CN107586737A - 一株抗黄瓜枯萎病的贝莱斯芽胞杆菌及其微胶囊缓释菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株抗黄瓜枯萎病的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)NH‑1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017336。本发明还公开了一种抗黄瓜枯萎病的微生物菌剂，其活性成分是贝莱斯芽胞杆菌NH‑1。本发明为黄瓜枯萎病的防治提供了一种新的微生物及其菌剂，该微生物及其菌剂具有防治效率高、安全长效、经济环保等优点，且主要通过提高黄瓜体内的防御保护酶活性达到防治枯萎病的效果。

Description

一株抗黄瓜枯萎病的贝莱斯芽胞杆菌及其微胶囊缓释菌剂

技术领域

本发明属于微生物及农业病害防治领域，具体涉及一株抗黄瓜枯萎病的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)，本发明还涉及该菌株的应用及含有该菌株的微生物菌剂。

背景技术

黄瓜枯萎病，又名死秧病，是一种土传真菌病害。枯萎病对黄瓜的产量和品质影响很大，染病后会导致黄瓜苗大面积萎蔫，发病严重情况下可导致整株死亡，发病轻的时候可使黄瓜产量减少25％-35％，发病重的年份可造成绝产。

目前，黄瓜枯萎病的防治仍无十分有效的措施，生产上主要采取农业防治、生物防治和化学防治相结合的综合防治方针，将枯萎病发病高峰推迟至采收后期，从而减少损失。生物防治具有经济、安全无公害、长效等特点，是防治枯萎病研究的热门方向。目前研究的生物防治种类主要包括微生物源和植物源的生物防治，其中利用拮抗微生物防治植物病害已成为研究的重要方向。

相比于其它方法，生物防治虽具有一定的优势，但同时也存在一些不足。生防菌的应用受制于土壤环境等多种生态因素的制约，难以发挥较好的作用。对于传统农药剂型，由于药物在环境中的降解、挥发以及在土壤中的浸出问题，往往施药量比实际所需药量大，相应地，经济成本也更高。利用缓释剂对农药的控制释放是改善和解决这些问题的重要途径之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够拮抗黄瓜枯萎病，且在黄瓜根茎组织中具有良好定殖能力的贝莱斯芽胞杆菌，此外，本发明还提供一种用于拮抗黄瓜枯萎病的微生物菌剂及其制备方法，以便更好地将该菌株应用于黄瓜枯萎病的防治。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术措施：

从黄瓜枯萎病发病区域中健康的黄瓜根、茎中分离出内生菌，采用平板对峙法获得1株对尖孢镰刀菌具有明显拮抗作用的贝莱斯芽胞杆菌菌株，将其命名为NH-1，并对该芽胞杆菌的48h发酵上清液进行115℃灭菌处理10min后进行平板抑菌实验，发现NH-1菌株高温处理后的发酵液对尖孢镰刀菌仍有拮抗作用。经gyrB基因序列分析并构建系统发育树鉴定NH-1菌株为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。

通过利福平梯度筛选获得NH-1抗60μg/ml利福平菌株，并对其发酵48h进行盆栽灌根定殖试验，分别在7d，14d，21d，28d，45d检测黄瓜苗根茎及植株根际土中NH-1菌株的活菌浓度。结果发现，在黄瓜苗根、茎中NH-1以高于1×10⁶CFU/g的生物量保持稳定且呈上升的趋势，在根际土壤中的活菌数较稳定增殖，保持在10⁸CFU/g的数量级。

检测NH-1对黄瓜苗植株的防御保护酶体系PAL，PPO，POD的影响，检测到对黄瓜苗浇灌NH-1菌株的发酵液对其体内的PAL，PPO，POD酶活均具有显著的促进作用。

通过田间小区试验验证，贝莱斯芽胞杆菌NH-1田间防治效果高达66.03％，对比于不施加生防菌黄瓜苗植株的病情指数为92，施加了NH-1菌株发酵液的植株病情指数为26，田间数据显示，NH-1在防治黄瓜枯萎病上具有显著效果，是一种优势生防菌株。

利用微生物细胞固定化技术，我们将贝莱斯芽胞杆菌NH-1包裹在膜性壁材中得到的微胶囊缓释剂型，其优选的制备方法包括以下步骤：

(1)将贝莱斯芽胞杆菌NH-1在LB固体培养基中过夜活化后，以0.5～2％的重量比接种于新鲜的LB液体培养基中，于37℃，150～200rpm下培养，收集菌液；

(2)将菌液按1～4∶5的体积比加入到重量浓度为1～5％的海藻酸钠溶液中，充分搅拌后用注射器注入到冷却的pH为5～7、重量浓度为1～3％的金属盐溶液中，搅拌固化，将沉淀用水洗涤，干燥，即得。

进一步优选的制备方法是：

(1)将贝莱斯芽胞杆菌NH-1在LB固体培养基中过夜活化后，以1％的重量比接种于新鲜的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养，收集菌液；

(2)将菌液按2∶5的体积比加入到重量浓度为3％的海藻酸钠溶液中，充分搅拌后用注射器注入到冷却的pH为5.5、重量浓度为2％的氯化钙溶液中，搅拌固化，将沉淀用水洗涤，干燥，即得。

通过土壤定殖实验可知，无论在营养基质中还是在自然土壤中，微胶囊菌剂都具有缓慢释放活菌数的趋势，到最后微胶囊崩解，营养基质中活菌数定殖达10⁶CFU/g，自然土壤中活菌数可达10⁷CFU/g。

本发明的有益效果是：

(1)本发明为黄瓜枯萎病的防治提供了一种新的微生物及其菌剂，该微生物及其菌剂具有防治效率高、安全长效、经济环保等优点，且主要通过提高黄瓜体内的防御保护酶活性达到防治效果。

(2)本发明提供的微生物菌剂，由于是将贝莱斯芽胞杆菌包裹在壁材中而与外界环境隔离，因此能提高菌剂的活性和稳定性，从而便于携带、运输和储存。同时，在适当条件下，壁材被破坏时又能将活性成分缓慢、稳定地释放出来，从而有利于减少施药次数，降低农业生产成本。

附图说明

图1贝莱斯芽胞杆菌NH-1对尖孢镰刀菌的平板拮抗作用。

图2贝莱斯芽胞杆菌NH-1单菌落图。

图3贝莱斯芽胞杆菌NH-1芽胞染色图。

图4依据贝莱斯芽胞杆菌NH-1的gyrB基因序列构建的系统发育树。

图5贝莱斯芽胞杆菌NH-1对黄瓜苗内PAL酶活的影响。

图6贝莱斯芽胞杆菌NH-1对黄瓜苗内POD酶活的影响。

图7贝莱斯芽胞杆菌NH-1对黄瓜苗内PPO酶活的影响。

图8自然土中掩埋凝胶株活菌数随时间变化曲线图。

具体实施方式

本发明实施例所述技术方案，如未特别说明，均为常规技术，所用试剂如未特别说明，均来源于商业化渠道。

实施例1贝莱斯芽胞杆菌NH-1的筛选及鉴定

1、黄瓜苗内生细菌的分离

从河南郑州黄瓜枯萎病发病区域中的健康黄瓜苗中分离根、茎中的内生细菌。分别称取0.5g的根、茎进行表面消毒：75％乙醇10-30s，无菌水冲洗2-3次，0.1％升汞1-3min，无菌水冲洗2-3次，然后，加入5ml无菌水研磨充分，稀释10倍涂布于LB平板，于37℃培养48h，挑取菌落形态不同的细菌分离纯化，将纯化的菌株-20℃甘油管保存。

2、拮抗内生细菌的筛选

接种黄瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌于PDA固体平板中，28℃恒温培养2-3天，挑取37℃培养24h的内生菌单菌落点接于距离镰刀菌菌落边缘2-3cm处，每个菌株重复三次，28℃培养3-5天，筛选出产生抑菌圈的菌株(图1)。

3、拮抗内生细菌发酵液活性检测

将活化得到的拮抗芽胞杆菌按2％的接种量接种至50ml的LB发酵培养基中发酵培养48h，得到的发酵液离心(8000r/min，15min)，取上清液，于115℃灭菌10min，按1:10的体积比加入PDA培养基中，以不加发酵液为空白对照，倒平板，在每个平板中央接入5mm尖孢镰刀菌菌饼，28℃培养箱培养，48h后开始测量各处理中尖孢镰刀菌的菌落直径，计算抑菌率，统计实验数据可得，拮抗菌株发酵液热处理后对尖孢镰刀菌的平板抑菌率为46％。

抑菌率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径*100％

4、菌落形态特征及其芽胞染色

通过对菌株NH-1菌落的形态观察，其表面粗糙干燥、边缘不规则，中部环状隆起不透明，菌落颜色为灰白色、光泽灰暗、呈不规则的形状(图2)。经结晶紫染色后，在显微镜下观察可以清晰的看到视野中有很多杆状菌体，芽胞中生(图3)。

5、菌株gyrB基因序列分析鉴定

gyrB基因扩增引物和反应条件参考SATOSHI等方法(Yamamoto S和Harayama S1995)。将菌株NH-1的gyrB基因扩增产物纯化后测序，通过NCBI数据库进行BLAST比对，采用MEGA6.0软件构建拮抗菌的系统发育树，经鉴定菌株NH-1为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)(图4)。

所述贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)NH-1，于2017年6月14日送交位于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2017336。

实施例2贝莱斯芽胞杆菌NH-1在黄瓜植株中定殖试验

1、抗利福平的拮抗细菌的筛选

在LB固体培养基中加入2μg/ml利福平，取100μl贝莱斯芽胞杆菌NH-1菌液涂布，37℃培养2-4d，待菌落生长后，挑选单菌落转移至5μg/ml的利福平抗性平板上，经培养后筛选抗性菌落。逐步提高利福平的浓度分别至10、20、40、60μg/ml，最后获得抗60μg/ml利福平菌株。将抗性菌株在添加60μg/ml利福平的LB平板上连续传代3-5次，稳定抗性菌株的抗性。检测利福平抗性菌株对黄瓜枯萎病的拮抗能力，选择抗菌活性与出发菌株相似的抗性菌株用于定殖研究。

2、拮抗贝莱斯芽胞杆菌NH-1在黄瓜体内的定殖试验

利用温室盆栽实验确定利福平标记生防贝莱斯芽胞杆菌NH-1菌株在黄瓜根茎部及根际土壤的定殖规律。将利福平标记菌株经摇瓶培养的菌液稀释至10⁸CFU/ml左右，做灌根处理。

试验共设2个处理：①灌根处理：取黄瓜种子在垫有湿润试纸的培养皿中催芽，出芽后播种于装有营养土的盆钵中；三叶期后用标记菌液灌根，每株浇灌10mL菌液；②空白对照：取黄瓜种子在垫有湿润试纸的培养皿中催芽，出芽后将种子直播播种于装有营养土的盆钵中。每处理3盆，每盆播1粒种子，放入温度约25℃的温室中培养，三叶期时每株苗用无菌蒸馏水浇灌根10ml，每处理3次重复。

在植株展开三片真叶时采用浓度梯度稀释法回收定殖菌株，于灌根后7，14，21，35，45d随机取样进行分离根际土中的标记菌，均称取1g土于9mL无菌水中振荡30min，系列稀释后于含60μg/mL利福平的LB平板上培养计数，计算平均每克根际土的含菌量。另外，分别取黄瓜根和茎0.3g，表面用70％的酒精擦洗后，用0.1％升汞浸泡处理1.5-2.0min。晾干后剪碎并加入1mL无菌水磨碎，再静置15min，然后分别取100μL溶液均匀涂于含60μg/mL利福平的LB平板上，每个处理3个重复，37℃恒温培养箱中培养2d，根据每个平板上生长出的菌落数，计算每克鲜重组织中的活菌数(CFU/g)。

结果显示：贝莱斯芽胞杆菌NH-1在黄瓜苗根、茎中定殖能力较好，在浇灌处理45d后根、茎中含菌量维持在10⁶CFU/g以上，土壤中的含菌量维持在10⁸CFU/g以上。由此显示，贝莱斯芽胞杆菌NH-1具有在黄瓜苗内良好的定殖能力。

实施例3贝莱斯芽胞杆菌NH-1对黄瓜苗植株内防御保护酶PAL、PPO、POD活性的影响

待黄瓜苗长至三叶期时，挑选长势良好的黄瓜幼苗，取拮抗菌株NH-1发酵48h后的发酵液，每株浇灌10ml，间隔24h后每株再浇灌10ml发酵液，再次间隔24h后开始取叶片测定酶活。设置三个重复，每个重复3株苗，对照组浇灌等量蒸馏水。

1.丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定

PAL活性测定参照文献方法。取0.1g处理的叶片组织加入3mL缓冲液(5mmol/Lβ-巯基乙醇，1mmol/L EDTA，1％PVP，pH 8.4)，加入少量石英砂于研钵中冰浴研磨，收取匀浆在4℃下8000r/min离心15min，收集上清液作为粗酶液检测PAL酶活性。取粗酶液4μL，加入3.9mL测定液(L-苯丙氨酸20mmol/L，0.05mmol/L硼酸缓冲液，pH 8.4)中，混匀后40℃下反应1h，在290nm下测定OD值。以每克蛋白质每分钟OD值变化0.01定义为1个活力单位。结果表明：浇灌菌液处理后的黄瓜苗植株内PAL酶显著增强(图5)。

2.过氧化物酶(POD)活性测定

过氧化物酶的活性测定采用邻甲氧基苯酚法。取0.1g处理的叶片组织加入3mL的酶提取液(50mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.0)冰浴研磨后收取匀浆，4℃下10000r/min离心15min，上清保存于-20℃，用于酶检测。测定酶活的第1到3天用50mmol/L磷酸缓冲液将粗酶液稀释50倍，测定酶活的第4到6天用50mmol/L磷酸缓冲液将粗酶液稀释100倍。取1mL酶液，加入1mL 50mmol/L磷酸缓冲液，再加入1mL 1％愈创木酚摇匀后，置30℃下水浴5min，然后加入1mL 3％H₂O₂，于470nm下测定，每30s读取一个数据，读取三分钟，连续测6天。以每毫克蛋白质每分钟470波长的OD值变化0.01为1个酶活单位(图6)。

3.多酚氧化酶(PPO)活性测定

参照文献方法。取0.1g处理的叶片组织加入3mL的酶提取液(50mmol/L磷酸缓冲液，pH 7.0)，加入石英砂冰浴研磨充分，收集匀浆，4℃下10000r/min离心15min，上清保存于-20℃，用于酶检测。取0.1mL酶液，加入1.5mL 0.05mol/L磷酸缓冲液，30℃下水浴反应2min，再加入1.5mL20mmol/L邻苯二酚，在420nm下测定，每分钟读取一次，连续重复三次，以每克蛋白质每分钟420nm波长的OD值变化0.01定义为1个活力为单位。结果表明：NH-1菌株发酵液处理后的黄瓜苗植株内PPO酶显著增强(图7)。

实施例4贝莱斯芽胞杆菌NH-1微胶囊缓释菌剂的制备及土壤基质掩埋活菌数的检测

1.贝莱斯芽胞杆菌NH-1缓释微胶囊菌剂的制备

采用锐孔凝固浴法，将保存于-20℃的贝莱斯芽胞杆菌NH-1在LB固体培养基中过夜活化后，以1wt％的接种量接种于新鲜的LB液体培养基中于37℃，180rpm下培养，收集稳定期前期的菌液，备用。将菌液按2∶5的体积比加入到重量浓度为3％的海藻酸钠溶液中，充分搅拌后用注射器注入冷却的pH为5.5、重量浓度为2％的氯化钙溶液中，搅拌固化，将沉淀用水洗涤三次，自然干燥，即得。

2.微胶囊菌剂在无菌水中活菌数的释放及统计

在制备包裹芽胞杆菌微胶囊时，添加2％红糖作为外加碳源，利用红糖在水中的溶解性，将微胶囊包裹的芽胞杆菌置于无菌水中静置培养，红糖从微胶囊中溶解出来，为释放出来的芽胞杆菌营造一个可适合增殖的环境。通过一定时间段检测活菌数，即可间接表明微胶囊的包裹效率。

3.海藻酸钠最适浓度的优化

按1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％的浓度梯度分别配制50mL海藻酸钠凝胶溶液，并添加2％的红糖作为外加碳源，与20mL的贝莱斯芽胞杆菌NH-1的菌液混合均匀，充分搅拌，用注射器将该混合液注入冷却的2％的CaCl₂溶液中，固化，无菌水洗涤三次，即得贝莱斯芽胞杆菌NH-1海藻酸钠微胶囊。用游标卡尺测量微胶囊的粒径。

将制备好的微胶囊称取1g左右，置于PA瓶中，并加入9mL无菌水，连续7d每天取该液体稀释涂布，观察并记录微球中释放的活菌数和计算微球的包埋率。结果表明：当海藻酸钠浓度为3％时，制备成的微胶囊粒子最饱满，且包埋效果最佳。

表1海藻酸钠浓度对活菌数和包埋率的影响

海藻酸钠浓度(％)	活菌数(CFU)	包埋率(％)
			1.0％	2.54*108	33.20％
1.5％	2.85*108	37.25％
			2.0％	2.55*108	33.33％
2.5％	2.62*108	36.10％
			3.0％	3.35*108	43.79％

4.不同固定化离子的选取

配制浓度为2％的CaCl₂、ZnCl₂、FeCl₂、MgCl₂溶液，配制50mL 3％的海藻酸钠溶液，添加2％的红糖，与20mL贝莱斯芽胞杆菌NH-1的菌液混合均匀，充分搅拌，用注射器将该混合液注入冷却的上述固定化溶液中，观察微球的形成情况。将制备好的微球称取1g左右，置于PA瓶中，并加入9mL无菌水，连续3d每天取该液体稀释涂布，观察并记录微球中释放的活菌数和包埋率。结果表明：以Ca²⁺制备条件最佳。

5.钙化离子最佳浓度的优化

配制1％、1.5％、2％、3％的CaCl₂溶液，配制50ml 3％的海藻酸钠凝胶液，添加2％的红糖，与20mL的贝莱斯芽胞杆菌NH-1菌液混合均匀，充分搅拌，用注射器将该混合液注入冷却的上述固定化溶液中，观察微球的形成情况。将制备好的微球称取1g左右，置于PA瓶中，并加入9mL无菌水，连续3d每天取该液体稀释涂布，观察并记录微球中释放的活菌数。结果表明：1.5％的CaCl₂溶液制备微胶囊的效果最佳。

6.最佳菌胶体积比的优化

配制50ml 3％的海藻酸钠溶液，添加2％的红糖，分别与20mL、30mL、40mL的贝莱斯芽胞杆菌NH-1菌液(即菌液与胶液体积比分别为2:5、3:5、4:5)混合均匀，充分搅拌，用注射器将该混合液注入冷却的2％CaCl₂固定化溶液中，观察微球的形成情况。将制备好的微球称取1g左右，置于PA瓶中，并加入9mL无菌水，连续3d每天取该液体稀释涂布，观察并记录微球中释放的活菌数和包埋率。结果表明：菌胶比为2:5时为最佳的体积比。

7.最佳固定化溶液的pH的优化

配制50ml 3％的海藻酸钠凝胶液，添加2％的红糖，与20mL的贝莱斯芽胞杆菌NH-1菌液混合均匀，充分搅拌，用注射器将该混合液注入浓度为2％、pH分别为5.5、6、6.5、7的冷却CaCl₂固定化溶液中，观察微球的形成情况。将制备好的微球称取1g左右，置于已灭菌的PA瓶中，并加入9mL无菌水，连续3d每天取该液体稀释涂布，观察并记录微球中释放的活菌数和包埋率。结果表明：固定化溶液的pH控制在5.5时具有最好的效果。

8.盆栽土壤中细菌定殖量的变化

以最佳优化条件制备的微胶囊菌剂，每盆花盆中埋入微胶囊固体菌剂10g，每g固体菌剂中所含活菌数为3.25*10⁸ CFU。时隔一定时间内用稀释涂布法涂布于含利福平LB固体平板上，检测土壤中的活菌数。结果表明，土壤中的活菌数在4周左右达到峰值，6周时仍能维持在较高水平，说明该菌剂具有缓释效果。

实施例5

2016年10月在河南省新乡市郊区开展大棚试验。以固体发酵的方式发酵菌株贝莱斯芽胞杆菌NH-1 100g，并接种病原菌尖孢镰刀菌按1％接种于2.5L发酵培养基中，37℃，180rpm发酵48h，稀释10倍，贝莱斯芽胞杆菌NH-1的固体发酵物质和病原菌一起混合，将黄瓜苗种子浸泡在混合液中30min，将浸泡过后的种子播种于穴盘内，每个处理播种20盘，每盘40孔。待黄瓜苗种子发芽后，长至尖叶期时，将贝莱斯芽胞杆菌NH-1的固体发酵产物稀释10倍后浇灌，每棵苗浇灌10ml。对照组(CK)种子只接种病原菌。30d后统计黄瓜苗的发病情况。并计算发病率、病情指数、防治效果。结果见表2，贝莱斯芽胞杆菌NH-1对黄瓜枯萎病的防效为66.03％。

表2贝莱斯芽胞杆菌NH-1对黄瓜枯萎病的田间防效

菌株编号	病情指数	防治效果(％)
			CK	92±2.64 a	—
贝莱斯芽胞杆菌NH-1	26±3 b	66.03±0.95

注：不同字母之间有显著性差异(p<0.05)。

病情指数＝Σ[(病情级数×此级株数)/(最高级数×总株数)]×100

防治效果(％)＝(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数×100。

Claims (7)

1.一株抗黄瓜枯萎病的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)NH-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017336。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌NH-1在抗黄瓜枯萎病中的应用。

3.一种抗黄瓜枯萎病的微生物菌剂，其活性成分是权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌NH-1。

4.如权利要求3所述的微生物菌剂，它是将贝莱斯芽胞杆菌NH-1包裹在膜性壁材中得到的微胶囊缓释菌剂。

5.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于：所述膜性壁材是海藻酸钠。

6.一种制备权利要求5所述微生物菌剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将贝莱斯芽胞杆菌NH-1在LB固体培养基中过夜活化后，以0.5～2％的重量比接种于新鲜的LB液体培养基中，于37℃，150～200rpm下培养，收集菌液；

(2)将菌液按1～4∶5的体积比加入到重量浓度为1～5％的海藻酸钠溶液中，充分搅拌后用注射器注入到冷却的pH为5～7、重量浓度为1～3％的金属盐溶液中，搅拌固化，将沉淀用水洗涤，干燥，即得。

7.如权利要求6所述制备微生物菌剂的方法，其特征在于：步骤(2)中，将菌液按2∶5的体积比加入到重量浓度为3％的海藻酸钠溶液中，充分搅拌后用注射器注入冷却的pH为5.5、重量浓度为2％的钙盐溶液中，搅拌固化，将沉淀用水洗涤，干燥，即得。