CN103243055A

CN103243055A - 一株具有荧蒽降解能力的耐盐碱产吲哚乙酸菌及其应用

Info

Publication number: CN103243055A
Application number: CN2013102001803A
Authority: CN
Inventors: 李辉信; 张振; 徐莉; 陈雄; 李伟明; 李方卉; 焦加国; 刘满强; 陈小云; 胡锋
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2033-05-24
Also published as: CN103243055B

Abstract

本发明公开了一株具有荧蒽降解能力的耐盐碱产吲哚乙酸菌及其应用，属于微生物领域，该蜡状芽孢杆菌（Bacillus Cereus ZZ13），于2013年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为蜡状芽孢杆菌（Bacillus Cereus），保藏号CGMCC No.7322。该菌株能高产吲哚乙酸并能耐盐碱生长且能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并对多环芳烃荧蒽具有一定的降解效果。

Description

一株具有荧蒽降解能力的耐盐碱产吲哚乙酸菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物，说涉及一株具有荧蒽降解能力的耐盐碱产吲哚乙酸菌及其应用。

背景技术

在土壤中许多微生物能够溶解难溶态磷，促进植物对磷的吸收，增加作物产量和改善作物品质，将解磷微生物作为生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，节肥增产，而且可改善土壤结构，提高土壤有机质含量。植物促生菌(Plant Growth Promoting Bacteria，简称PGPB)被界定为在一定条件下有利于植物生长的自由生活在土壤、根际、根表、叶际的细菌。这些细菌能够固氮、溶磷、溶铁，并产生植物激素，如生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯。此外，它们还能提高植物的抗逆性，包括干旱、高盐碱、重金属和有机污染物毒害。但现在大部分植物促生菌还未被驯化成能有效提高植物各种抗逆性的菌株，因此从植物根际土中分离得到能有效提高植物各种抗逆性的植物促生菌成为热点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种蜡状芽孢杆菌，能高效产吲哚乙酸并能在高盐碱条件生长且能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并对多环芳烃荧蒽具有一定的降解效果。

本发明的目的可通过如下技术方案实现；

本发明的一种蜡状芽孢杆菌（Bacillus Cereus ZZ13），于2013年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为蜡状芽孢杆菌（Bacillus Cereus），保藏号CGMCC No.7322。

所述蜡状芽孢杆菌菌落较小为淡黄色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，不规则杆状排列，产芽孢。

所述蜡状芽孢杆菌的生理生化特性是：革兰氏阳性，严格好氧，化能异养，接触酶阳性，M.R和VP试验阴性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐利用阴性。

本发明所述的蜡状芽孢杆菌培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、谷氨酸；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖；使用的无机组分包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水合硫酸亚铁。本发明的蜡状芽孢杆菌发酵可在20～35℃，pH6～10的环境下进行。

本发明所述的蜡状芽孢杆菌分泌吲哚乙酸（IAA）的能力强，在30℃、180r/min摇床培养条件下24h其转化IAA能力达46.67μg.mL^‐1。吲哚乙酸是植物激素的一种，能够促进根的发育。产吲哚乙酸的菌种，往往附着在植物根系或叶表面，利用植物代谢产生分泌物的同时产生IAA和少量GA₃等植物激素来影响植物的生理过程和形态变化。表现为直接促进根的伸长，从而增大了与土壤中营养物质的接触的机会；可提高植物体内源IAA的含量；诱导植物防卫基因的表达，提高植物体抗病，抗旱等抗逆性。作为本发明的优化方案，所述蜡状芽孢杆菌的发酵在温度为28℃、pH6～10下进行，该环境下产IAA量最高。

作为本发明的进一步优化，所述蜡状芽孢杆菌采用的碳源为甘露醇，采用的氮源为酵母粉或蛋白胨或两者的组合。利用上述碳源和氮源制得的培养基，培育出的蜡状芽孢杆菌产IAA的量最高。

本发明所述的蜡状芽孢杆菌可以在高盐碱度条件下进行生长并产IAA。在实验室摇瓶条件下，所述蜡状芽孢杆菌可以在pH为10.5的条件下生长且产IAA，并可以在LB培养基含盐度为7%的条件下生长，在含盐度为4%时可产IAA。

本发明所述的蜡样芽孢杆菌以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。在实验室摇瓶条件下，所述蜡状芽孢杆菌对磷酸三钙的转化量达148.09mg.L^‐1。相对于空白对照的结果，所述蜡状芽孢杆菌对磷酸三钙的转化量比空白对照高出110.66mg.L^‐1。

本发明所述的蜡样芽孢杆菌多环芳烃荧蒽具有一定的降解效果。在实验室摇瓶条件下，所述蜡状芽孢杆菌在荧蒽初始浓度为50mg.L^‐1的无机盐培养基条件下培养7d后降解率为18.89%，有一定的降解效果。

有益效果：本发明的一种蜡状芽孢杆菌能能高产吲哚乙酸并能耐盐碱生长且能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并对多环芳烃荧蒽具有一定的降解效果，可用于制备生物肥料。

附图说明

图1是本发明菌株ZZ13的菌落图

图2表示ZZ13菌株对难溶性磷的利用情况

图3表示不同装液量对菌株ZZ13产IAA的影响

图4表示不同初始pH对ZZ13菌株产IAA的影响

图5表示不同碳源对菌株ZZ13产IAA的影响

图6表示不同氮源对ZZ13菌株产IAA的影响

图7表示不同含盐度对ZZ13菌株产IAA的影响

图8表示ZZ13菌株对多环芳烃荧蒽的降解效果

生物材料保藏信息

蜡状芽孢杆菌ZZ13，分类命名为蜡状芽孢杆菌Bacillus Cereus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年3月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.7322。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1

首先准备以下三种培养基。

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0‐7.2，121℃灭菌，20min。

LB液体培养基：不加琼脂，其它条件同上。

无机磷细菌培养基（PKO培养基）：磷酸三钙5g，葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，七水合硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，pH7.0琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2。121℃灭菌，20min。

无机盐培养基：硫酸铵2.0g；磷酸二氢钠0.5g；磷酸氢二钾0.5g；七水硫酸镁0.2g；二水氯化钙0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃灭菌，20min。

将从南京紫金山脚采取的植物根际土挑根过筛后称取10g置于盛有100ml灭菌水的250ml的三角瓶中，在摇床中，30℃，150r.min^‐1振荡20min，静置10min，得到土壤悬浮液。该土壤悬浮液中含有若干种促生菌，采用稀释法稀释后涂于LB培养基，将平板倒置，于30℃，恒温箱中培养24h后，挑取不同类型典型单个菌落，经平板纯化后，4℃保存在LB斜面待用。

下面再通过定性测定和定量测定筛选出可分泌吲哚乙酸的细菌。

定性测定：将分离纯化后的细菌接种于含有L‐色氨酸（200mg/L）的LB液体培养基，30℃，180r.min^‐1摇床培养1d。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液（50mL35%HClO₄+1mL0.5M FeCl₃）。将加入50μL50mg/L吲哚乙酸的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌吲哚乙酸。

定量测定：对初筛获得的分泌IAA的细菌进行定量测定，培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液的OD₆₀₀值，然后将菌悬液以10000r.min^‐1离心10min取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，测定其OD₅₃₀值。计算菌浓度OD₆₀₀值为1时，单位体积发酵液中吲哚乙酸的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的吲哚乙酸梯度稀释制备。

把得到的产IAA菌进行溶磷情况的筛选测定，将供试菌株接种于盛有30mL无机磷细菌液体培养基的150mL三角瓶，30℃，180r.min^‐1培养4d后，将培养液装入离心管4℃下10000r.min^‐1离心，15min。取上清液用钼蓝比色法测定有效磷含量。

通过以上测定即筛选出一株高产吲哚乙酸且溶磷能力强的菌株，如图1所示，该菌株形成的菌落为较小淡黄色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，不规则杆状排列，产芽孢，株型命名为ZZ13。该菌株在实验室摇瓶条件下，所述蜡状芽孢杆菌对磷酸三钙的转化量达148.09mg·L^‐1。相对于空白对照的结果，所述蜡状芽孢杆菌对磷酸三钙的转化量比空白对照高出110.66mg.L^‐1（图2）。

将上述方法筛选分离出的菌株，经上海英俊生物工程有限公司测序，根据16SrDNA的测序结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16S rDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与ZZ13的序列用MEGA version3软件构建ZZ13的16SrDNA系统进化树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为蜡状芽孢杆菌（BacillusCereus），同源性为99%。将该菌株于2013年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.7322。

实施例2

好氧性试验

把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的菌ZZ13（CGMCC No.7322），穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底）。30℃培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。

过氧化氢酶的测定

在干净载玻片上滴1滴3%H₂O₂，取18～24h的LB斜面培养物1环，在H₂O₂中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。

甲基红试验（M.R试验）

a.培养基及试剂：蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调节pH7.0～7.2，分装试管，每管装4～5mL，121℃灭菌20min。试剂：甲基红0.1g，95%酒精300mL，蒸馏水200mL。

b.菌种培养及结果观察接种菌株于上述培养液中，30℃培养l～2天。在培养液中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性（甲基红变色范围4.4红色～6.0黄色）。

乙酞甲基甲醇试验（VP试验）

a.培养基培养基同甲基红试验。

b.菌种培养及结果观察接种与培养同甲基红试验。做VP试验时，取培养液（约2mL）和等量的40%NaOH相混合，加少量肌酸，充分振荡2～5min后，如培养液出现红色，即为VP阳性。

淀粉水解试验

a.培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃灭菌20min备用。路哥氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，先用少量（3～5mL）蒸馏水溶解碘化钾，现加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀释至300mL。

b.菌种培养及结果观察取菌种点接于平板上，30℃培养2～4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。

明胶水解试验

a.培养基及试剂蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。调节pH7.2～7.4，分装试管，培养基高度约为4～5cm，121℃灭菌20min。

b.菌种培养及结果观察用穿刺法接种在试管中央。在30℃温箱中培养一个月，观察明胶是否液化。

硝酸盐还原试验

a.培养基及试剂蛋白胨10g，KNO₃1g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.4。格里斯氏（Gries）试剂：A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10%左右）150mL；B液：蔡胺0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸（10%左右）150mL。二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于l00mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。

b.菌种培养及结果观察将试验菌接种于硝酸盐液体培养基中，30℃培养1、3、5天。在白色瓷盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴1滴试剂A和B液，当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性，否则为阴性。

柠檬酸盐的利用

a.培养基及试剂柠檬酸钠2g，NaCl5g，MgSO₄.7H₂O0.2g，(NH₄)₂.HPO₄1g，1%澳百里香酚蓝水溶液10mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8‐7.0，121℃灭菌20min。

b.菌种培养及结果观察取幼龄菌种接种于斜面上，30℃培养3‐7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性。

表1蜡状芽孢杆菌ZZ13（CGMCC No.7322）生理生化特征

+：阳性反应positivereaction；‐：阴性反应negativereaction

实施例3

为了进一步验证实施例1得到的蜡状芽孢杆菌ZZ13（CGMCC No.7322）产吲哚乙酸的能力和最适条件，下面针对不同pH、装液量、不同碳源、不同氮源探索对吲哚乙酸产量的影响。

将含有L‐色氨酸(200mg/L)LB液体培养基按15ml，30ml，45ml，60ml，75ml，90ml装于150mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的ZZ13后，置于30℃，180r.min^‐1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图2所示，由于菌株ZZ13是好氧代谢，通气量影响菌株产IAA的效率，15mL装液量时，菌株产IAA量最多，之后随着装液量增大，产量越少。

将含有L‐色氨酸(200mg/L)的LB培养基分别调节到不同的pH（4、5、6、7、8、9、10），取30mL装于150mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的ZZ13后，置于30℃，180r.min^‐1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量，结果如图3所示，表明pH为4和5时不产IAA，在强酸环境中，菌体无法进行生长代谢，在pH为6～9时有较强产IAA能力，在pH为10时也能稳定IAA，有较强的耐碱能力。该菌种高产IAA的最适pH为6～10。

在含有L‐色氨酸(200mg/L)无机盐培养基中分别加入1%（w/v）的碳源，碳源有葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖等，取30ml装于150ml的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的ZZ13后，置于30℃，180r.min^‐1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图4所示，该菌株在供给甘露醇时，产IAA的能力最强，其次是蔗糖，麦芽糖的利用率最低，几乎不产IAA。

在含有L‐色氨酸(200mg/L)无机盐培养基(不包括硫酸铵)中分别加入0.1%（w/v）的氮源，氮源包括硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、酵母粉、谷氨酸等，取30ml装于150ml的三角瓶中按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的ZZ13后，置于30℃，180r.min^‐1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图5所示，说明取酵母粉为氮源时，产IAA的量最多。

将含有L‐色氨酸(200mg/L)LB液体培养基（不含NaCl）分别调节到不同的含盐度（1%、2%、3%、4%、5%、7%、9%），取30mL装于150mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的ZZ13后，置于30℃，180r.min^‐1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量，结果如图6所示，表明ZZ13生长状况都随着含盐度的增加而变差，至含盐度为9%时几乎不能生长，其产IAA含量的区间为1%～4%，产量变化不大。该菌株有较强的耐盐能力。

为了进一步验证得到的蜡状芽孢杆菌ZZ13对强碱条件的适应，在更强的碱性条件下培养菌株，通过其生长状况和产IAA能力来探索该菌的耐强碱能力。将含有L‐色氨酸(200mg/L)LB液体培养基分别调节到不同的pH（10、10.5、11、11.5、12），取30mL装于150mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的ZZ13后，置于30℃，180r.min^‐1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量，得到表2。如表2所示，ZZ13在pH为10.5时生长良好并能稳定产IAA，至pH为11时几乎不能生长也不能产IAA，之后更不能生长也不能产IAA。

表2

实施例4

本发明对多环芳烃具有一定的降解效果，下面通过实验室摇瓶实验进行说明。

准备以下培养基：

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH7.0‐7.2，121℃灭菌，20min。

将ZZ13（CGMCC No.7322）菌株接种于LB液体培养基，在30℃、180r/min条件下培养24h获得种子液，从种子液中接种1%制成发酵液，发酵液在相同条件下培养24h后收集菌液在10000r/min、10min、30℃条件下离心，并用pH=7.0、0.05mol/L磷酸缓冲液洗涤三次后转入以荧蒽为唯一碳源的无机盐培养基中，荧蒽的初始浓度为50mg/L，在30℃、180r/min的条件中培养7d。再将所得培养液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，取上层有机相旋转蒸发，用甲醇定容后采用HPLC定量测量结果。

通过以上测定，该菌株在实验室摇瓶条件下，ZZ13（CGMCC No.7322）对荧蒽的降解量为11.67mg/L，相对于空白对照的结果，所述蜡状芽孢杆菌对荧蒽的降解率为18.89%，有一定的降解效果（图8）。

Claims

1.一株具有荧蒽降解能力的耐盐碱蜡状芽孢杆菌（Bacillus Cereus）ZZ13，于2013年3月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.7322。

2.权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌（Bacillus Cereus）ZZ13在降解多环芳烃荧蒽中的应用。

3.权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌（Bacillus Cereus）ZZ13在制备生物肥料中的应用。