CN108017447A

CN108017447A - 制备解淀粉芽孢杆菌发酵肥料的方法及其肥料的应用

Info

Publication number: CN108017447A
Application number: CN201711303070.4A
Authority: CN
Inventors: 李莉玲; 赵露露; 梁振贤; 王艳; 潘韵
Original assignee: Henan Yihong Shancheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Henan Yihong Shancheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2018-05-11

Abstract

本发明公开了一种制备解淀粉芽孢杆菌发酵肥料的方法及其肥料的应用；通过对解淀粉芽孢杆菌进行诱变，筛选出能够代谢出大量吲哚乙酸的菌株，经固体发酵生产出微生物固态肥料产品。此产品对植物具有不同程度的促生长等作用，尤其是对花生和玉米的促生长更为明显，同时其作为固态肥料施用时，也可起到防止土壤结块并有效预防花生根腐病；利用固态肥料进行进一步加工得到的液体肥料，对造成根腐病的尖镰孢菌和串珠镰孢菌有明显的抑菌作用，同时对种子有促发芽生长作用；本发明的制备方法有效地保存活菌数量和产品中富含的生物活性物质，同时有效地避免了肥料中有效营养成分的流失。

Description

制备解淀粉芽孢杆菌发酵肥料的方法及其肥料的应用

技术领域

本发明涉及一种制备解淀粉芽孢杆菌发酵肥料的方法及其肥料的应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术

近百年来，化肥的施用对农业生产做出了巨大的贡献。但长期过分依赖化学肥料和农药，造成大量不可再生能源的浪费，农田有机质不足，土壤板结，肥力下降，农作物品质降低，食品和地下水等环境污染状况日趋严重。随着生态农业和绿色食品生产的兴起和发展，固态肥料逐渐引起人们的重视。固态肥料通常指含有活性微生物的肥料产品，当施用于种子、植物表面或土壤中时，能够定殖在植物根际周围或寄生于植物内，通过增加营养供应或提高植物吸收营养的能力来促进植株的生长。

目前，市面上的固态肥料产品虽然很多，但其效果良莠不齐。并且市面上的固态肥料价格普遍较高，其经济效果相比化学肥料，还远远不够。

花生根腐病由半知菌亚门的镰刀菌侵染所引起。包括尖镰孢菌、茄类镰孢菌、粉红色镰孢菌、三隔镰刀菌和串珠镰孢菌5个菌种，它们都可产生无性态的小孢子、大孢子和厚垣孢子。小孢子卵圆形至椭圆形，无色，多为单胞，大小2-3微米×5-12微米。大孢子镰刀形或新月形，具3-5个分隔。厚垣孢子近球形，单生或串生，直径7-11微米。病菌习居土壤中，在土中能存活数年，属维管束寄生菌，可堵塞导管和分泌毒素而使植株枯萎。

目前预防花生根腐病主要是通过采用化学药剂进行防控，而化学药剂的长期使用，会造成水源土壤污染、生态平衡被破坏、农药残留、次要病害猖獗和使病源微生物产生抗药性等一系列的严重后果。随着人们环保意识的增强，对食品安全问题的重视，以及对生态环境建设，保护生物多样性和农业可持续发展的要求，使得生物防控土传病害成为当前研究和开发的热点。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明公开了一种制备解淀粉芽孢杆菌发酵肥料的方法及其肥料的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种制备解淀粉芽孢杆菌发酵肥料的方法，包括以下步骤：

步骤1）、对解淀粉芽孢杆菌进行诱变，筛选出吲哚乙酸代谢量大于等于75μg/mL的解淀粉芽孢杆菌菌株；

步骤2）、使用筛选出来的解淀粉芽孢杆菌菌株在酵母浸粉胨葡萄糖琼脂培养基上划线，30℃培养48h，然后挑取单克隆接种于酵母浸粉胨葡萄糖液体培养基中30℃培养24h，得到种子液；

步骤3）、再将种子液按3%的量接种于解淀粉芽孢杆菌液体发酵培养基中， 30℃，150rpm培养24h，得到发酵液；

步骤4）、发酵液按10%的量接种于固体基质上，30~40℃条件下发酵144h，然后将固体发酵物在50℃下烘干，得到固态肥料；

所述解淀粉芽孢杆菌为保藏地址是广东省微生物菌种保藏中心广州市先烈中路100号大院59号楼5楼GDMCC，保藏编号为GDMCC no:60084，分类命名为Bacillus amyloliquefaciens SC008，保藏时间为2016年9月28日。

优选的，所述固体基质配方为：玉米秸秆70%，豆粕20%，废糖液10%，终水分含量60%。

还提供了一种液体肥料的制备方法，以固态肥料与无菌生理盐水以0.25g/ml的比例配比，震荡后离心得到上清液即为液体肥料。

优选的，震荡时间为1h；离心转速为3000r/min，时间为10min。

提供了一种固态肥料对花生和玉米的促生长应用。

提供了一种固态肥料对花生根腐病的预防作用应用。

提供了一种液体肥料对尖镰孢菌和串珠镰孢菌的抑菌作用。

提供了一种液体肥料对种子的促发芽生长作用应用。

本发明的有益效果是：1.对解淀粉芽孢杆菌进行诱变，筛选出能够代谢出大量吲哚乙酸的菌株，经固体发酵生产出微生物固态肥料产品。此产品对植物具有不同程度的促生长等作用，尤其是对花生和玉米的促生长更为明显，同时其作为固态肥料施用时，也可起到防止土壤结块并有效预防花生根腐病；

2、利用固态肥料进行进一步加工得到的液体肥料，对造成根腐病的尖镰孢菌和串珠镰孢菌有明显的抑菌作用，同时对种子有促发芽生长作用；

3、本发明的制备方法有效地保存活菌数量和产品中富含的生物活性物质，同时有效地避免了肥料中有效营养成分的流失。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一、解淀粉芽孢杆菌诱变筛选

1.1 紫外线照射诱变

1.解淀粉芽孢杆菌SC008在营养琼脂培养基上划线，30℃培养48h，得到该菌株的单克隆；

2.挑取单克隆接种于营养无琼脂培养基中30℃培养10h，此时菌活力最强，菌数达到3.21×10⁷CFU/mL，用无菌水将菌液稀释到10⁵CFU/mL，备用；

3.取上述菌悬液0.1mL，均匀涂布于营养琼脂培养基上。将其放置于紫外光下15cm处，垂直照射10min。之后避光于培养箱中30℃培养48h；

4.从上述平板中挑取存活单菌落，分别在营养琼脂培养基上划线，30℃培养48h，得到该菌株的单克隆。再挑取单克隆接种于营养无琼脂培养基中30℃培养24h，得到菌悬液；

5.将上述菌悬液用分光光度法在600nm处，测其吸光值，作为对照；再取5mL菌悬液10000r/min离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液（50 mL35% HCl₄+ 1 mL0.5mol/L FeCl₃），避光静置30min，在530nm处，测其吸光值。计算菌液在600nm处吸光值为1时，单位体积发酵液中吲哚乙酸的含量。采用分析纯的吲哚乙酸梯度稀释后，绘制标准曲线。

6.挑选吲哚乙酸含量最高的菌株，其产量达到46.7μg/mL。

1.2硫酸二乙酯（DES）诱变

1.挑取经紫外诱变筛选得到的菌株，在营养琼脂培养基上划线，30℃培养48h，得到该菌株的单克隆；

2.挑取单克隆接种于营养无琼脂培养基中30℃培养24 h，菌数达到3.21×10⁸CFU/mL，用无菌水稀释至10⁵CFU/mL；

3.将上述菌液于等体积的DES混合，150r/min震荡2h。结束后立即加入Na₂S₂O₃终止反应；

4.取上述菌悬液0.1mL，均匀涂布于营养琼脂培养基上，于培养箱中30℃培养48h；再分别挑取单菌落，于营养无琼脂培养基中30℃培养24h，得到菌悬液；

5.测定菌液中吲哚乙酸含量；方法参照1.1中吲哚乙酸含量测定方法；

6.挑选吲哚乙酸含量最高的菌株，其产量达到76.3μg/mL。

二、液体发酵种子制备

1.挑取实施例1所得的解淀粉芽孢杆菌在酵母浸粉胨葡萄糖琼脂培养基上划线，30℃培养48h，得到该菌株的单克隆；

2.挑取单克隆接种于酵母浸粉胨葡萄糖液体培养基中30℃培养24h，菌数达到3.21×10⁸CFU/mL，得到种子液。

3.取上述种子液，接种于解淀粉芽孢杆菌液体发酵培养基中，接种量为3%（V/V），30℃，150rpm培养24h，菌数达到4.0×10⁸CFU/mL。

三、固态肥料的制备

1.按配方：玉米秸秆70%，豆粕20%，称取后粉碎，测其含水量，混匀，制成固体培养基半成品。废糖液添加量为10%，根据终水分含量60%计算好加水量后，按10%的接菌量将水、废糖液与菌液混匀，之后加入到上述固体培养基中。

2.将接好菌种的培养基在30~40℃条件下发酵144h，然后将固体发酵物在50℃下烘干，得到固态肥料。

实施例2

称取50g解淀粉芽孢杆菌固态肥料，加入200mL无菌生理盐水，于500mL三角瓶中震荡1h，之后3000r/min离心10min，保留上清液，即为液体肥料。

实施例3

固态肥料对花生植株及产量的影响

1.试验设计

试验共分为3个处理组，每个处理组3个重复。处理组如表1所示：

2.材料与方法

2.1 试验材料

以盆栽的方法来进行固态肥料对作物的影响研究。采用40×25 cm的长方形塑料花盆作为种植容器。

土壤取自河南省武陟县郊区无农作物种植的区域，以减少肥料残留对本实验的影响。选取地表以下（不含树叶等有机物质）的土壤，混合均匀，待用。

作物选择花生。

2.2 试验方法

花盆中每盆添加土壤3+0.5 kg，先称取3kg备好的土壤均匀铺在每个花盆内，然后将10颗种子均匀分布于土壤表面。再称取0.5kg土壤与肥料（按试验处理需要）混合均匀，均匀盖在种子表面。

所有花盆均保持一样的环境（浇水、光照等）。试验期为45天。

在试验第150天，取出花生植株及果实，测量植物的重量（鲜重）、植株高度、根部长度及产量（干重）。

3.试验结果

如表2所示，，土壤中加入复合肥和本发明固态肥料，均可有效改善植株的出苗率和生长效果，且T₂固态肥料的效果较好于T₁复合肥料。与对照组T₀相比，T₁复合肥料组和T₂固态肥料组的出苗率分别提高了8.21%和18.3%，同时T₂固态肥料组的出苗率比T₁复合肥料组提高了9.28%；T₁复合肥料组和T₂固态肥料组的植株重量分别提高了51.6%和61.3%，T₂固态肥料组的植株重比T₁复合肥料组提高了6.38%；T₁复合肥料组和T₂固态肥料组的植株高度分别提高了26.1%和30.9%，T₂固态肥料组的植株高度比T₁复合肥料组提高了3.79%；T₁复合肥料组和T₂固态肥料组的根部长度分别提高了59.4%和78.9%，T₂固态肥料组的根部长度比T₁复合肥料组提高了12.26%；T₁复合肥料组和T₂固态肥料组的产量分别提高了66.7%和122.2%，T₂固态肥料组的产量比T₁复合肥料组提高了33.3%

此试验结果说明，本申请的固态肥料可明显促进花生生长，提高花生产量，且其效果要远远好于复合肥料。

实施例4

本申请固态肥料对玉米生长的影响

1.试验设计

试验共分为3个处理组，每个处理组3个重复。处理组如表3所示：

2.材料与方法

2.1 试验材料

供试土壤为黄褐土，质地为粘壤土。

玉米种子选取市面上常用玉米种子。

2.2 试验方法

试验在河南安阳某农田进行。该农田前茬作物为小麦，麦收灭茬后，按设计要求划出试验区。然后进行耕地，耙平划行、开出施肥沟，按试验设计撒入相应肥料，覆土后直播玉米。试验田各个处理之间管理严格一致（浇水、除草等）。试验期为90天。

3.试验结果

如表4所示，添加复合肥料和本发明固态肥料均可不同程度提高玉米植株高、穗位高、玉米产量、玉米容重，且固态肥料效果要高于复合肥料。相对于对照组，复合肥料组和固态肥料组的玉米植株高度增加了1.50%和1.18%；复合肥料组和固态肥料组的玉米穗位高降低了0.65%和2.7%，而微生物组的玉米穗位高相对于复合肥料组降低了2.07%。玉米植株高度的增加和穗位高度的降低，均为玉米的高产奠定了基础。

在玉米产量和玉米质量方面，复合肥料组和固态肥料组的产量相对于对照组，分别提高了32.3%和41.3%，同时固态肥料组比复合肥料组提高了9%；，复合肥料组和固态肥料组的玉米容重相对于对照组，分别提高了2.27%和3.67%，同时固态肥料组比复合肥料组提高了1.4%。另外，根据玉米容重等级划分，在玉米品种相同的情况下，对照组和复合微生物组的玉米等级为3级，而固态肥料组的玉米等级达到2级。

此实验结果说明，固态肥料组可较为明显的提高玉米的产量和玉米品质，且其效果要明显好于复合肥料。

实施例5

固态肥料对花生根腐病发生的预防作用

1.试验设计

试验共分为3个处理组，每个处理组3个重复。处理组如表5所示：

2.材料与方法

2.1 试验材料

以盆栽的方法来进行研究。采用100×25 cm的长方形塑料花盆作为种植容器。

土壤取自河南某地刚发生过花生根腐病（没有经过农药处理）的农田，混合均匀，待用。

作物选择花生。

2.2 试验方法

花盆中每盆添加土壤3.5 kg。先称取3kg备好的土壤均匀铺在每个花盆内，再称取肥料（按试验处理需要）的一半铺在花盆表面，然后将10颗种子均匀分布于土壤表面。再称取0.5kg土壤与剩余的一半肥料（按试验处理需要）混合均匀，均匀盖在种子表面。

所有花盆均保持一样的环境（浇水、光照等）。试验期为150天。

在试验第150天，取出植物，测量出苗率，成活率，收集花生，计算产量。

3.试验结果

注：成活率=最终产花生的菌株/10×100；数据为3个重复的平均值。

试验结果如表6所示，土壤中加入复合肥和本发明产品固态肥料，可改善花生根腐病致病菌对花生的侵害，且T₂固态肥料的效果明显好于T₁复合肥料。与对照组T₀相比，T₁复合肥料组和T₂固态肥料的出苗率分别提高了16.7%和40%，同时T₂固态肥料的出苗率比T₁复合肥料组提高了23.3%；T₁复合肥料组和T₂固态肥料的植株成活率分别提高了26.7%和53.3%，T₂固态肥料的植株重比T₁复合肥料组提高了26.6%；T₁复合肥料组和T₂固态肥料的产量分别提高了300%和467.7%，T₂固态肥料的产量比T₁复合肥料组提高了41.6%。

此试验结果说明，本发明固态肥料可明显抑制花生根腐病致病菌的生长，降低花生根腐病的发生率。

实施例6

液体肥料抑菌试验

采用牛津杯法测定液体肥料中含有的解淀粉芽孢杆菌对尖镰孢菌和串珠镰孢菌的抑菌作用。除本发明中所述的解淀粉芽孢杆菌（编号SC008）外，另外从土壤（001）、花生根系（002）和市面相关产品（003）中分离得到解淀粉芽孢杆菌。将尖镰孢菌和串珠镰孢菌分别涂布于MH（Mueller-Hinton）琼脂培养基上，每个牛津杯加入100μL的解淀粉芽孢杆菌液体肥料，28℃分别培养48h和2周。测量抑菌圈直径，试验结果如表7所示：

表7解淀粉芽孢杆菌对尖镰孢菌和串珠镰孢菌的抑菌作用

注：表中数据为3次重复试验的平均值。

试验结果表明，本发明中的解淀粉芽孢杆菌对尖镰孢菌和串珠镰孢菌具有较好的抑制作用，且其效果要好于其他同种菌株。而尖镰孢菌和串珠镰孢菌是花生、玉米等农作物根腐病等的致病菌，由此可以推断，本发明可以一定程度的预防农作物根腐病的发生。

实施例7

液体肥料对种子的促发芽生长作用

1.准备16个100mL的烧杯，每个烧杯中加入50mL的液体肥料，每个烧杯中再加入20颗均匀饱满的优质小麦、花生和黄瓜种子，每种种子4个烧杯，分别浸泡24、48、72、96h。试验重复3次。

2.将浸泡过的种子转移到没添加过任何肥料的土壤中，在相同条件下进行培养，另外设置无浸泡液体肥料的对照组。观察其出苗率，试验结果如表8所示：

从表中试验结果发现，经液体肥料浸泡过的种子可较为明显的提高其发芽率。其中，小麦种子和黄瓜种子经24h浸泡，发芽率达到最高；花生种子经过48浸泡，效果达到最高。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种制备解淀粉芽孢杆菌发酵肥料的方法，其特征在于：

所述解淀粉芽孢杆菌的保藏地址为：广东省微生物菌种保藏中心；保藏时间为：2016年9月28日；保藏编号为：GDMCC No.60084；分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.根据权利要求1所述的制备解淀粉芽孢杆菌发酵肥料的方法，其特征在于：所述固体基质配方为：玉米秸秆70%，豆粕20%，废糖液10%，终水分含量60%。

3.一种液体肥料的制备方法，其特征在于：如权利要求1或2得到的固态肥料与无菌生理盐水以0.25g/ml的比例配比，震荡后离心得到上清液即为液体肥料。

4.根据权利要求3所述的液体肥料的制备方法，其特征在于：震荡时间为1h；离心转速为3000r/min，时间为10min。

5.一种权利要求1或2所制得的固态肥料对花生和玉米的促生长应用。

6.一种权利要求1或2所制得的固态肥料对花生根腐病的预防作用应用。

7.一种权利要求3或4所制得的液体肥料对尖镰孢菌和串珠镰孢菌的抑菌作用。

8.一种权利要求3或4所制得的液体肥料对种子的促发芽生长作用应用。