CN102747017B - 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业微生物领域，公开了一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。根际促生菌JX1，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5624。所述根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）能高产吲哚乙酸并能利用难溶性含钾硅酸盐为钾源进行生长，因此解淀粉芽孢杆菌JX1可在促进植物生长中应用。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物领域，涉及一种解淀粉芽孢杆菌及应用。
背景技术
潮土是河流沉积物受地下水运动和耕作活动影响而形成的土壤，因有夜潮现象而得名。在中国，多分布于黄河中、下游的冲积平原及其以南江苏、安徽的平原地区和长江流域中、下游的河、湖平原和三角洲地区。潮土分布区地势平坦，土层深厚，水热资源较丰富，造种性广，是我国主要的旱作土壤，盛产粮棉。但潮土分布面积最大的黄淮海平原，旱涝灾害时有发生，尚有盐碱危害，加之土壤养分低或缺乏，大部分属中、低产土壤，作物产量低而不稳。必须加强潮土的合理利用与改良。
根际促生菌(Plant Growth Promoting Bacteria，简称PGPB)被界定为在一定条件下有利于植物生长的自由生活在土壤、根际、根表、叶际的细菌。这些细菌能够固氮、溶磷、溶铁，并产生植物激素，如生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯。此外，它们还能提高植物的抗逆性，包括干旱、高盐、重金属毒害和农药。因此从潮土中分离得到根际促生菌，和作物形成共生体系，利用生物修复改善潮土，成为当前研究的热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种一种解淀粉芽孢杆菌。
本发明的另一个目的是提供该解淀粉芽孢杆菌的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
根际促生菌JX1，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5624。
根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，不规则杆状排列，产芽孢。
根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）的生理生化特性是：革兰氏阳性，兼性厌氧，化能异养，接触酶阳性，M.R试验阳性，VP试验阴性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐利用阳性。
根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、丙氨酸、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、尿素；使用的主要碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖；使用的无机组分包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。解淀粉芽孢杆菌JX1（CGMCC No.5624）发酵可在28~32℃，pH5~9的环境下进行。
所述的保藏号为CGMCC No.5624的解淀粉芽孢杆菌JX1在促进植物生长中的应用。
所述的植物优选花生。
所述根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）能高产吲哚乙酸并能利用难溶性含钾硅酸盐为钾源进行生长。
所述的保藏号为CGMCC No.5624的解淀粉芽孢杆菌JX1在花生栽培中的应用。
本发明所述的根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）分泌吲哚乙酸（IAA）的能力强，达30.60μg·mL-1。吲哚乙酸是植物激素的一种，能够促进根的发育。产吲哚乙酸的菌种，往往附着在植物根系或叶表面，利用植物代谢产生分泌物的同时产生IAA和少量GA3等植物激素来影响植物的生理过程和形态变化。表现为直接促进根的伸长，从而增大了与土壤中营养物质的接触的机会；可提高植物体内源IAA的含量；诱导植物防卫基因的表达，提高植物体抗病，抗旱等抗逆性。作为本发明的优化方案，所述根际促生菌JX1的发酵在pH8~9下进行，该环境下产IAA量最高。
作为本发明的进一步优化，所述根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）采用的碳源为乳糖，采用的氮源为酵母粉或蛋白胨或两者的组合。利用上述碳源和氮源制得的培养基，培育出的根际促生菌产IAA的量最高。
本发明所述的根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）以难溶性含钾硅酸盐为钾源进行生长，并将其转化为可溶性钾盐。在实验室摇瓶条件下，所述根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）对钾长石粉的转化量达到14.23mg·L-1。说明JX1菌对钾长石粉具有溶解作用，以难溶性含钾硅酸盐为钾源进行生长，并将其转化为可溶性钾盐。
将菌株JX1点接于无氮培养基平板，能够生长，其可能具有一定的自生固氮能力。
有益效果：本发明提供的根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）高产吲哚乙酸，可有效将难溶性含钾硅酸盐转化为可溶性钾盐，提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，增加土壤有效钾含量；本发明针对花生具有良好的促生长效果，高产的吲哚乙酸促进花生的生长发育，土壤有效钾含量的提高也使得花生对钾肥的利用率更高。
附图说明
图1是本发明菌株JX1的菌落图；
图2表示不同装液量对菌株JX1产IAA的影响；
图3表示不同初始pH对JX1菌株产IAA的影响；
图4表示不同碳源对菌株JX1产IAA的影响；
图5表示不同氮源对JX1菌株产IAA的影响；
图6表示菌株JX1对难溶性含钾硅酸盐的利用情况；
图7表示种植花生30天后接种JX1菌株对花生地上部鲜重的影响；
图8表示种植花生30天后接种JX1菌株对花生植株株高的影响；
图9表示种植花生30天后接种JX1菌株对花生植株全氮含量的影响；
图10表示种植花生30天后接种JX1菌株对花生植株全钾含量的影响；
图11表示种植花生30天后接种JX1菌株对花生根总长度的影响；
图12表示种植花生30天后接种JX1菌株对花生根表面积的影响；
图13表示种植花生30天后接种JX1菌株对花生根平均直径的影响；
图14表示种植花生30天后接种JX1菌株对花生根尖数的影响；
图15表示种植花生30天后接种JX1菌株对土壤IAA含量的影响；
图16表示种植花生30天后的土壤矿质氮含量；
图17表示种植花生30天后的土壤速效钾含量。
生物材料保藏信息
根际促生菌JX1，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5624。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
实施例1
首先准备以下三种培养基。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，121℃灭菌，20min。
LB液体培养基：不加琼脂，其它条件同上。
液态解钾细菌培养基：蔗糖10.0g，酵母膏0.5g，（NH4）2SO4 1.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCO3 1.0g，钾长石粉1.0g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌，20min。
固氮能力采用Ashby无氮培养基：甘露醇10g，KH2PO4 0.2g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.2g，K2SO40.3g，CaCO3 5g，蒸馏水1000mL，Agar 15g，121℃灭菌，20min。
无机盐培养基：硫酸铵2.0g；磷酸二氢钠0.5g；磷酸氢二钾0.5g；七水硫酸镁0.2g；二水氯化钙0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃灭菌，20min。
将从南京板桥镇采取的潮土称取10g置于盛有100ml灭菌水的250ml的三角瓶中，在摇床中，30℃，150r·min-1振荡20min，静置10min，得到土壤菌悬浮液。该土壤菌悬浮液中含有若干种根际促生菌，采用稀释法稀释后涂于LB培养基，将平板倒置，于30℃，恒温箱中培养24h后，挑取不同类型典型单个菌落，经平板纯化后，4℃保存在LB斜面待用。
下面再通过定性测定和定量测定筛选出可分泌吲哚乙酸的植物促生细菌。
定性测定：将分离纯化后的细菌接种于含有L-色氨酸（100mg/L）的LB液体培养基，30℃，180r·min-1摇床培养1d。取50μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50μL Salkowski比色液（50mL35％HClO4+1mL0.5M FeCl3）。将加入50μL50mg/L吲哚乙酸的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌吲哚乙酸。
定量测定：对初筛获得的分泌IAA的细菌进行定量测定，培养条件同上。首先用分光光度法测定菌悬液的OD600值，然后将菌悬液以10000r·min-1离心10min取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积发酵液中吲哚乙酸的含量。标准曲线的绘制采用分析纯的吲哚乙酸梯度稀释制备。
把通过定性、定量测定得到的产IAA菌进行解钾情况的筛选测定，将供试菌株接种于盛有50mL液态解钾细菌培养基的250mL三角瓶，30℃，200r·min-1培养72h后，取培养72h的培养液20mL，6000r/min离心20min，取上清液用火焰分光光度计测定其中K+含量。
通过以上测定筛选出一株高产吲哚乙酸，解钾能力强的菌株，命名为JX1。如图1所示，该菌株形成的菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，不透明，不规则杆状排列，产芽孢。如图6所示，菌株JX1以难溶性含钾硅酸盐为钾源进行生长，并将其转化为可溶性钾盐。在实验室摇瓶条件下，所述根际促生菌JX1对钾长石粉的转化量达到14.23mg·L-1。说明JX1菌对钾长石粉具有溶解作用，以难溶性含钾硅酸盐为钾源进行生长，并将其转化为可溶性钾盐。
将上述方法筛选分离出的菌株，经上海英俊生物工程有限公司测序，根据16SrDNA的测序结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16S rDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与JX1的序列用MEGA version3软件构建JX1的16SrDNA系统进化树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），同源性为85％。将该菌株于2011年12月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.5624。
该菌种呈革兰氏阳性、产芽孢的不规则杆状。菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润。兼性厌氧，化能异养。最适生长温度为30℃。接触酶阳性，硝酸盐还原阳性。分泌IAA能力强，达到30.60μg·mL-1，以难溶性含钾硅酸盐为钾源进行生长，并将其转化为可溶性钾盐，具有固氮能力。
实施例2
好氧性试验
把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的菌株JX1（CGMCC No.5624），穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底）。30℃培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。试验结果表现，菌株JX1（CGMCC No.5624）菌落沿琼脂柱表面生长，穿刺线内也有菌落生长，为兼性厌氧。
过氧化氢酶的测定
在干净载玻片上滴1滴3％H2O2，取18~24h培养的菌株JX1（CGMCC No.5624）LB斜面培养物1环，在H2O2中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。试验结果显示菌株JX1（CGMCC No.5624）为接触酶阳性。
甲基红试验（M.R试验）
a.培养基及试剂蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调节pH7.0~7.2，分装试管，每管装4~5mL，121℃灭菌20min。试剂：甲基红0.1g，95％酒精300mL，蒸馏水200mL。
b.菌种培养及结果观察接种菌株JX1（CGMCC No.5624）于上述培养液中，30℃培养1~2天。在培养液中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性（甲基红变色范围4.4红色~6.0黄色）。
试验结果显示菌株JX1（CGMCC No.5624）为M.R阳性。
乙酞甲基甲醇试验（VP试验）
a.培养基培养基同甲基红试验。
b.菌种培养及结果观察接种与培养同甲基红试验。做VP试验时，取培养液（约2mL）和等量的40％NaOH相混合，加少量肌酸，充分振荡5min后，如培养液出现红色，即为VP阳性。
试验结果显示菌株JX1（CGMCC No.5624）为VP阴性。
淀粉水解试验
a.培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2％的可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃灭菌20min备用。路哥氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，先用少量（3~5mL）蒸馏水溶解碘化钾，现加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀释至300mL。
b.菌种培养及结果观察取JX1菌种（CGMCC No.5624）点接于平板上，30℃培养3天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。
试验结果显示菌株JX1（CGMCC No.5624）为淀粉水解阳性。
明胶水解试验
a.培养基及试剂蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。调节pH7.2~7.4，分装试管，培养基高度约为4~5cm，121℃灭菌20min。
b.菌种培养及结果观察用穿刺法接种菌株JX1（CGMCC No.5624）在试管中央。在30℃温箱中培养一个月，观察明胶是否液化。
试验结果显示菌株JX1（CGMCC No.5624）为明胶水解阳性。
硝酸盐还原试验
a.培养基及试剂硝酸盐液体培养基：蛋白胨10g，KNO31g，蒸馏水1000mL，pH7.0~7.4。格里斯氏（G ries）试剂：A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸（10％左右）150mL；B液：蔡胺0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸（10％左右）150mL。二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100mL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。
b.菌种培养及结果观察将菌株JX1（CGMCC No.5624）接种于硝酸盐液体培养基中，30℃培养1、3、5天。在白色瓷盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴1滴试剂A和B液，当培养液变为粉红色、玫瑰红色、橙色或棕色等时，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性，否则为阴性。
试验结果菌株显示JX1（CGMCC No.5624）为硝酸盐还原阳性。
柠檬酸盐的利用
a.培养基及试剂柠檬酸钠2g，NaCl 5g，MgSO4·7H2O 0.2g，(NH4)2·HPO4 1g，1％澳百里香酚蓝水溶液10mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8-7.0，121℃灭菌20min。
b.菌种培养及结果观察取培养12h左右的JX1菌种（CGMCC No.5624）接种于斜面上，30℃培养3-7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性。
柠檬酸盐利用的试验结果显示菌株JX1（CGMCC No.5624）为阳性。
实施例3
为了进一步验证实施例1得到的根际促生菌JX1（CGMCC No.5624）产吲哚乙酸的能力和最适条件，下面针对不同pH、装液量、不同碳源、不同氮源探索对吲哚乙酸产量的影响。
将含有L-色氨酸(100mg/L)LB液体培养基按25ml，50ml，75ml，100ml，150ml装于250mL的三角瓶中，按1％（v/v）接种量接种处于对数生长期的JX1（CGMCC No.5624）后，置于30℃，180r.min-1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图2所示，由于菌株JX1（CGMCC No.5624）是兼性厌氧代谢，通气量影响菌株产IAA的效率，150mL装液量时，菌株产IAA量最多，之后随着装液量减少，产量越少。
将含有L-色氨酸(100mg/L)的LB培养基分别调节到不同的pH（4、5、6、7、8、9、10），取150mL装于250mL的三角瓶中，按1％（v/v）接种量接种处于对数生长期的JX1（CGMCCNo.5624）后，置于30℃，180r·min-1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量，结果如图3所示，表明pH为4和10时不产IAA，在强酸强碱环境中，菌体无法进行生长代谢，菌种在微碱环境中产IAA多于酸性环境，该菌种高产IAA的最适pH为7~9。
在含有L-色氨酸(100mg/L)无机盐培养基中分别加入1％（w/v）的碳源，碳源有葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖，取150ml装于250ml的三角瓶中，按1％（v/v）接种量接种处于对数生长期的JX1（CGMCC No.5624）后，置于30℃，180r·min-1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图4所示，该菌株在供给乳糖时，产IAA的能力最强，其次是果糖，葡萄糖的利用率最低，几乎不产IAA。
在含有L-色氨酸(100mg/L)无机盐培养基(不包括硫酸铵)中分别加入0.1％（w/v）的氮源，氮源包括硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、酵母粉、丙氨酸、尿素等，取150ml装于250ml的三角瓶中按1％（v/v）接种量接种处于对数生长期的JX1（CGMCC No.5624）后，置于30℃，180r·min-1摇床培养24h，按定量测定的方法测定产IAA的量。结果如图5所示，说明取蛋白胨为氮源时，产IAA的量最多，其次是酵母粉，不利用尿素。
实施例4
本发明菌株JX1（CGMCC No.5624）对花生具有明显促生长作用，下面通过盆栽试验进行说明。
采集自然条件下潮土0~20cm土层的新鲜土壤，过5mm筛，每盆装土200g，种植花生，调节含水量至田间最大持水量的60％，30天后采样，用根系扫描仪（LA1600+scanner，Canada）扫描获得根系图像后，用根系分析软件（Winrhizo2003b，Canada）进行相关根系指标分析，用HPLC法测定土壤IAA含量，并测定土壤矿质氮，速效钾含量，植株鲜重，株高以及全氮全钾含量。
花生种子：花生种子进行20％双氧水表面消毒20min，无菌水冲洗多次，催芽2d，选取发芽一致的种子备用。
接菌处理：将本发明的JX1（CGMCC No.5624）接种于LB液体培养基，30℃，180r·min-1摇床培养，培养菌长至对数生长期，然后将菌悬液10000r·min-1离心10min，再用无菌水重悬，同样操作重复三次，并将菌悬液均匀喷施于土壤中，接种量为108CFU·g-1（即每克干土接种108CFU JX1）。
对照处理：作为对照，土壤不喷洒JX1菌液，加等量无菌水。
结果如图7-17所示。由图7及图8可以看出，接种了JX1（CGMCC No.5624）土壤生长出的花生植株的地上部鲜重，及株高较CK都有较明显的增长趋势；由于JX1（CGMCC No.5624）具有固氮解钾的作用，使土壤中矿质氮及速效钾含量增加（图16，图17），从而促进了植物对N,K等元素的吸收（图9，图10），从图11-14可以看出，接种JX1处理与不接菌处理进行对比，花生根系总长度，根表面积，根平均直径和根尖数都显著增加，促进了花生根系的发育；从图15可以看出，经接菌处理后，土壤IAA含量显著增加，比对照组高出2倍左右。结合以上结果可以看出，本发明的根际促生菌JX1对根基的生长、发育具有明显效果，IAA产量高，可以有效促进作物生长发育。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种根际促生菌JX1，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5624。
2.权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.5624的根际促生菌JX1在促进花生生长中的应用。
3.权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.5624的根际促生菌JX1在花生栽培中的应用。
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