CN103374536A - 一株枯草芽孢杆菌及其在黄瓜枯萎病防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在黄瓜枯萎病防治中的应用。本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B201，它的保藏编号为CGMCC No.5786。枯草芽孢杆菌B201能有效防治黄瓜苗期枯萎病。枯草芽孢杆菌B201温室生防效果好、实际应用方法简单、易于操作，对黄瓜苗期枯萎病防效可达58.66％。本发明为生防菌防病机制中的诱导抗性与占位抗病等非拮抗性生防机制的研究提供了重的菌株材料，并为保护地黄瓜无公害生产提供菌种资源。本发明对于黄瓜枯萎病，特别是黄瓜苗期枯萎病的防治具有重大价值。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在黄瓜枯萎病防治中的应用

技术领域

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其在黄瓜枯萎病防治中的应用。

背景技术

黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)引起的一种危害严重的土传真菌性病害。

黄瓜枯萎病典型的病症如下：有坏死性病变、茎叶枯萎、根系枯萎等。

黄瓜枯萎病最终导致严重的产量损失。

黄瓜枯萎病在黄瓜的整个生长阶段(从苗期至成熟期)均能发生，在不利的气候及生长条件下更容易发生。黄瓜枯萎病的发病率一般为10％-30％，严重时可达50％，甚至绝收。

尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病不但存在于中国，也是一个全球性的问题。在克里特岛、希腊、美国、以色列、日本、法国、西班牙、韩国和其它地区都有发生过严重的黄瓜枯萎病的事件。

发明内容

本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌及其在黄瓜枯萎病防治中的应用。

本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B201，已于2012年02月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5786。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B201 CGMCC No.5786简称枯草芽孢杆菌B201。

本发明还保护枯草芽孢杆菌B201在黄瓜枯萎病防治中的应用。所述黄瓜枯萎病具体可由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起。所述黄瓜具体可为品种名称为新泰密刺的黄瓜。

本发明还保护一种用于防治黄瓜枯萎病的产品，它的活性成分为枯草芽孢杆菌B201的芽孢悬浮液。所述黄瓜枯萎病具体可由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起。所述黄瓜具体可为品种名称为新泰密刺的黄瓜。所述芽孢悬浮液中的芽孢浓度具体可为1×10⁸CFU ml^-1。所述芽孢悬浮液的制备方法具体如下：将枯草芽孢杆菌B201接种至牛肉膏液体培养基，30℃、200rpm振荡培养6-7天，然后离心(具体条件可5000rpm离心5分钟)收集沉淀(芽孢)，用无菌水悬浮沉淀，得到芽孢浓度为1×10⁸CFU ml^-1的芽孢悬浮液。

枯草芽孢杆菌B201的芽孢悬浮液在黄瓜枯萎病防治中的应用也属于本发明的保护范围。所述黄瓜枯萎病具体可由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起。所述黄瓜具体可为品种名称为新泰密刺的黄瓜。所述芽孢悬浮液中的芽孢浓度具体可为1×10⁸CFU ml^-1。所述芽孢悬浮液的制备方法具体如下：将枯草芽孢杆菌B201接种至牛肉膏液体培养基，30℃、200rpm振荡培养6-7天，然后离心(具体条件可5000rpm离心5分钟)收集沉淀(芽孢)，用无菌水悬浮沉淀，得到芽孢浓度为1×10⁸CFU ml^-1的芽孢悬浮液。

枯草芽孢杆菌B201在生产用于防治黄瓜枯萎病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述黄瓜枯萎病具体可由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起。所述黄瓜具体可为品种名称为新泰密刺的黄瓜。

本发明还保护一种防治黄瓜枯萎病的方法，包括将黄瓜种子用枯草芽孢杆菌B201的芽孢悬浮液进行浸种处理的步骤。所述浸种处理的时间具体可为1小时。所述黄瓜种子可为定殖培养后的黄瓜种子，具体可为定殖培养24小时后的黄瓜种子。所述黄瓜枯萎病具体可由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起。所述黄瓜具体可为品种名称为新泰密刺的黄瓜。所述芽孢悬浮液中的芽孢浓度具体可为1×10⁸CFU ml^-1。所述芽孢悬浮液的制备方法具体如下：将枯草芽孢杆菌B201接种至牛肉膏液体培养基，30℃、200rpm振荡培养6-7天，然后离心(具体条件可5000rpm离心5分钟)收集沉淀(芽孢)，用无菌水悬浮沉淀，得到芽孢浓度为1×10⁸CFU ml^-1的芽孢悬浮液。

以上任一所述黄瓜枯萎病具体可为黄瓜苗期枯萎病。

本发明提供的枯草芽孢杆菌B201能有效防治黄瓜苗期枯萎病。枯草芽孢杆菌B201温室生防效果好、实际应用方法简单、易于操作，对黄瓜苗期枯萎病防效可达58.66％。本发明为生防菌防病机制中的诱导抗性与占位抗病等非拮抗性生防机制的研究提供了重的菌株材料，并为保护地黄瓜无公害生产提供菌种资源。本发明对于黄瓜枯萎病，特别是黄瓜苗期枯萎病的防治具有重大价值。

附图说明

图1为实施例1中构建的菌株B201的系统发育树。

图2为实施例1中菌株B201的Biolog系统鉴定结果。

图3为实施例3中菌株B201与尖孢镰刀菌黄瓜专化型(病原菌)在PDA平板上的拮抗实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Mandeel，Q.，and Baker，R.Mechanisms involvedin biological control of Fusarium of cucumber with strains of nonpathogenicFusarium oxysporum.Phytopathology.1991.81：462-469。

枯草芽孢杆菌菌株B068150(又称菌株B068150，是一株生防菌)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：李丽华，王琦.防治黄瓜枯萎病内生芽孢杆菌的筛选及鉴定[A].第四界中国植物细菌病害学术研讨会论文集.2008，56.。

实施例1、菌株B201的获得和鉴定

一、菌株B201的获得

2011年6月从中国北京市中国农业大学的黄瓜试验田取土壤，采梯度平板稀释法，得到400株纯培养的菌株。其中一株菌对黄瓜枯萎病致病菌的具有良好的生防性质，将该菌株命名为菌株B201。

二、菌株B201的鉴定

1、形态学鉴定和生理生化鉴定

形态学鉴定：包括细胞形状、运动性、是否形成芽孢等。

生理生化鉴定：包括甲基红实验、过氧化氢酶活性、Voges-Proskauer实验、厌氧培养、适合菌株生长的pH、温度和钠盐深度范围等，操作方法参照(Roberts et al.，1994)。除了耐温度实验外其它实验培养温度都为30℃。

菌株B201的形态鉴定结果和生理生化鉴定结果见表1。结果表明，菌株B201是一株革兰氏阳性、产芽孢、具有运动性的杆状细菌，V-P测定为阳性，好氧并且可以利用柠檬酸，并能够快速形成坚固的生物膜。

表1菌株B201的形态鉴定结果和生理生化鉴定结果

2、细胞全脂肪酸分析

利用Sherlock Microbial Identification System(MIS)TSBA6.0系统，参照标准操作方法进行工作(Microbial ID，Newark，DE，USA)。首先收集TSBA培养基上30℃过夜培养的菌体，用气相色谱(model 6850，Agilent)提取菌株B201细胞全脂肪酸，安捷伦毛细管柱型号为19091B-102E(25m×200μm×0.33μm)。进样温度为170℃，终温度为260℃，升温速度为5℃/min。然后以40℃/min的升温速度迅速升至310℃。载气为氮气，流速为0.469mL/min。数据分析与菌种分类通过MIS的数据库进行。

根据细胞脂肪酸分析结果，在基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的TSBA6 6.10和CLIN6 6.10信息库中进行比对。菌株B201的主要脂肪酸为13-甲基十四烷酸(iso-15:0)、12-甲基十四烷酸(anteiso-15:0)、十六酸甲酯(iso-17:0)，，由计算机判别为枯草芽孢杆菌。

3、分子生物学鉴定

16S rRNA的PCR扩增：采用细菌通用引物63F和1378R(Knapp et al.，2009)。反应条件：95℃ 3min；95℃1min，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min。

gyrA基因的PCR扩增：采用文献报道引物p-gyrA-f和p-gyrA-r(Roberts et al.，1994)进行扩增。反应条件：95℃ 3min；95℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。

将扩增得到的的片段连接到pMD19-T载体(Takara Co.Ltd.)，挑取阳性克隆送到北京三博远志生物技术公司进行测序。16S rDNA和gyrA基因序列利用提取的基因组DNA扩增测序后基因序列片段长度分别为1.37kb和1.025kb。16S rDNA如序列表的序列1所示。gyrA基因序列如序列表的序列2所示。

将16S rDNA序列进行BLAST分析，发现与其同源性最好的菌株有Bacillussubtilis subsp.subtilis JCM 10629(99％)和Bacillus licheniformis strain B425(99％)，因此只根据16S rDNA基因无法鉴定菌株B201是哪一种芽孢杆菌。

将gyrA基因拿到GenBank中进行比对分析，与其同源最近的菌株为Bacillussubtilis subsp.subtilis str.168(99％)。与已经发表的其它枯草芽孢杆菌的相似性都在94％以上。用Mega 4.1软件包采用Neighbour-joining法构建系统发育树(见图1)，完整显示枯草芽孢杆菌各亚种间的进化关系。利用gyrA基因可准确地鉴定菌株B201为枯草芽孢杆菌，并能获得B201与已知芽孢杆菌种的亲缘关系。

4、Biolog系统鉴定

挑有菌株B201单菌落的无菌棉签在Biolog试剂盒中的接种液中蘸湿，倾斜接种液管并沿内壁转动棉签，将菌体均匀打散。调整浊度值，使其在相应标准浊度值的5％范围内。将已经调整好浊度的菌液，用100μL的移液枪接种到Biolog鉴定板中，26℃下培养24h、48h和72h。开启鉴定系统，将已经培养好的鉴定板放置到菌种鉴定仪的读数仪上，计算机读取数据。结果见图2。

三、菌株B201的保藏

根据细胞形态、生理生化、16S rRNA，gyrA基因序列分析、细胞全脂肪酸分析核Biolog系统鉴定的结果，菌株B201属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B201，已于2012年02月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5786。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B201CGMCC No.5786简称枯草芽孢杆菌B201。

实施例2、枯草芽孢杆菌B201的芽孢悬浮液的制备

牛肉膏液体培养基(pH7.0-7.2)：由3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g NaCl和1000ml水组成。将枯草芽孢杆菌B201接种至牛肉膏液体培养基，30℃、200rpm振荡培养6-7天，然后离心(5000rpm离心5分钟)，收集沉淀(芽孢)，用无菌水将芽芽孢悬浮，得到芽孢浓度为1×10⁸CFU ml^-1的芽孢悬浮液。

实施例3、枯草芽孢杆菌B201与尖孢镰刀菌黄瓜专化型的对峙培养

实验第1天，分别进行如下两组处理：

第一组：将尖孢镰刀菌黄瓜专化型的PDA菌饼(直径为5毫米×5毫米)放置到PDA平板的中央；

第二组：将尖孢镰刀菌黄瓜专化型的PDA菌饼(直径为5毫米×5毫米)放置到PDA平板的中央，然后分别在菌饼的两边(距菌饼2cm的位置)各滴加1微升实施例2制备的芽孢悬浮液。

每组设置三个重复处理。26℃培养7天。

实验第8天的照片见图3。菌株B201与尖孢镰刀菌黄瓜专化型对峙培养后，没有发现明显的抑菌圈。

实施例4、枯草芽孢杆菌B201在黄瓜枯萎病防治中的应用

实验地点为中国农业大学科学园温室，时间为2008年4月至5月。温室中，白天温度为24-28℃，晚间温度为15-20℃，湿度为60％-80％。黄瓜种子的品种名称为新泰密刺，购自山东省新泰密刺黄瓜种场。

进行如下四组平行处理(营养钵直径为9cm×9cm，每个营养钵种5株，每组设置三个营养钵)：

第一组(实验组1)：将黄瓜种子表面消毒，置于无菌培养皿中(滤纸保湿，两层纱布覆盖)培养至种子露白，然后转移至实施例2制备的芽孢悬浮液中浸泡1小时，再然后转移至无菌培养皿中(滤纸保湿，两层纱布覆盖)定殖培养24小时，再然后转移至尖孢镰刀菌黄瓜专化型孢子悬浮液(用无菌水悬浮尖孢镰刀菌黄瓜专化型，孢子浓度为5×10⁶CFU ml^-1)中浸泡30分钟，再然后转移至灭菌土壤中培养24天；

第二组(实验组2)：将黄瓜种子表面消毒，置于无菌培养皿中(滤纸保湿，两层纱布覆盖)培养至种子露白，然后转移至菌株B068150的芽孢悬浮液(用无菌水悬浮生防菌株B068150的芽孢，芽孢浓度为1×10⁸CFU ml^-1)中浸泡1小时，再然后转移至无菌培养皿中(滤纸保湿，两层纱布覆盖)定殖培养24小时，再然后转移至尖孢镰刀菌黄瓜专化型孢子悬浮液(用无菌水悬浮尖孢镰刀菌黄瓜专化型，孢子浓度为5×10⁶CFU ml^-1)中浸泡30分钟，再然后转移至灭菌土壤中培养24天；

第三组(实验组3)：将黄瓜种子表面消毒，置于无菌培养皿中(滤纸保湿，两层纱布覆盖)培养至种子露白，然后转移至多菌灵溶液(用无菌水溶解多菌灵，多菌灵的浓度为0.01g ml^-1)中浸泡1小时，再然后转移至无菌培养皿中(滤纸保湿，两层纱布覆盖)定殖培养24小时，再然后转移至尖孢镰刀菌黄瓜专化型孢子悬浮液(用无菌水悬浮尖孢镰刀菌黄瓜专化型，孢子浓度为5×10⁶CFU ml^-1)中浸泡30分钟，再然后转移至灭菌土壤中培养24天；

第四组(对照组)：将黄瓜种子表面消毒，置于无菌培养皿中(滤纸保湿，两层纱布覆盖)培养至种子露白，然后继续定殖培养24小时，再然后转移至尖孢镰刀菌黄瓜专化型孢子悬浮液(用无菌水悬浮尖孢镰刀菌黄瓜专化型，孢子浓度为5×10⁶CFU ml^-1)中浸泡30分钟，再然后转移至灭菌土壤中培养24天。

黄瓜枯萎病幼苗期发病的严重度分级标准5级，具体如下：0、植株根茎叶生长正常；1、四分之一以下根茎变黄，植株稍矮化；2、四分之一至二分之一的根茎变黄，下部叶脉褪色；3、二分之一至四分之三的根茎变黄，茎基部纵裂；4、四分之三以上的根茎变黄，或植株直接枯萎死亡。

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100。

防效(％)＝(对照组病情指数-实验组病情指数)/对照组病情指数×100。

结果见表2。枯草芽孢杆菌B201的防效达到了58.66％，菌株B068150的防效达到了50.03％，而多菌灵的防效为59.98％，差异不显著，进一步说明，枯草芽孢杆菌B201在对于黄瓜枯萎病具有较好的防治效果，且防治效果好于菌株B068150。

表2枯草芽孢杆菌B201的盆栽生防效果(数据为三次重复的平均值)

处理	病情指数(％)(P＜0.05)	防效
			第一组	6.89b	58.66
第二组	8.33ab	50.03
			第三组	6.67b	59.98
第四组	16.67a	--

字母不同表示有显著差异。

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B201，它的保藏编号为CGMCC No.5786。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌B201在黄瓜枯萎病防治中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的。

4.用于防治黄瓜枯萎病的产品，它的活性成分为权利要求1所述枯草芽孢杆菌B201的芽孢悬浮液。

5.如权利要求4所述的产品，其特征在于：所述黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的。

6.权利要求1所述枯草芽孢杆菌B201的芽孢悬浮液在黄瓜枯萎病防治中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的。

8.权利要求1所述枯草芽孢杆菌B201在生产用于防治黄瓜枯萎病的产品中的应用。

9.一种防治黄瓜枯萎病的方法，包括将黄瓜种子用权利要求1所述枯草芽孢杆菌B201的芽孢悬浮液进行浸种处理的步骤。

10.如权利要求8所述的应用或如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的。

Images