CN103667132B - 一株蜡样芽孢杆菌及其在提高植物抗旱能力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株蜡样芽孢杆菌，该菌株分类命名为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7069。本发明的蜡样芽孢杆菌L90，可提高核桃的抗干旱能力。经实验研究表明，接种到核桃根系周围，经一定时间的干旱胁迫后，同接种普通促生细菌相比，可显著提高根际土壤的细菌群落结构多样性，提高叶片相对含水量和水分利用效率，增强植物的抗旱能力。因此，本发明的蜡样芽孢杆菌或以其为原料制成的菌制剂可作为接种剂在干旱生境中进行应用，本发明为提高核桃的抗旱能力提供了优良的菌株资源。

Description

一株蜡样芽孢杆菌及其在提高植物抗旱能力中的应用

技术领域

本发明涉及一株蜡样芽孢杆菌及其在提高植物抗旱能力中的应用。

背景技术

当前正在发生的全球环境变化已经、并将继续引起全球水热格局的重新分布，从而将对全球植物产生严重影响。据统计，全球干旱半干旱地区的面积约占陆地面积的35%，我国的干旱半干旱地区，地域辽阔，涉及东北、西北、华北的12个省、市自治区，面积约占全国总面积的52.5%。由此形成的土地荒漠化而使我国成为世界上荒漠化危害严重的国家之一。而干旱瘠薄山地是干旱影响最为严重的地区。这些地区造林成活率低，水土流失严重，因此，提高植物的抗旱能力是提高这些地区造林成活率的关键因素。

PGPR是指生存在植物根圈范围中，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌统称，对植物生长及病害防治有极其重要的作用。目前关于PGPR筛选及应用研究报道很多，大量文献证明，PGPR可改善植物生长的根际土壤生态环境，尤其是促进根际土壤的群落结构多样性，促进植物生长和干物质积累。PGPR菌株筛选及应用的研究很多，比如杨蓉等人发明了一种蜡状芽孢杆菌及其作为番茄枯萎病接抗菌的应用，该细菌兼有促进植物生长和生物防治功能良好的技术效果；胡青平等人发明了一种蜡状芽孢杆菌，可用于番茄早疫病害生物防治；郭长虹等人公开了一种根际促生菌SXH-2及其应用，该细菌可促进磷的吸收，从而起到促植物生长的作用。本申请的发明人已从核桃根际土样中筛选出了一株核桃根际促生乙酸钙不动杆菌X128，保藏编号为CGMCC No.7071，能明显促进核桃生长发育，改善核桃根际土壤的生长环境。该菌株及其应用已获国家发明专利授权，专利号：201310016531.5。然而，干旱生境中，大量微生物不能成活，导致土壤细菌数量大幅减少，群落结构多样性明显降低，从而影响植物根际土壤生长环境，影响植物正常的水分和养分吸收，降低植物的抗旱能力。不同的环境条件，诸如气象、温度、水分、土壤性质或其他土著微生物活力等均会对细菌生长造成影响，在干旱生境中接种一些常用的PGPR对植物抗旱能力影响有限。因此，筛选干旱生境下应用的根际促生细菌，对提高植物的抗旱能力，提高干旱瘠薄本山地的造林成活率，改善生态环境具有重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术，针对我国大面积干旱瘠薄山地未能造林绿化或造林成活率较低，生态、社会、经济效益较差的现状，本发明提供了一株适宜干旱环境中应用的蜡样芽孢杆菌，其在干旱环境中能够有效改善核桃根际土壤环境，提高植物（核桃）的抗旱能力。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株蜡样芽孢杆菌L90，该菌株分类命名为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7069。

所述蜡样芽孢杆菌的菌落特征及菌体形态：蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）L90在LB平板上培养24h后形成有光泽白色菌落，圆形，不透明；表面粗糙，扁平，不规则；菌体细胞大小为(1～1.2)μm×(3～5)μm；产芽孢，G⁺，细胞呈杆状。

所述蜡样芽孢杆菌的生理生化特征：接触酶试验阳性，伏-普试验阳性，葡萄糖产酸阳性，葡萄糖产气阴性，明胶水解试验阳性，淀粉水解试验阳性，柠檬酸盐试验阳性，卵黄卵磷脂酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性。

所述蜡样芽孢杆菌的产吲哚乙酸（IAA）能力测定：将蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）L90接种于LB培养基，28℃，180rpm摇床培养4d。用分光光度法测定菌悬液的OD₆₀₀值，然后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液加入等体积Salkowski(50mL35%HClO₄+1mL0.5M FeCl₃)比色液，避光静置30min，测定其OD₅₃₀值。计算菌浓度OD₆₀₀值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量，通过IAA梯度稀释的标准曲线计算IAA的含量。通过测定，蜡样芽孢杆菌L90产IAA含量为12.17μg/(mL·OD₆₀₀)^-1。

所述蜡样芽孢杆菌的产细胞分裂素能力：向NA培养基中接入L90，37℃，180r/min下摇床培养2d。将培养好的细菌发酵液装入大离心管，4000r/min下离心10min，去掉固相沉淀菌体部分。取上清液再过0.22μm的滤膜即为待上HPLC分析的样品。将玉米素和反式玉米素用甲醇溶解后，配制浓度为50mg/L的标准贮备液，转移到棕色试剂瓶中,置于4℃的冰箱中备用。色谱条件为色谱柱：SupelcosiLC-18-DB(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：甲醇：1%冰醋酸=42：58(V/V)；梯度流速：0.01-12.00min，1mL/min；12.01-25.00min，1.2mL/min；25.01min，1mL/min。检测波长：254nm，柱温：40℃。通过高效液相色谱标准品浓度计算L90产细胞分裂素的能力。通过测定，蜡样芽孢杆菌L90产玉米素和反式玉米素的能力为256.34μg/L和325.172μg/L。

所述蜡样芽孢杆菌的16S rDNA序列分析：将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：L90与Bacillus cereus的相似度达98.9%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，将L90鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

本发明的所述蜡样芽孢杆菌L90，可提高核桃的抗干旱能力。经试验研究表明，接种到核桃根系周围，经一定时间的干旱胁迫后，同接种普通促生细菌相比，可显著提高根际土壤的细菌群落结构多样性，提高叶片相对含水量和水分利用效率，增强植物的抗旱能力。因此，本发明的蜡样芽孢杆菌或以其为原料制成的菌制剂可作为接种剂在干旱生境中进行应用，本发明为提高植物（核桃）的抗旱能力提供了优良的菌株资源。

附图说明

一株蜡样芽孢杆菌L90，该菌株分类命名为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7069，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

一株蜡样芽孢杆菌Z77，该菌株分类命名为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7070，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

图1：不同处理对根际土壤细菌群落结构多样性影响。

图2：不同处理对叶片水分利用效率和相对含水量影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1筛选可提高核桃抗旱能力的菌株

收集相对干旱的林木根际土壤，利用梯度稀释法从各种根际土壤中分离细菌分离物，最终得到359株细菌分离物。将分离出的细菌分离物纯化后编号。挑取单菌落，转接到LB培养基上斜面保存。通过保绿法，结合萝卜子叶增重法得到4株促生效果较好的细菌。进一步通过核桃不同干旱胁迫的盆栽试验，最终确定出一株适宜于干旱生境应用的细菌，其编号为L90，其特性如下：

菌落特征及菌体形态：L90在LB平板上培养24h后形成有光泽白色菌落，圆形，不透明；表面粗糙，扁平，不规则；菌体细胞大小为(1～1.2)μm×(3～5)μm；产芽孢，G⁺，细胞呈杆状。

生理生化特征：接触酶试验阳性，伏-普试验阳性，葡萄糖产酸阳性，葡萄糖产气阴性，明胶水解试验阳性，淀粉水解试验阳性，柠檬酸盐试验阳性，卵黄卵磷脂酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性。

产吲哚乙酸（IAA）能力测定：将L90接种于LB培养基，28℃，180rpm摇床培养4d。用分光光度法测定菌悬液的OD₆₀₀值，然后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液加入等体积Salkowski(50mL35%HClO₄+1mL0.5M FeCl₃)比色液，避光静置30min，测定其OD₅₃₀值。计算菌浓度OD₆₀₀值为1时，单位体积发酵液中IAA的含量，通过IAA梯度稀释的标准曲线计算IAA的含量。通过测定，蜡样芽孢杆菌L90产IAA含量为12.17μg/(mL·OD₆₀₀)^-1。

产细胞分裂素能力：向NA培养基中接入L90，37℃，180r/min下摇床培养2d。将培养好的细菌发酵液装入大离心管，4000r/min下离心10min，去掉固相沉淀菌体部分。取上清液再过0.22μm的滤膜即为待上HPLC分析的样品。将玉米素和反式玉米素用甲醇溶解后，配制浓度为50mg/L的标准贮备液，转移到棕色试剂瓶中,置于4℃的冰箱中备用。色谱条件为色谱柱：SupelcosiLC-18-DB(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：甲醇：1%冰醋酸=42：58(V/V)；梯度流速：0.01-12.00min，1mL/min；12.01-25.00min，1.2mL/min；25.01min，1mL/min。检测波长：254nm，柱温：40℃。通过高效液相色谱标准品浓度计算L90产细胞分裂素的能力。通过测定，蜡样芽孢杆菌L90产玉米素和反式玉米素的能力为256.34μg/L和325.172μg/L。

16S rDNA序列分析：将所测16S rDNA序列（如SEQ ID NO.1所示）与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：L90与Bacillus cereus的相似度达99%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，将L90鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），并进行保藏，保藏日期为：2012年12月31日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7069，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

实验盆栽试验

选择4种不同的植物根际促生细菌，分别为：乙酸钙不动杆菌X128（保藏号：CGMCCNo.7071，简称：X128，记载在公开号为103060241A的专利中）、假单胞菌(Pseudomonas sp.)YT3（菌种保藏号：CGMCC No.5319，记载在公开号为102391972A的专利中）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）Z77（保藏号：CGMCC No.7070，简称：Z77）和本发明的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）L90（简称：L90）。将植物根际促生细菌接入牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH7.0～7.2，以上均为质量百分比），于37℃，180rpm条件下振荡培养2d。发酵液6000r min^-1下离心5min，用无菌生理盐水润洗菌体3次后，无菌生理盐水调节菌悬液（2.0×10⁸cfu/mL）制成接种剂。

盆栽用盆高25cm，宽30cm，每盆装土13kg，选择平均高度55.7±3.4cm，平均地径为0.89±0.04的核桃苗定殖。30d后，取配置好的4种不同菌液10ml，稀释至150ml，分别均匀的浇灌于核桃苗根系周围，然后浇水至田间持水量的80%，同时设置浇灌等量无菌生理盐水试验，正常管理。60d后，开始进行干旱胁迫，控制水分含量为田间持水量的40%左右，将浇灌无菌生理盐水的盆栽苗分为两个处理，其中一个处理进行干旱胁迫（简称：DC），另外一个处理则正常浇水（简称IC）。28d后，测定核桃根际土壤的细菌群落结构多样性、叶片相对含水量、相对电导率和光合特征，并根据光合特征计算水分利用效率，结果如下：

（1）土壤细菌群落结构多样性

如表1、图1所示，干旱胁迫下，核桃根际土壤的Margalef指数（丰富度指数）和Shannon指数（多样性指数）分别降低66.16%和53.98%，而Simpson's指数（优势度指数）增加47.91%。干旱生境下接种不同PGPR对核桃根际土壤的细菌群落结构影响不同。同DC处理相比，L90处理的Margalef指数和Shannon指数分别增加133.25%和88.46%，而Simpson's指数降低34.72%，差异显著。同接种L90处理相比，接种Z77、X128和YT3对核桃根际土壤细菌群落结构影响较小。由此可见，干旱降低了细菌群落结构的多样性，而干旱生境下接种PGPR可提高多样性指数，然而，PGPR的种类是提高多样性指数的关键因素。

表1不同处理对根际土壤细菌群落结构多样性影响

（2）水分利用效率及抗旱能力

叶片相对含水量是反映植物抗干旱能力的重要指标。

干旱可使核桃叶片的水分利用效率有一定程度的提高，但核桃叶片相对含水量在干旱生境下显著降低。在各种干旱处理中，接种L90处理的叶片水分利用效率最高，分别比Z77、X128和YT3提高8.62%、12.68%和11.52%，差异显著（如表2、图2所示）。而干旱生境下接种L90可使叶片相对含水量增加10.29%。同接种Z77、X128和YT3处理相比，接种L90处理的叶片相对含水量显著增加7.17%、9.84和10.88%。可见，干旱生境下接种L90可提高叶片水分利用效率，提高植物的抗旱能力。

表2不同处理对叶片水分利用效率和相对含水量影响

Claims (2)

1.一株蜡样芽孢杆菌，其特征在于：该菌株分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7069。

2.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在提高核桃抗旱能力中的应用。