CN111778183B

CN111778183B - 一株嗜酸产氮假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN111778183B
Application number: CN202010613845.3A
Authority: CN
Inventors: 王静; 王杰; 赵倩; 冯永新; 关辉; 贾海江
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2040-06-30
Also published as: CN111778183A

Abstract

本发明提供一株嗜酸产氮假单胞菌及其应用，属于微生物技术领域。该菌株已于2020年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.1.17726。所述菌株具有较好的耐酸性、防病、促进氮素吸收效果，且其抗逆性强，该菌株兼具病原菌拮抗活性，且对土壤的酸度耐受范围广、抑菌谱广，在酸性土壤条件下烟草青枯病和黑胫病的绿色防控中具有一定的应用开发潜力。同时，在土地酸化情况日趋严峻的大背景下，该菌株的研究对于各种土壤类型的植物病害防治也具有一定的借鉴意义，具有良好的实际应用之价值。

Description

一株嗜酸产氮假单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株嗜酸产氮假单胞菌及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

土壤微生物是土壤中物质的循环者，同时也是有机物质和速效养分的一部分，它参与多种反应过程，是植物养料转化，有机碳代谢及污染物降解的驱动力，尤其在养分循环中具有重要意义。土壤微生物在生态系统的物质和能量转化中占有重要地位，不仅参与土壤的生物化学作用，影响植物生长发育及其土壤改良状况，其分布与活动更反映了土壤各因素对微生物的影响和作用(王国惠等，1999)。

植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR)指存在于植物根际的能促进植物生长的细菌，具有固氮、解磷、产铁载体及分泌植物激素等生理活性，不仅能够促进植物生长，增加作物产量，还具有生物防治作用，因而成为许多学者研究微生物肥料的热点对象。作为PGPR菌群重要组分的假单胞菌(Pseudomonas spp.)在自然界分布广泛、种类繁多，是植物根际土壤中起生物防治功能的主要细菌类群。目前，世界各地对假单胞菌进行了大量的研究报道，涉及领域包括农作物病害生物防治的应用、植物生长调节、杀虫、环境净化和医药研发等，Pseudomonas spp.主要包括铜绿假单胞(P.aeruginosa)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)，恶臭假单胞菌(P.putida)、产氮假单胞菌(P.azotoformans)等种类，P.azotoformans归属于荧光假单胞菌组(P.fluorescens)，具有分泌铁载体(Siderophores)的能力，降解污染土壤中对人类身体健康的有毒物质-砷(Nair et al.2007)，据Aravinthan等(2014)研究发现，P.azotoformans B1菌株与Bacillus subtilis B2菌株协同生长能够生物降解预处理的聚丙烯材料，最大年降解率是22.7％；P.azotoformans VKM B-2762D菌株可以破坏石蜡层和多环芳烃化合物从而去除高纬度海域海水中的油污(Evan et al.2015)，上述三个产氮假单胞菌菌株在环境治理方面均具有很大的应用潜力，但发明人发现，P.azotoformans尚未有应用于农业病害生物防治和植物生长调节的报道。

烟草是重要的叶用经济作物，在生育期内会受到病原菌的侵害而发病，其中主要的是根茎病害，包括烟草青枯病(Ralstonia solanacearum)和黑胫病(Phytophthoranicotianae)，这两种病害在我国主产烟区分布广，危害重，再加上受生产条件所限，烟田连作导致土壤酸化明显，根茎病害的危害日趋呈严重，每年给烟叶生产造成重大损失。氮素(N)是烟草生长所必需的主要营养元素之一，主要靠烟株从土壤中吸收，其中硝态氮是烟草生长最主要的氮源，植物体内硝态氮含量往往能反映土壤中硝态氮供应情况，因此可作为土壤肥氮肥的指标；同时硝态氮有利于烟株的生长和钾素的吸收。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一株嗜酸产氮假单胞菌及其应用，其适用于酸性土壤条件下烟草真菌、细菌病害的生物防治，同时促进烟草植株具高效利用氮元素和有益于营养生长，在烟草生长、真菌和细菌根茎病害防治方面具有重要的应用价值。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一株产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)CLP-10，该菌株已于2020年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.1.17726。

所述产氮假单胞菌CLP-10的代谢物也属于本发明的保护范围。

本发明的第二个方面，提供一种微生物菌剂，其含有所述产氮假单胞菌CLP-10和/或含产氮假单胞菌CLP-10的代谢物。

上述微生物菌剂具体可以是病原菌抑制剂或病害抑制剂。

上述病原菌抑制剂的活性成分可以是产氮假单胞菌CLP-10和/或产氮假单胞菌CLP-10的代谢物，上述病原菌抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病原菌抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病原菌的抑制效果确定。

上述病害抑制剂的活性成分可以是产氮假单胞菌CLP-10和/或产氮假单胞菌CLP-10的代谢物，上述病害抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病害抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。

本发明的第三个方面，上述产氮假单胞菌CLP-10和/或产氮假单胞菌CLP-10的代谢物在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

1)在抑制病原菌中的应用；

2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

3)在制备病害抑制剂中的应用；

4)在抑制病害中的应用。

上文中，所述病原菌可以为下述全部或部分病原菌：青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)。

上文中，所述病害可以为下述全部或部分病害：烟草青枯病和烟草黑胫病。

本发明的第四个方面，提供一种微生物菌肥，所述微生物菌肥含有所述产氮假单胞菌CLP-10和/或含产氮假单胞菌CLP-10的代谢物。所述微生物菌肥具有抑制烟草黑胫病菌和青枯病菌以及促进植物叶片叶绿素含量增加和/或促进植物对氮的吸收进而促进植物生长的作用。

本发明的第五个方面，上述产氮假单胞菌CLP-10、产氮假单胞菌CLP-10的代谢物、微生物菌剂和/或微生物菌肥在促进植物生长和/或诱发植物产生病害抗性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述植物可为下述任一种植物：

P1)种子植物；

P2)双子叶植物；

P3)茄科植物；

P4)烟草。

本发明的第六个方面，提供一种促进烟草生长的方法，所述方法包括向烟草植株表面和/或周围土壤中施用上述产氮假单胞菌CLP-10、产氮假单胞菌CLP-10的代谢物、微生物菌剂和/或微生物菌肥。

上述技术方案的有益技术效果：

上述技术方案通过室内平板对峙法和温室盆栽防治效果首次从烟草青枯病和黑胫病混发田块的烟草健康烟株根际土壤筛选获得一株产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)CLP-10，所述菌株具有较好的耐酸性、防病、促进氮素吸收效果，且其抗逆性强，该菌株兼具病原菌拮抗活性，且对土壤的酸度耐受范围广、抑菌谱广，在酸性土壤条件下烟草青枯病和黑胫病的绿色防控中具有一定的应用开发潜力。

同时，在土地酸化情况日趋严峻的大背景下，该菌株的研究对于各种土壤类型的植物病害防治也具有一定的借鉴意义，为酸性土壤条件下烟草青枯病和黑胫病的生物防控提供高效的微生物资源，挖掘微生物次级代谢物进而提高酸性土壤中青枯病和黑胫病生防效果奠定重要基础，因此具有良好的实际应用之价值。

说明书附图

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明菌株CLP-10菌落、菌体形态图。

图2为本发明实施例1中菌株CLP-10对R.solanacearum(左侧平板)与Phytophthora parasitica(右侧平板)拮抗活性图。

图3为本发明实施例3中菌株CLP-10对烟苗的促生作用图。

图4为本发明实施例4中硝态氮标准曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一个具体实施方式中，提供一株产氮假单胞菌(Pseudomonasazotoformans)CLP-10，该菌株已于2020年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCCNo.1.17726。该菌株通过改良的快速筛选方法从湖南张家界烟区酸化的烟株根际土分离获得具有嗜酸性，即在酸性条件下拮抗活性强，对烟草黑胫病和青枯病具有生物防治效果，促进烟草植株具高效利用氮元素和有益于营养生长，在烟草生长、真菌和细菌根茎病害防治方面具有重要的应用价值。

本发明中，通过测定该菌株16S rDNA基因序列(SEQ ID NO.1)，结合菌落、菌体形态特征(见图1)，最终确定该菌株属于产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)。

所述产氮假单胞菌CLP-10的代谢物也属于本发明的保护范围。

本发明的又一具体实施方式中，所述产氮假单胞菌CLP-10的代谢物可以从产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)CLP-10的发酵液中获得。产氮假单胞菌CLP-10的代谢产物具体可按照如下方法制备：将所述产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)CLP-10接种于液体发酵培养基中进行发酵培养，除去液体培养物(发酵液)中的产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)CLP-10即得到产氮假单胞菌CLP-10的代谢物。

其中，所述液体发酵培养基优选为NB培养基。

发酵培养条件具体为：在26～30℃(优选为28℃)有氧培养，转速：120-180rpm(优选为150rpm)。

所述NB培养基配方为(g/L)为：牛肉浸膏3.0g；蛋白胨5.0g；葡萄糖2.5g；水1000mL，pH7.0±0.2。

上述微生物菌剂具体可以是病原菌抑制剂或病害抑制剂。

上文中，病原菌可以为下述全部或部分病原菌：青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)、烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)。

1)在抑制病原菌中的应用；

2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

3)在制备病害抑制剂中的应用；

4)在抑制病害中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。

所述载体可为固体载体或液体载体；

所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；

所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。

所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌肥，所述微生物菌肥含有所述产氮假单胞菌CLP-10和/或含产氮假单胞菌CLP-10的代谢物。所述微生物菌肥具有抑制烟草黑胫病菌和青枯病菌以及促进植物叶片叶绿素含量增加和/或促进植物对氮的吸收进而促进植物生长的作用。

本发明的又一具体实施方式中，微生物菌肥还含有有机质、全钾、全氮，用于为植物提供养分。

本发明的又一具体实施方式中，上述产氮假单胞菌CLP-10、产氮假单胞菌CLP-10的代谢物、微生物菌剂和/或微生物菌肥在促进植物生长和/或诱发植物产生病害抗性中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的又一具体实施方式中，促进植物生长包括促进植物叶片叶绿素含量增加和/或促进植物对氮的吸收。

本发明的又一具体实施方式中，所述病害可以为下述全部或部分病害：烟草青枯病和烟草黑胫病。

本发明的又一具体实施方式中，上述应用中，所述植物可为下述任一种植物：

P1)种子植物；

P2)双子叶植物；

P3)茄科植物；

P4)烟草。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种促进烟草生长的方法，所述方法包括向烟草植株表面和/或周围土壤中施用上述产氮假单胞菌CLP-10、产氮假单胞菌CLP-10的代谢物、微生物菌剂和/或微生物菌肥。

本发明的又一具体实施方式中，所述菌株、微生物菌剂或微生物菌肥更适用于酸性条件中发挥作用；

本发明的又一具体实施方式中，所述酸性条件pH为5.5-6.5。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 CLP-10及其培养液对烟草青枯病和黑胫病菌的拮抗活性验证：对从山东临沂市沂水县四十里堡镇烟草青枯病和黑胫病病株拮抗活性进行验证。将NA培养基与适量酸性缓冲液(0.3mol/L的乙酸钠与0.2mol/L的乙酸按照体积比1：9混合)混合，制成pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的不同酸碱度的NA培养基平板，采用菌体接种法和牛津杯法测定CLP-10菌株及其发酵液在不同酸碱度条件下抑菌活性差异。接种CLP-10于NA平板上28℃培养48h，然后采用平板对峙法，即在燕麦培养基(YA)平板上接种黑胫病菌菌饼(直径为5mm)，用接种环挑取CLP-10在菌饼两侧1.5cm等距离划直线，置于28℃培养7d。对青枯雷尔氏菌的抑制采用牛津杯平板扩散法(如图2)；即将CLP-10接种于牛肉汁蛋白胨液体培养液(NB)中，28℃、120rpm振荡培养2d，取150μL发酵液和无菌上清液(经细菌过滤器除菌)置于事先混有青枯菌的NA平板表面的牛津杯内，静置培养2天，观察CLP-10对上述两种致病菌的抑制活性。从室内平板抑菌效果观察，CLP-10菌体、发酵液和无菌上清对烟草青枯病菌和黑胫病菌均具有较好的抑制作用(图2，表1、2)。

从表1、2可以看出，在酸性(5.5≤pH≤6.5)范围内，CLP-10对青枯病菌、黑胫病菌的抑制效果较强，且高于中性或碱性条件，说明酸性条件有利于该菌株分泌拮抗物质发挥最佳抑菌活性，因此将该菌株应用于酸性土壤条件下青枯病、黑胫病的生物防治将具有很大潜力。

表1耐酸拮抗菌株P.azotoformans CLP-10对青枯菌的抑菌效果

注：同列数据后字母不同代表差异显著(p≤0.05)。

实施例2.P.azotoformans CLP-10菌株的防病效果

P.azotoformans CLP-10对烟草黑胫病和青枯病的盆栽防效试验在温室内进行。黑胫病防效试验共设3个处理，处理1为CLP-10发酵后去除上清的菌悬液(浓度大致为10⁹cfu/mL)，施菌方式是浸根；处理2为常规化学药剂72％霜霉威盐酸盐水剂，800倍稀释灌根；处理3为无菌水对照(CK)，青枯病防效试验供设3个处理，处理1为CLP-10发酵后去除上清的菌悬液(浓度大致为10⁹cfu/mL)，处理2为常规化学药剂12％中生菌素可湿性粉剂(WP)1500倍稀释液，处理3为等量无菌水对照(CK)，各处理的接种方式均为浸根处理。将供试烟苗(生育期为30天)根部经无水乙醇消毒和无菌水漂洗后，浸根于上述各处理液体中50min，然后移入育苗钵中(直径为150mm×110mm)，缓苗后3天，进行病原菌接种：青枯菌接种采用标准菌液(10⁸cfu/mL)浸根的方法，即直接把穴盘放入接种液中，接种时间为30min，然后将穴盘置于另一盛有蛙石营养土的盘上；黑胫病菌接种次用菌谷接种法：菌谷的制作方法是将谷子浸泡6h后用清水洗净,煮至谷粒炸开成半开花状，冷却晾至半干，分装入500ml三角瓶中高压灭菌1h(121℃)。接种黑胫病菌菌饼于三角瓶中培养15d，待瓶中谷子长满菌丝备用。菌谷的接种采用伤根法，即在每株烟苗的茎基部挖穴(根系造成轻微伤口)，并施入1g菌谷，埋穴保湿。将供试烟苗置于光周期为14h/10h、昼夜温度为30/24℃、湿度为75％的人工气候室内，每处理15株烟苗，4次重复。移栽后3天开始观察烟苗发病情况，待烟株出现青枯病和黑胫病萎蔫症状后，每天定时调查烟株发病情况，待CK的发病率超过80％，计算各处理的防治效果，病情分级与病情指数计算参照烟草病虫害分级及调查方法(GB/T23222-2008)进行。

CLP-10对烟草黑胫病具有防治效果，接种后21天调查的病情结果显示，CLP10(10⁸cfu/mL)菌悬液浸根处理后，对烟草黑胫病的防效为60.09％，稍低于常规化学药剂72％霜霉威盐酸盐水剂处理，但处理间差异不显著，结果说明CLP10对烟草黑胫病的防效与化学药剂防治效果相当，应用于烟草黑胫病的绿色防控具有很大的应用潜力。CLP10(10⁸cfu/mL)对烟草青枯病的防治效果为65.12％，常规防治药剂12％中生菌素WP的防效为66.18％，两个处理的防效相当，且处理间差异不显著。

表3 CLP-10对烟草黑胫病的防治效果

处理	病情指数	防效(％)
			CLP10	31.85	60.09a
72％霜霉威水剂	30.37	62.88a
			CK	81.85	-

表4 CLP-10对烟草青枯病的防治效果

处理	病情指数	防效(％)
			CLP10	30.74	65.12a
12％中生菌素WP	29.82	66.18a
			CK	88.15	-

实施例3.P.azotoformans CLP-10菌株对烟草的促生作用

P.azotoformans CLP-10对烟草促生作用的盆栽试验在温室内进行，试验共设2个处理，处理1为的CLP-10菌悬液灌根处理(10⁸cfu/mL)，处理2为无菌水处理，即空白对照(CK)。将每处理烟苗(3-4片真叶，每重复20株，共3次重复)分别移栽于装有灭菌土的花盆中(大小为150mm×110mm)，移栽后第3天，进行CLP-10菌悬液灌根处理，每株用量为15mL，CK为等量无菌水。将供试烟苗置于光周期为14h/10h、昼夜温度为28/24℃、湿度为60％的人工气候室内，常规管理。处理30d后，流水小心洗去根部泥土，按烟草农艺性状调查方法(YC/T142-2010)测量并记载各处理烟草株高，将烟株置于100℃的烘箱中烘干1h至恒重，分别称量整株干重和根干重。每重复10株，共三次重复。

表5 CLP-10菌株对烟苗的促生效果

CLP-10对烟草促生作用如表5所示，施菌30d后，烟株株高增长率、地径增长率、整株干重增长率、根干重增长率以及鲜重增长率分别为51.79％、17.93％、1.36％、0.19％、19.74％，均显著高于对照组39.05％、8.64％、0.71％、0.10％、10.11％。

实施例4.P.azotoformans CLP-10菌株促进烟草叶片叶绿素含量增加

采用丙酮乙醇混合液法测定各处理烟草叶片叶绿素含量，方法如下：取新鲜叶片，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的新鲜样品2g，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3mL 95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置3～5min。漏斗中置入滤纸，用乙醇湿润后，沿玻棒将提取液倒入漏斗，滤液流至容量为100mL的棕色容量瓶中；用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至100mL，摇匀。取叶绿体色素提取液在波长665nm、645nm下测定吸光度，以95％乙醇为空白对照。叶绿素含量计算公式如下：

公式1：叶绿素a＝12.7A663-2.69A645

叶绿素b＝22.9A645-4.68A663

公式2：总叶绿素含量(mg/g)＝(叶绿素浓度X稀释倍数X提取液体积)/样品鲜重

无水乙醇提取法测定烟株叶片叶绿素含量的试验结果如表6所示，施用CLP-10菌悬液30天后，烟草叶片叶绿素含量为27.62mg/g，比对照增厚在哪个49.46％，与CK处理差异显著。

表6 CLP-10对烟草叶绿素含量的影响

实施例5.P.azotoformans CLP-10促进烟株对硝态氮的吸收

1.1原理

在浓酸条件下，NO₃ ^-与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，硝基水杨酸在碱性条件下(PH>12)呈黄色，在一定范围内，其颜色深浅与含量成正比，可直接比色测定。

1.2设备电子天平、分光光度计，恒温水浴锅、容量瓶、刻度试管、漏斗、滤纸等。

1.3材料：红花大金元烟株

1.4试剂

(1)500ppm硝态氨标准溶液精确称取烘干至恒重的KNO，0.7221g溶于蒸饰水无离子水中，定容至200mL。

(2)5％水杨酸-硫酸溶液：称取5g水杨酸济于100mL浓硫酸中(密度为1.84)，搅拌济解后，贮存于棕色瓶中，置冰箱保存1周有效。

(3)8％氢氧化钠溶液：称取10g氢氧化钠溶于1L去离子水中即可。

1.5标准曲线的制作

(1)吸取500ppm标准溶液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL分别放入50mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度，使必成为10、20、40、60、80、100、120ppm系列标准溶液。

(2)吸取上述系列标准溶液0.1mL，分别放入刻度试管中，以0.1mL无离子水代替标准溶液做空白，再分别加入0.4mL水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20min后再加如8％氢氧化钠溶液9.5mL摇匀冷却至室温，显色液总体积为10mL。

(3)以空白作参比，在410nm波长下测定吸光度，以硝态氮浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。见图4。

1.6样品液的制备：称新鲜植物组织2g研成匀浆，装入具塞刻度试管，加10mL无离子水，盖紧塞子，置于沸水浴浸提30min，其间不断摇动，后用自来水冷却，滤液过滤到25mL容量瓶中，并反复冲洗残渣，最后定容至刻度，备用。

1.7样品液的测定

吸取样品液0.1mL分别于三支试管中，然后加入5％水杨酸-硫酸溶液0.4mL，混匀置室温下20min，再慢慢加入9.5mL 8％氢氧化钠溶液，待冷却至室温后，以空白作参比，在410nm波长下测吸光度。在标准曲线上查得或用回归方程计算NO₃ ^-浓度，计算其硝态氮含量，结果见下表7。

表7烟草植株内硝态氮含量(μg/g鲜重)

处理	Ⅰ重复	Ⅱ重复	Ⅲ重复	均值
					CLP-10	0.16	0.169	0.375	0.23±0.12a
CK	0.096	0.109	0.065	0.09±0.02b

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 一株嗜酸产氮假单胞菌及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1063

<212> DNA

<213> 产氮假单胞菌CLP-10 16S rDNA

<400> 1

tccaccgtgg taccgtcctc ccgaaggtta gactagctac ttctggtgca acccactccc 60

atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcgac attctgattc 120

gcgattacta gcgattccga cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cggactacga 180

tcggttttat gggattagct ccacctcgcg gcttggcaac cctctgtacc gaccattgta 240

gcacgtgtgt agcccaggcc gtaagggcca tgatgacttg acgtcatccc caccttcctc 300

cggtttgtca ccggcagtct ccttagagtg cccaccatta cgtgctggta actaaggaca 360

agggttgcgc tcgttacggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacagcca 420

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tttcctccca acttaaagtg ctttaacatc cgaagacctt ctt 1063

Claims

1.一株产氮假单胞菌（Pseudomonas azotoformans）CLP-10，该菌株已于2020年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.1.17726。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述产氮假单胞菌CLP-10。

3.如权利要求2所述微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为病原菌抑制剂或病害抑制剂。

4.权利要求1所述产氮假单胞菌CLP-10在如下1)-4)中全部或部分中的应用：

1)在抑制病原菌中的应用；

2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

3)在制备病害抑制剂中的应用；

4)在抑制病害中的应用；

病原菌为下述全部或部分病原菌：青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）；

病害为下述全部或部分病害：烟草青枯病和烟草黑胫病。

5.一种微生物菌肥，其特征在于，所述微生物菌肥含有权利要求1所述产氮假单胞菌CLP-10。

6.如权利要求5所述的微生物菌肥，其特征在于，所述微生物菌肥还含有有机质、全钾和全氮。

7.权利要求1所述产氮假单胞菌CLP-10、权利要求2所述微生物菌剂或权利要求6所述微生物菌肥在促进植物生长和/或诱发植物产生病害抗性中的应用。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，促进植物生长为促进植物叶片叶绿素含量增加和/或促进植物对氮的吸收；或，病害为下述全部或部分病害：烟草青枯病和烟草黑胫病；

上述应用中，所述植物为烟草。

9.一种促进烟草生长的方法，其特征在于，所述方法包括向烟草植株表面和/或周围土壤中施用权利要求1所述产氮假单胞菌CLP-10、权利要求2所述微生物菌剂或权利要求6所述微生物菌肥。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，施用环境为酸性条件。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酸性条件pH为5.5-6.5。