CN103952332A - 一种解淀粉芽孢杆菌zh1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌ZH1及其应用，属于微生物领域，该解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ZH1），于2014年1月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），保藏号CGMCC No.8803。该菌株能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长，提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，增加土壤有效磷含量。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌ZH1及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物，具体地说涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

我国南方红壤地区占全国土地总面积20%以上，人口占全国40%，耕地占全国的30%。红壤地区是我国主要粮食产区和热带‐亚热带经济作物—橡胶、油棕、咖啡、可可、柑橘、茶叶、油桐。桑蚕的主要产区，历来在我国农业可持续发展和生态环境建设中发挥着重要作用。虽然该地区具有丰富的光、热、水、土和生物资源，但红壤质量的退化已成为限制这一地区农业持续发展的障碍因素。

在土壤中许多微生物能够溶解难溶态磷，促进植物对磷的吸收，增加作物产量和改善作物品质，将解磷微生物作为生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，节肥增产，而且可改善土壤结构，提高土壤有机质含量。植物促生菌(Plant Growth Promoting Bacteria，简称PGPB)被界定为在一定条件下有利于植物生长的自由生活在土壤、根际、根表、叶际的细菌。这些细菌能够固氮、溶磷、溶铁，并产生植物激素，如生长素、赤霉素、细胞分裂素和乙烯。此外，它们还能提高植物的抗逆性，包括干旱、高盐、重金属毒害和农药。但现在大部分植物促生菌还为被驯化成可有效应用于促进植物生长并具有较好固氮溶磷效果的菌种，未必适应红壤的土壤环境。因此从红壤中分离得到植物促生菌，和作物形成共生体系，利用生物修复改善红壤，成为当前研究的热点。

红壤的主要肥力特征是酸、粘、瘦、旱，施入的磷肥非常容易被红壤中的活性铁、铝固定从而大大地降低了利用率。由于红壤的肥力特点，从其他土壤中筛选出来的溶磷性细菌由于受土壤酸碱度的限制，导致溶磷效果不明显。

基于以上因素，本实验从供试红壤中筛选出一株植物促生菌ZH1，通过实验发现ZH1能够适应红壤的生活环境，并且具有较高的解磷效果。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物促生菌，可在红壤环境中有效促进作物生长，并且可将难溶性磷酸盐转化为可被生物利用的可溶性磷酸盐。

本发明的另一个目的是提供一种植物促生菌在花生栽培上的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明的一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZH1，于2014年1月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.8803。

所述解淀粉芽孢杆菌ZH1菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，半透明，不规则杆状排列，产芽孢。

所述解淀粉芽孢杆菌ZH1的生理生化特性是：革兰氏阳性，严格好氧，化能异养，接触酶阳性，M.R和VP试验阴性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌培养时使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、尿素、丙氨酸；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、葡萄糖；使用的无机组分包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。本发明的解淀粉芽孢杆菌发酵可在28～32℃，pH4～10的环境下进行。

所述解淀粉芽孢杆菌能利用难溶性磷酸盐为磷源进行生长。

作为本发明的进一步优化，所述解淀粉芽孢杆菌ZH1采用的碳源为蔗糖，采用的氮源为硫酸铵。利用上述碳源和氮源制得的培养基，培育出的解淀粉芽孢杆菌ZH1解磷能力最强。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌ZH1以难溶性磷酸盐为磷源进行生长，并将其转化为可溶性磷酸盐。在实验室摇瓶条件下，所述解淀粉芽孢杆菌ZH1对磷酸三钙的转化量达228.22mg·L^-1。相对于采用接种灭活菌作为空白对照的结果，所述解淀粉芽孢杆菌ZH1对磷酸三钙的转化量比空白对照高出213.92mg·L^-1。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌ZH1在促进植物生长中的应用，优选在促进红壤中花生生长的应用。通过室内盆栽实验，将ZH1接种到盆栽中，能够很好的促进花生的生长，相对于对照，花生株高高出4.19cm,花生植株重高出对照的三分之一。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌ZH1在花生栽培上的应用。通过室内盆栽实验，将ZH1接种到盆栽中，与对照相比接种解淀粉芽孢杆菌能够提高红壤的速效磷，促进花生的生长。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌ZH1在制备花生促生菌剂中的应用。通过盆栽实验，接种解淀粉芽孢杆菌不仅能够促进花生的生长而去能够促进红壤中难溶性磷的转化，因此可以将ZH1制备成花生促生剂应用，既本实验的接种解淀粉芽孢杆菌。

有益效果：本发明的一种解淀粉芽孢杆菌ZH1可将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，提高肥料的利用率，促进植物根系发育和对肥料的吸收，增加土壤有效磷含量；本发明针对花生具有良好的促生长效果，土壤有效磷含量的提高也使得花生对磷肥的利用率更高。

附图说明

图1是本发明菌株ZH1的菌落图；

图2表示不同装液量对菌株ZH1解磷能力的影响；

图3表示不同初始pH对ZH1菌株解磷能力的影响；

图4表示不同碳源对菌株ZH1解磷能力的影响；

图5表示不同氮源对ZH1菌株解磷能力的影响；

图6表示种植花生30天后接种ZH1和JX1菌株对花生鲜重的影响；

图7表示种植花生30天后接种ZH1和JX1菌株对花生株高的影响；

图8表示种植花生30天后接种ZH1和JX1菌株对花生全P含量的影响；

图9表示种植花生30天后接种ZH1和JX1菌株对花生根总长的影响；

图10表示种植花生30天后接种ZH1和JX1菌株对花生根表面积的影响；

图11表示种植花生30天后接种ZH1和JX1菌株对花生根平均直径的影响；

图12表示种植花生30天后接种ZH1和JX1菌株对花生根尖数的影响；

图13表示种植花生30天后接种ZH1和JX1菌株对土壤有效P含量的影响；

生物材料保藏信息

ZH1，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），于2014年1月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No.8803

根际促生菌JX1，分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），2011年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5624。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1

首先准备以下三种培养基。

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0‐7.2，121℃灭菌，20min。

LB液体培养基：不加琼脂，其它条件同上。

无机磷细菌培养基（PKO培养基）：磷酸三钙5g，葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，七水合硫酸镁0.3g，氯化钾0.3g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，pH7.0琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2。121℃灭菌，20min。

无机盐培养基：硫酸铵2.0g；磷酸二氢钠0.5g；磷酸氢二钾0.5g；七水硫酸镁0.2g；二水氯化钙0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃灭菌，20min。

将从江西鹰潭红壤生态站采取的红壤挑根过筛后称取l0g置于盛有100ml灭菌水的250ml的三角瓶中，在摇床中，30℃，150r·min^-1振荡20min，静置10min，得到土壤悬浮液。该土壤悬浮液中含有若干种促生菌，采用稀释法稀释后涂于LB培养基，将平板倒置，于30℃，恒温箱中培养24h后，挑取不同类型典型单个菌落，经平板纯化后，4℃保存在LB斜面待用。

下面再通过实验筛选出可高效解磷的植物促生细菌。

把得到的菌株进行溶磷情况的筛选测定，将供试菌株接种于盛有30mL无机磷细菌液体培养基的150mL三角瓶，30℃，180r·min^-1培养4d后，将培养液装入离心管4℃下10000r·min^-1离心，15min。取上清液用钼蓝比色法测定有效磷含量。

通过以上测定即可筛选出溶磷能力强的菌株，如图1所示。该菌株形成的菌落为较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，半透明，不规则杆状排列，产芽孢，株型命名为ZH1。

将上述方法筛选分离出的菌株，经上海英俊生物工程有限公司测序，根据16SrDNA的测序结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它的16S rDNA序列进行同源性比较，选择相近的序列与ZH1的序列用MEGA version3软件构建ZH1的16SrDNA系统进化树。根据该菌株的生理生化特征，鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），同源性为98%。

该菌种呈革兰氏阳性、产芽孢的不规则杆状。菌落较小为白色、隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，半透明。严格好氧，化能异养。最适生长温度为30℃，接触酶阳性。解磷能力强，达到228.22mg·L^-1。将该菌株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2014年1月22日，保藏号为CGMCC No.8803。

实施例2

好氧性试验

把灭过菌的LB培养基倒入3个已灭菌的试管中，大约在2/3处，在无菌操作台上，用接种针挑取斜面培养的解淀粉芽孢杆菌ZH1，穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底）。30℃培养，分别在3天至7天观察结果。在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿穿刺线生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌。试验结果表现，菌落沿琼脂柱表面生长，穿刺线内无菌落生长，为严格好氧。

过氧化氢酶的测定

在干净载玻片上滴1滴3%H₂O₂，取18～24h的解淀粉芽孢杆菌ZH1LB斜面培养物1环，在H₂O₂中涂抹，若有气泡产生则为阳性，否则为阴性。试验结果为接触酶阳性。

甲基红试验（M.R试验）

a.培养基及试剂：蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调节pH7.0～7.2，分装试管，每管装4～5mL，121℃灭菌20min。试剂：甲基红0.1g，95%酒精300mL，蒸馏水200mL。

b.菌种培养及结果观察接种解淀粉芽孢杆菌ZH1菌株于上述培养液中，30℃培养l～2天。在培养液中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性（甲基红变色范围4.4红色～6.0黄色）。

试验结果为M.R阴性。

乙酞甲基甲醇试验（VP试验）

a.培养基培养基同甲基红试验。

b.菌种培养及结果观察接种与培养同甲基红试验。做VP试验时，取解淀粉芽孢杆菌ZH1培养液（约2mL）和等量的40%NaOH相混合，加少量肌酸，充分振荡2～5min后，如培养液出现红色，即为VP阳性。

试验结果为VP阴性。

淀粉水解试验

a.培养基及试剂在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装三角瓶，121℃灭菌20min备用。路哥氏碘液：碘片1g，碘化钾2g，先用少量（3～5mL）蒸馏水溶解碘化钾，现加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀释至300mL。

b.菌种培养及结果观察取解淀粉芽孢杆菌ZH1菌种点接于平板上，30℃培养2～4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。

试验结果为淀粉水解阳性。

明胶水解试验

a.培养基及试剂蛋白胨5g，明胶120g，蒸馏水1000mL。调节pH7.2～7.4，分装试管，培养基高度约为4～5cm，121℃灭菌20min。

b.菌种培养及结果观察用穿刺法接种解淀粉芽孢杆菌ZH1在试管中央。在30℃温箱中培养一个月，观察明胶是否液化。

试验结果为明胶水解阳性。

实施例3

为了进一步验证实施例1得到的植物促生菌ZH1解磷能力和最适条件，下面针对不同pH、装液量、不同碳源、不同氮源探索对解磷能力的影响。

将无机磷液体培养基按25ml，50ml，75ml，100ml，150ml装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的ZH1后，置于30℃，180r·min^-1摇床培养24h，用钼蓝比色法测定有效磷含量。结果如图2所示，由于菌株ZH1是好养代谢，通气量影响菌株解磷能力的强弱，50mL装液量时，菌株解磷能力最强，之后随着装液量增大，能力变弱。

将无机磷培养基分别调节到不同的pH（4、5、6、7、8、9、10），取50mL装于250mL的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的ZH1后，置于30℃，180r·min^-1摇床培养24h，用钼蓝比色法测定有效磷含量，结果如图3所示，该菌种解磷能力的最适pH为4～6。

在无机磷培养基中（不含葡萄糖）分别加入1%（w/v）的碳源，碳源有葡萄糖、木糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖等，取50ml装于250ml的三角瓶中，按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的ZH1后，置于30℃，180r·min^-1摇床培养24h，用钼蓝比色法测定有效磷含量。结果如图4所示，该菌株在供给蔗糖时，解磷能力最强，其次是葡萄糖，木糖的解磷能力最低。

在无机磷培养基(不包括硫酸铵)中分别加入0.1%（w/v）的氮源，氮源包括硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、酵母粉、尿素、丙氨酸等，取50ml装于250ml的三角瓶中按1%（v/v）接种量接种处于对数生长期的ZH1后，置于30℃，180r·min^-1摇床培养24h，用钼蓝比色法测定有效磷含量。结果如图5所示，说明取硫酸铵为氮源时，解磷能力最强。

实施例4

本发明对花生具有明显促生长作用，下面通过盆栽试验进行说明。

采集自然条件下0～20cm土层的新鲜红壤，过5mm筛，每盆装土200g，种植花生，调节含水量至田间最大持水量的60%，30天后采样，用根系扫描仪（LA1600+scanner，Canada）扫描获得根系图像后，用根系分析软件（Winrhizo2003b，Canada）进行相关根系指标分析，用钼蓝比色法测定土壤有效磷含量。

花生种子：花生种子进行20%双氧水表面消毒20min，无菌水冲洗多次，催芽2d，选取发芽一致的种子备用。

接菌处理：将本发明的解淀粉芽孢杆菌ZH1接种于LB液体培养基，30℃，180r·min^-1摇床培养，培养菌长至对数生长期，然后将菌悬液10000r·min^-1离心10min，再用无菌水重悬同样离心三次，接种量为10⁸CFU·g^-1。

对照处理：作为对照1，土壤不喷洒ZH1菌液，加等量无菌水。为对比溶磷性细菌的效果，接种其它溶磷性细菌（保藏号为CGMCC No.5624的解淀粉芽孢杆菌JX1）作为对照2。

结果如图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13所示。从图6图7可以看出，经接菌处理后，植株的株高及地上部鲜重都有显著增加，促进了花生生长；从图8可以看出，经接种处理后，花生植株的全磷含量较对照组明显增加；从图9、图10、图11、图12可以看出，接种ZH1处理与不接菌处理进行对比，花生根系总长度，根平均直径，根表面积和根尖数都显著增加，促进了花生根系的发育；从图13可以看出，经接菌处理后，土壤有效磷含量有所提高。结合以上结果可以看出，本发明的解淀粉芽孢杆菌ZH1对根基的生长、发育具有明显效果，解磷能力好，可以有效促进红壤中作物生长发育。与接种其它溶磷菌对照，接种解淀粉芽孢杆菌ZH1效果比接种解淀粉芽孢杆菌JX1具有更好的解磷效果，对花生有更好的促进作用。通过以上结论可以看出，JX1的解磷效果以及对花生的促生作用在红壤中作用不明显。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZH1，于2014年1月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.8803。

2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌ZH1在促进植物生长中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的解淀粉芽孢杆菌ZH1在促进红壤中花生生长中的应用。

4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌ZH1在花生栽培上的应用。

5.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌ZH1在制备花生促生菌剂中的应用。