h；第二阶段：选择胚根已露白、长度一致的种子置于基础水稻营养液中培养。
所述基础水稻营养液为霍格兰营养液，每隔5天更换一次。培养条件为光照周期16/8h，光照强度300μmol m-2s-1，昼夜温度为25/20℃，相对湿度70％-80％。
一般情况下，水稻种子萌发培养10-12天后，进行印度梨形孢菌丝液的灌根处理。
所述水稻培养液为印度梨形孢菌丝液加入到基础水稻营养液混合制得。
所述印度梨形孢(Piriformospora indica)菌株是公众可以从生物材料样品国际保藏单位购买到的生物材料，在美国American type culture collection保藏库，保藏编号是204458TM。
印度梨形孢菌丝液配制方法为将1g鲜重菌丝悬浮在100mL无菌水中，用搅拌机打碎后备用。
水稻培养液中印度梨形孢含量太少不利于诱导提高水稻的抗药性，菌丝含量太多容易导致印度梨形孢与水稻争夺养分，作为优选，水稻培养液中印度梨形孢的浓度为0.5g/100mL。
印度梨形孢一般需要两周才能成功定殖到水稻根部，但灌根处理是直接将印度梨形孢菌丝液倒入水稻营养液中不利于印度梨形孢的存活，所以灌根一段时间后再倒入菌丝液以保证印度梨形孢的浓度，确保其能够成功定殖到水稻根中。作为优选，步骤(2)中，每隔4-6天往水稻培养液中添加印度梨形孢，重复2-3次。
所述共培养的条件为：光照周期16/8h，光照强度300μmol m-2s-1，昼夜温度为25/20℃，相对湿度70％-80％。
本发明具备的有益效果：
本发明利用的印度梨形孢不受苄嘧磺隆抑制，建立的印度梨形孢-作物共培养体系，可以显著提高作物对苄嘧磺隆的抗性，减少药害；印度梨形孢作为有益的内生真菌，定殖作物后，不产生副作用，同时确保对环境的安全性。
附图说明
图1为印度梨形孢在含有不同浓度苄嘧磺隆除草剂平板上生长一周的菌落直径。
图2为印度梨形孢在水稻中浙优1号根部的定殖结果。
图3为水稻在空白对照组、苄嘧磺隆推荐浓度处理、苄嘧磺隆推荐浓度和印度梨形孢共同作用下生长的情况。
图4为水稻在空白对照组、苄嘧磺隆1.5倍推荐浓度处理、苄嘧磺隆1.5倍推荐浓度和印度梨形孢共同作用下生长的情况。
图5为不同处理下水稻根和叶中APX的活性变化。
图6为不同处理下水稻根和叶中CAT的活性变化。
图7为不同处理下水稻根和叶中POD的活性变化。
图8为不同处理下水稻根和叶中SOD的活性变化。
图9为与水稻侧根形成相关的OsIAA13基因在不同处理下的表达水平。
图10为与促进水稻生长素IAA生物合成有关的YUCCA基因在不同处理下的表达水平。
图11为与抑制水稻根生长有关的NRR基因在不同处理下的表达水平。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不仅限于此。
本发明中应用的材料：印度梨形孢(Piriformospora indica)由浙江大学楼兵干教授惠赠；中浙优1号水稻种子由杭州市种子管理站提供，10％苄嘧磺隆可湿性粉剂购于安徽华星化工股份有限公司。
1平板测定印度梨形孢对苄嘧磺隆的敏感性试验
1.1印度梨形孢(Piriformospora indica)的培养
将印度梨形孢菌丝块接种于PDA培养基平板上，然后将培养皿置于28℃、24h黑暗恒温培养箱中培养，备用。
1.2含不同浓度苄嘧磺隆培养基的制备
将已熔化的1L PDA培养基冷却至45℃左右，根据说明书中推荐使用浓度移取适当的苄嘧磺隆加入PDA培养基中，充分混匀后，倒入直径为9cm的培养皿中，每皿25mL，使其均匀平铺，冷却。同时使用相同方法制成含有1/2倍推荐浓度和2倍推荐浓度苄嘧磺隆的PDA平板。
表1.除草剂苄嘧磺隆的浓度梯度
Figure BDA0001462923110000041
注：表中推荐浓度指每1L PDA培养基中添加的除草剂含量
1.3平板药效筛选试验
将培养基上活化培养5天的印度梨形孢，用灭菌后的打孔器(直径9mm)打制菌盘，然后将菌盘接种于含药剂的平板上，并用封口膜密封培养皿，每处理3个重复。不含除草剂的处理为对照，置于28℃、24h黑暗恒温培养箱培养，测量一周后的菌落直径。
1.4印度梨形孢对苄嘧磺隆的敏感性结果
印度梨形孢在含有不同浓度苄嘧磺隆除草剂平板上生长一周的菌落直径如图1所示，不同浓度苄嘧磺隆对印度梨形孢的生长均无抑制作用，可见印度梨形孢对苄嘧磺隆并不敏感。
如表2所示，不同浓度下苄嘧磺隆对印度梨形孢的生长均有显著促进作用，且在推荐浓度下，菌落直径达到6.00cm，比对照组增加了12.57％。
表2.印度梨形孢在含不同浓度10％苄嘧磺隆可湿性粉剂的培养基平板上生长一周菌落直径
Figure BDA0001462923110000042
注：不同字母表示差异达到5％显著水平；下同。
2.苄嘧磺隆作用于印度梨形孢－水稻共培养体系的效果
2.1材料与方法
2.1.1印度梨形孢(Piriformospora indica)的培养和水稻的萌发
将印度梨形孢菌丝块接种于PDA培养基平板上，然后将培养皿置于28℃、24h黑暗恒温培养箱中培养，备用。
选取饱满健康的水稻种子于0.1％次氯酸钠溶液中表面消毒15min，无菌水冲洗数次后，将种子置于蒸馏水中浸泡24h。充分吸收水分的种子放入发芽盒(18×12×10cm)，底部放置用1/2霍格兰加微量元素的营养液润湿的两层滤纸，在38℃黑暗条件下培养48h。
2.1.2印度梨形孢与水稻共培养体系的建立
切取PDA固体培养基上的小块真菌菌丝块，接种到PDB液体培养基进行增殖培养，置于恒温摇床，转速为150r/min，温度为30℃，黑暗条件下培养7d。过滤菌丝，用无菌水冲洗3-5次，1g鲜重菌丝悬浮在100mL无菌水中，用搅拌机打碎后放在三角瓶中备用。
选择胚根已露白、长度一致的种子在培养箱内生长，培养条件如下：光照周期16/8h，光照强度300μmol m-2s-1，昼夜温度为25/20℃，相对湿度70％-80％，营养液每隔5d更换一次。水稻萌发培养10d后，用印度梨形孢(Piriformospora indica)菌丝液对水稻幼苗进行灌根共培养15d，清水处理作为对照。
2.1.3印度梨形孢在水稻根部定殖的检测
水稻与印度梨形孢共培养两周后，观察印度梨形孢的定殖情况，选取中浙优1号6株水稻苗。剪取幼苗根系用自来水冲洗干净后用蒸馏水冲洗1次，吸干表面水分后，将根系剪成1cm长度的小段置于10％KOH溶液中软化过夜，用蒸馏水冲洗3-5次，置于1％HCL中酸化3-5min后，用0.05％台盼蓝染色1min，再用蒸馏水冲洗干净，最后在10×40倍光学显微镜下观察真菌的定殖情况。
2.1.4苄嘧磺隆处理已被印度梨形孢定殖的水稻
将上述已接种印度梨形孢的水稻和空白对照组的水稻，用不同浓度的苄嘧磺隆(0，0.012g/L，0.018g/L)处理，方法是称取适量的苄嘧磺隆可湿性粉剂加入水稻的营养液中混匀。梯度设置分别是清水对照、推荐浓度、1.5倍推荐浓度。除草剂处理七天后，分别取叶片和根来分析，不同处理的水稻苗选取五株作为一个重复来测量鲜重。试验每个处理都做三个重复。
2.2结果与分析
2.2.1印度梨形孢在水稻中浙优1号根部的定殖情况
如图2所示，在共培养的第15d观察到印度梨形孢的厚垣孢子密集的定殖在水稻根部的细胞间和细胞内。厚垣孢子呈圆形、亚梨形和椭圆形，且较集中分布在根的成熟区。在水稻根部的细胞间和细胞内均未观察到印度梨形孢菌丝。共检测40段1cm长度印度梨形孢处理的水稻根段，检测到孢子的小段数有31段，定殖率为77.5％。
2.2.2不同浓度的苄嘧磺隆处理对水稻叶片和根鲜重的影响
如图3和图4所示，仅用苄嘧磺隆处理水稻会产生一定的药害作用，可以观察到水稻的部分叶片发黄甚至枯萎，但根部定殖印度梨形孢的水稻叶片发黄枯萎数量明显减少。
如表3所示，苄嘧磺隆能够显著减少水稻的地上部和地下部鲜重，且随着苄嘧磺隆浓度的升高而增大，而根部定殖了印度梨形孢的水稻生物量比仅用苄嘧磺隆处理时均有显著增加。可见印度梨形孢确实能够缓解除草剂苄嘧磺隆对水稻产生的药害。
表3.不同浓度苄嘧磺隆与印度梨形孢对水稻的鲜重影响
Figure BDA0001462923110000061
注：不同字母表示差异达到5％显著水平。
3苄嘧磺隆作用于印度梨形孢－水稻共培养体系机理的初探
3.1抗氧化物酶测定
抗氧化物酶的活性包括抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)超氧化物歧化酶(SOD)，根据以下的方法测量。
3.1.1APX酶的测定
APX活性测定方法是根据Nakano和Asada(1981)的方法改良而来。反应体系为3mL，其中含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，0.1mM EDTA-Na2，0.3mM抗坏血酸，0.06mM H2O2和100μl酶提取液。在290nm处测定反应混合液1min内的吸光度变化，消光系数为2.8mM-1cm-1。
3.1.2CAT酶的测定
CAT活性通过H2O2的消耗来测定(消光系数为39.4mM-1cm-1)。反应体系共3ml，包含50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，2mM EDTA-Na2，10mM H2O2和100μl酶提取液。在240nm处测定反应混合液1min的吸光度的变化(Aebi，1984)。
3.1.3POD的测定
POD活性测定采用愈创木酚氧化法(Zhou和Leul，1999)。反应体系共3ml，包含50mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，0.3％愈创木酚，0.4％H2O2和100μl酶提取液。测定反应体系在470nm处1min内的吸光度的增加，消光系数为26.6mM-1cm-1。
3.1.4SOD酶的测定
SOD活性测定用NBT法(Zhang等，2008)。反应体系共3mL，包含50mM磷酸缓冲液(pH7.8)，13mM L-甲硫氨酸，75μM NBT，0.1mM EDTA，2μM核黄素和100μl酶提取液。反应混合液在4 000lx条件下反应20min，在560nm波长下比色，以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位计算出SOD活性。
3.2RNA的提取和qRT-PCR
总RNA是用RNAiso Plus(TaKaRa，Japan)从液氮冷冻的叶片中提取。1μg总RNA使用TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect for Real Time)来进行反转录。PCR是用SYBRs Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)试剂完成的，仪器是CFX96TM Real-Time System(BIO-RAD)。RT-PCR使用的引物如表4所示。每次处理重复3次。
表4.生长相关基因荧光定量PCR特异性引物序列
Figure BDA0001462923110000071
3.3结果与分析
3.3.1印度梨形孢与苄嘧磺隆对水稻抗氧化酶活性的影响
图5显示的是不同处理下水稻根和叶中APX的活性变化。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后水稻根中APX活性上升：推荐浓度时升高22.17％，1.5倍推荐浓度处理的水稻根APX活性显著高于对照；定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后水稻根中APX活性与对照相比显著上升。未定殖印度梨形孢经不同浓度苄嘧磺隆处理后水稻叶片中APX活性显著升高；定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后水稻叶片中APX活性在除草剂不同浓度下均显著提高。说明苄嘧磺隆会引起水稻中APX活性的升高，印度梨形孢的定殖导致APX活性进一步提高。
图6显示的是不同处理下水稻根和叶中CAT的活性变化。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后水稻根中CAT活性与对照相比显著下降；定殖印度梨形孢后经苄嘧磺隆处理后与对照相比水稻根中CAT活性显著上升。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后水稻叶片中CAT活性显著降低；定殖印度梨形孢经不同浓度除草剂处理后水稻叶片中CAT活性均显著升高。说明苄嘧磺隆会引起水稻中CAT活性的降低，随着苄嘧磺隆浓度的升高而降低。但印度梨形孢的定殖显著提高水稻根和叶中的CAT活性。
图7显示的是不同处理下水稻根和叶中POD的活性变化。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后水稻根中POD活性上升：推荐浓度时升高25％，1.5倍推荐浓度时显著高于对照；定殖印度梨形孢后经苄嘧磺隆处理后水稻根中POD活性均显著高于对照。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后水稻叶片中POD活性升高：推荐浓度时升高4.35％，1.5倍推荐浓度时升高17.39％；定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后的水稻叶片中POD活性显著高于对照。说明苄嘧磺隆会引起水稻中POD活性的升高，印度梨形孢的定殖导致POD活性进一步提高。
图8显示的是不同处理下水稻根和叶中SOD的活性变化。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后水稻根中SOD活性显著上升；定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后水稻根中SOD活性比对照显著升高。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后水稻叶片中SOD活性显著升高；定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后的水稻叶片中SOD活性显著升高。说明苄嘧磺隆会引起水稻中SOD活性的升高，但印度梨形孢的定殖对SOD活性影响不大。总的来说，苄嘧磺隆的逆境导致了抗氧化物酶的迅速积累，而印度梨形孢则进一步促进抗氧化酶的合成来抵抗除草剂造成的伤害。
3.3.2生长基因表达量分析
图9显示的是与水稻侧根形成有关的OsIAA13基因在不同处理下的表达水平。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后该基因在根中的表达量均下调：推荐浓度时比对照下调2.32％，1.5倍推荐浓度的基因表达水平显著低于对照；而定殖印度梨形孢后经苄嘧磺隆处理该基因在根中的表达量与对照相比均显著上调。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后该基因在叶中的表达量上调：推荐浓度显著上调，1.5倍推荐浓度时上调5.74％；定殖印度梨形孢后经苄嘧磺隆处理该基因在叶中的表达量与对照相比均显著上调。说明苄嘧磺隆会引起OsIAA13基因在根中的表达下调，而印度梨形孢能够抵消苄嘧磺隆的抑制作用促进该基因在根中的表达。
图10显示的是促进水稻生长素IAA生物合成有关的YUCCA基因在不同处理下的表达水平。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后该基因在根中的表达量均显著上调；定殖印度梨形孢后经苄嘧磺隆处理该基因在根中的表达量与对照相比均显著上调。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后该基因在叶中的表达量均显著下调；定殖印度梨形孢后经苄嘧磺隆处理该基因在叶中的表达量与对照相比均显著下调但下调程度较轻。说明苄嘧磺隆会引起YUCCA基因在叶中表达下调，而印度梨形孢能够缓解苄嘧磺隆的抑制作用。
图11显示的是抑制水稻根生长有关的NRR基因在不同处理下的表达水平。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后该基因在根中的表达量均显著上调；定殖印度梨形孢后经苄嘧磺隆处理该基因在根中的表达量与对照相比均显著上调。未定殖印度梨形孢经苄嘧磺隆处理后该基因在叶中的表达量均显著下调；定殖印度梨形孢后经苄嘧磺隆处理该基因在叶中的表达量与对照相比均显著下调。说明苄嘧磺隆会引起NRR基因在根中的表达上调，而印度梨形孢能够减轻苄嘧磺隆的作用。
本发明将印度梨形孢直接寄生到水稻根部，通过对水稻喷施除草剂苄嘧磺隆，确定印度梨形孢提高水稻对除草剂苄嘧磺隆的抗性，缓解水稻的药害。整个试验在一定程度上模拟了印度梨形孢在水稻中的寄生情况以及除草剂苄嘧磺隆的作用过程，仅需3周便可快速地明确印度梨形孢对水稻抗性的提高效果，同时因为在实验室条件下，排除了不可控因素的影响，可以确保对环境的安全以及数据的可靠性，为印度梨形孢的田间使用提供一定参考。

Claims (1)

1.一种提高水稻对除草剂苄嘧磺隆抗性的方法，其特征在于，包括：
(1)将水稻种子萌发培育10-12天后，置于含有印度梨形孢(Piriformospora indica)的水稻培养液中共培养；
(2)共培养期间，保持水稻培养液中印度梨形孢的浓度为0.5-1g/100mL，获得定殖有印度梨形孢的水稻幼苗；
(3)将定殖有印度梨形孢的水稻幼苗移栽至大田，培育至收获；
步骤(1)中，所述水稻种子经消毒后再进行萌发培养，萌发培育分两个阶段，第一阶段：将消毒过的水稻种子置于水中浸泡后，于35～38℃条件下暗培养24～48h；第二阶段：选择胚根已露白、长度一致的种子置于基础水稻营养液中培养；
所述印度梨形孢(Piriformospora indica)的保藏编号为ATCC 204458TM；
所述共培养的条件为：光照周期16/8h，光照强度300μmol m-2s-1，昼夜温度为25/20℃，相对湿度70％-80％；
步骤(2)中，每隔4-6天往水稻培养液中添加印度梨形孢，重复2-3次。
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