CN103131648A - 解淀粉芽孢杆菌及其在防治花生果腐病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物防治领域，特别涉及解淀粉芽孢杆菌菌株、固态发酵菌肥及其在防治花生果腐病中的应用。包含保藏编号为CGMCCNo.5436的解淀粉芽孢杆菌的菌肥稀释100～1000倍穴施于花生，田间定殖促生试验证明该菌能定殖于花生根际土壤及根内，对根部有明显的促生作用，对根部病害防治效果达60%以上，田间防病试验表明对花生果腐病的防治效果为50%以上，出苗率增加10～20%，增产6～12%，实现了在控制病害的同时，达到保果增产的目的。本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌能定殖于花生的根际土壤及根内，对花生果腐病有良好的防治效果；其次，该菌株还具有促生增产作用；同时，该菌肥的芽孢含量高、用量少，且无毒无致病性，对人畜安全，不污染环境，生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及微生物防治领域，特别涉及解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治花生果腐病中的应用。
背景技术
花生果腐病为一种花生生长中后期发生的土传病害，是由侵脉新赤壳菌（Neocosmospora sp.）侵染花生果而引起花生果腐烂的一种病害，该病害发病特征如下：（1）发生病变的荚果主要是中后期的秕果和饱果；（2）初步发生时，花生荚果的中果皮和外果皮变为黑褐色斑点，内果皮及种子正常；（3）发病严重时，荚果的整个果皮和种子变黑、腐烂；（4）根部外表皮发黑，而地上部分不变或者更绿。2006-2011年，该病害在我国河北、山东、吉林、河南等花生种植区先后被发现，烂果率在30-100%，这严重损害了当地花生种植户的利益。目前市场上还没有有效的防治该病害药物。因此，提供一种能够有效防治花生果腐病的药物具有重要现实意义。
针对花生果腐病这种土传病害，传统的化学农药由于受到持效期短等方面的限制，防治效果有限。而利用芽孢杆菌进行生物防治在持续控制土传病害上表现出很好的应用潜力。其优势主要表现在以下方面：（1）芽孢杆菌制剂在休眠期产生芽孢，芽孢具有耐受高温和具有良好的贮存性能；（2）由于芽孢杆菌易于发酵，且会将抑真菌蛋白分泌到胞外，抑真菌蛋白又具有性质稳定，水溶性等优点，便于应用；（3）芽孢杆菌易于繁殖，适应环境能力强，具有很大的开发利用价值。但是，目前市场上的芽孢杆菌制剂对花生果腐病的长期防治效果不佳。因此，急需一种能够实现持续控制花生果腐病，降低花生果农药残留，实现防病、保果、增产作用的芽孢杆菌。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治花生果腐病中的应用。该解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.5436。该解淀粉芽孢杆菌菌株能够持续控制花生果腐病，降低花生果农药残留，实现防病、保果、增产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.5436。
该菌株16S rRNA 在GenBank 序列登记号为JN851189。
本发明的解淀粉芽孢杆菌，革兰氏阳性；菌体杆状、形成芽孢，芽孢卵圆形，孢囊膨大；接触酶（-）；葡萄糖氧化发酵（发酵型）；硝酸盐还原实验（+）；亚硝酸盐利用（+）；甲基红试验（-）；V-P 测定（+）；柠檬酸盐利用（+）；明胶液化反应（+）；淀粉水解（+）；葡萄糖氧化发酵（发酵型）；牛奶分解实验（产酸）；脲酶试验（-）；纤维素分解实验（+）； 利用抗生素合成基因的通用引物进行基因探测，发现该菌含有至少4种抗生素合成基因（包括表面活性素、丰原素、伊枯草菌素三大类抗生素），平皿对峙实验表明该菌对花生果腐病菌、马铃薯早疫病菌，白菜黑斑病菌，棉花黄萎病菌，苹果腐烂病菌，苹果轮纹病菌和苹果斑点落叶病菌具有明显的抑制作用。
本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌在制备抑制植物病原菌药物中的应用；所述植物病原菌包括花生果腐病菌、马铃薯早疫病菌，白菜黑斑病菌，棉花黄萎病菌，苹果腐烂病菌，苹果轮纹病菌和苹果斑点落叶病菌。
本发明还提供了一种菌肥，其包括保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌及肥料中可接受的佐剂。
作为优选，所述解淀粉芽孢杆菌的含量≥1012 CFU/g。
本发明还提供了上述菌肥的固态摇瓶发酵工艺，包括如下步骤：
步骤1：挑取保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌置于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于30～37℃、200～220 rpm培养12～16h，得第一培养物；
步骤2：将所述第一培养物按1～10 %的接菌量转接于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于30～37℃、200～220 rpm培养22～26h，得第二培养物；
步骤3：将第二培养物作为固态摇瓶发酵的种子液，按8～12%的接菌量转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后于30～37℃培养120～160 h后即得。所述固态摇瓶发酵培养基包括：麦麸26～30 重量份，棉籽皮7～9 重量份；花生饼粉2.5～4.0重量份，水40～45 重量份。
作为优选，上述菌肥的施用量为15～30kg/公顷。
本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治花生果腐病中的应用。该解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.5436。包含保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌的菌肥稀释100～1000倍穴施于花生，田间定殖促生实验证明该菌能定殖于花生根际土壤及根内，对根部有明显的促生作用，对根部病害有60%以上防治效果，田间防病试验表明对花生果腐病的防治效果50%以上，出苗率增加10～20%，增产6～12%，实现了在控制病害的同时，达到保果，增产的目的。本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌能定殖于花生的根际土壤及根内，对花生果腐病有良好的防治效果；其次，该菌株还具有促生增产作用；同时，该菌肥的芽孢含量高、用量少，且无毒无致病性，对人畜安全，不污染环境，生产成本低。
生物保藏说明
分类命名：解淀粉芽孢杆菌，Bacillus amyloliquefaciens.于2011年11月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.5436。
附图说明
图1示伊枯草菌素A合成基因ituA检测结果，大小为1150bp（第二泳道），第一泳道为DL2000 markers；
图2示抗霉枯草菌素B合成基因mycB检测结果，大小为2024bp（第二泳道），第一泳道为λ-EcoT14 markers；
图3示丰原素B合成基因fenB检测结果，大小为1400bp（第二泳道），第一泳道为λ-EcoT14 markers；
图4示表面活性素合成基因sfp检测结果，大小为675bp（第二泳道），第一泳道为λ-EcoT14 markers；
图5示本发明提供的保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌在根内定殖情况；
图6示本发明提供的保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌在根际土壤的定殖情况；
图7示本发明提供的保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌对主根促生的影响；其中， 
示施用菌肥的花生主根长度，
示不施菌肥的花生主根长度。
具体实施方式
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治花生果腐病中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌，其保藏编号为CGMCC No.5436。
本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌在制备抑制植物病原菌药物中的应用；所述植物病原菌包括花生果腐病菌、马铃薯早疫病菌，白菜黑斑病菌，棉花黄萎病菌，苹果腐烂病菌，苹果轮纹病菌和苹果斑点落叶病菌。
本发明还提供了一种菌肥，其包括保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌及肥料中可接受的佐剂。
作为优选，所述解淀粉芽孢杆菌的含量≥1012 CFU/g。
本发明还提供了上述菌肥的固态摇瓶发酵工艺，包括如下步骤：
步骤1：挑取保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌置于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于30～37℃、200～220 rpm培养12～16h，得第一培养物；
步骤2：将所述第一培养物按1～10 %的接菌量转接于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于30～37℃、200～220 rpm培养22～26h，得第二培养物；
步骤3：将第二培养物做为固态摇瓶发酵的种子液，按8～12%的接菌量转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后于30～37℃培养120～160 h后即得。所述固态摇瓶发酵培养基包括：麦麸26～30 重量份，棉籽皮7～9 重量份；花生饼粉2.5～4.0重量份，水40～45 重量份。
作为优选，上述菌肥的施用量为15～30kg/公顷。
本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其在防治花生果腐病中的应用。该解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.5436。包含保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌的菌肥稀释100～1000倍穴施于花生，田间定殖促生实验证明该菌能定殖于花生根际土壤及根内，对根部有明显的促生作用，对根部病害有60%以上防治效果，田间防病试验表明对花生果腐病的防治效果50%以上，出苗率增加10～20%，增产6～12%，实现了在控制病害的同时，达到保果，增产的目的。本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌能定殖于花生的根际土壤及根内，对花生果腐病有良好的防治效果；其次，该菌株还具有促生增产作用；同时，该菌肥的芽孢含量高、用量少，且无毒无致病性，对人畜安全，不污染环境，生产成本低。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌菌株、菌肥中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 解淀粉芽孢杆菌的分离与鉴定
2010年7月，解淀粉芽孢杆菌是从采集于河北省大名县花生种植区的花生果壳上通过与花生果腐病病原菌对峙培养的方法分离获得的。
具体方法：将采集于河北省大名县花生种植区的新鲜健康的花生荚果，洗净，0.1%升汞消毒30s，75%乙醇表面消毒30s，灭菌水冲洗4次，切取1g果壳于灭菌研钵中捣碎，加10mL灭菌水，取100μL均匀涂布到含有花生果腐病病原菌分生的PDA培养基上，30℃培养48-72小时，挑取产生抑菌圈的菌落进行纯化培养。
生理生化鉴定参照《常见细菌鉴定手册》及分子鉴定：
革兰氏阳性；菌体杆状、形成芽孢，芽孢卵圆形，孢囊膨大；接触酶（-）；葡萄糖氧化发酵（发酵型）；硝酸盐还原实验（+）；亚硝酸盐利用（+）；甲基红试验（-）；V-P 测定（+）；柠檬酸盐利用（+）；明胶液化反应（+）；淀粉水解（+）；葡萄糖氧化发酵（发酵型）；牛奶分解实验（产酸）；脲酶试验（-）；纤维素分解实验（+）； 利用抗生素合成基因的通用引物进行基因探测（如图1至图4所示），发现该菌含有至少4种抗生素合成基因（包括表面活性素、丰原素、伊枯草菌素三大类抗生素），平皿对峙实验表明该菌对花生果腐病菌、马铃薯早疫病菌，白菜黑斑病菌，棉花黄萎病菌，苹果腐烂病菌，苹果轮纹病菌，苹果斑点落叶病菌具有明显的抑制作用。
16S rRNA 在GenBank 序列登记号为JN851189，利用未知功能基因yyaR与蛋白转运基因tetB-tetL的位置关系设计引物，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。
实施例2 菌肥的发酵工艺
挑取PDA平皿上的解淀粉芽孢杆菌单菌落放在3mL的马铃薯葡萄糖液体培养基中，置30℃、220rpm恒温摇床下培养16小时，获得第一培养物；
将第一培养物按1%的接菌量转接在马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于30℃、220rpm恒温摇床下培养26小时，获得第二培养物；
将第二培养物作为固态摇瓶发酵的种子液，按12%转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后30℃培养120h；该菌肥的固态摇瓶发酵培养基为：麦麸26 g；棉籽皮9 g；花生饼粉4.0g；水45 mL。
阴干，装袋。
实施例3 菌肥的发酵工艺
挑取PDA平皿上的解淀粉芽孢杆菌单菌落放在3mL的马铃薯葡萄糖液体培养基中，置37℃、200rpm恒温摇床下培养12小时，获得第一培养物；
将第一培养物按10%的接菌量转接在马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于37℃、200rpm恒温摇床下培养22小时，获得第二培养物；
将第二培养物做为固态摇瓶发酵的种子液，按8%转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后37℃培养140h；该菌肥的固态摇瓶发酵培养基为：麦麸30 g；棉籽皮7 g；花生饼粉2.5g；水44.5 mL。
阴干，装袋。
实施例4 菌肥的发酵工艺
挑取PDA平皿上的解淀粉芽孢杆菌单菌落放在3mL的马铃薯葡萄糖液体培养基中，置33℃、210rpm恒温摇床下培养14.5小时，获得第一培养物；
将第一培养物按5%的接菌量转接在马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于33℃、210rpm恒温摇床下培养24.5小时，获得第二培养物；
将第二培养物做为固态摇瓶发酵的种子液，按10%转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后33℃培养160h；该菌肥的固态摇瓶发酵培养基为：麦麸28 g；棉籽皮8 g；花生饼粉3g；水40 mL。
阴干，装袋。
实施例5 菌肥的发酵工艺
挑取PDA平皿上的解淀粉芽孢杆菌单菌落放在3mL的马铃薯葡萄糖液体培养基中，置35℃、205rpm恒温摇床下培养13小时，获得第一培养物；
将第一培养物按7%的接菌量转接在马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于35℃、205rpm恒温摇床下培养22.5小时，获得第二培养物；
将第二培养物作为固态摇瓶发酵的种子液，按11%转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后35℃培养135h；该菌肥的固态摇瓶发酵培养基为：麦麸29 g；棉籽皮9 g；花生饼粉4.0g；水43 mL。
阴干，装袋。
实施例6 菌肥的田间定殖、促生试验
于河北保定河北农业大学西校区标本园进行菌肥的田间定殖、促生试验，将固态摇瓶发酵的菌肥与土壤按体积比稀释1000倍，折合施用量为15kg/公顷，于第15日调查出苗率，分别于第15、20、25、30、35、40、45、60、75、90、105日取样检测本发明提供的解淀粉芽孢杆菌在根际土壤及根内的定殖情况和促生情况。
如图5、6所示，菌肥施用初期，根际土壤和根内菌量均处于下降状态。其中，根内菌量25天后趋于稳定，而根际土壤中菌量35天后趋于稳定；解淀粉芽孢杆菌在根内定殖数量大于根际土壤。
如图7所示，在花生的生长周期中，施用菌肥的花生主根长度均长于不施菌肥的花生主根长度，苗率分别为81.5%、96.3%，产量比对照增加11.1%。
实施例7 田间防病实验
分别于河北大名县和新乐市两大花生种植区的花生果腐病发生田进行菌肥的防病试验，将固态摇瓶发酵的菌肥与土壤按体积比稀释100倍，折合施用量为30kg/公顷，每个处理设5次重复，于花生收获前进行病害调查。
调查方法：
采用 Z形取样法，每小区5点取样，每点4穴，记录总荚果数，被害荚果数，并记录荚果总重量。
荚果分级标准：
0级：荚果完好，无被害状；1级：果皮受害，果实完好；2级：果仁中的半数果仁受害，另一半数量完好；3级：果仁全部受害，无完好果仁，统计花生果各级被害数。
防效计算方法
荚果被害率=被害荚果数/总荚果数×100
受害指数＝∑（被害果×该被害果级值）/（总果数×最高级值）×100
防治效果（％）＝（对照区受害指数－处理区受害指数） / 对照区受害指数×100。
防治效果如表1所示，在河北大名县和新乐市田间防病试验表明对花生果腐病的防治效果50%以上。
表1 防治效果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.5436。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备抑制植物病原菌药物中的应用；所述植物病原菌包括花生果腐病菌、马铃薯早疫病菌，白菜黑斑病菌，棉花黄萎病菌，苹果腐烂病菌，苹果轮纹病菌，苹果斑点落叶病菌。
3.一种菌肥，其特征在于，其包括保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌及肥料中可接受的佐剂。
4.根据权利要求3所述菌肥，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的含量≥1012 CFU/g。
5.根据权利要求3或4所述菌肥的固态摇瓶发酵工艺，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：挑取保藏编号为CGMCC No.5436的解淀粉芽孢杆菌置于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于30～37℃、200～220 rpm培养12～16h，得第一培养物；
步骤2：将所述第一培养物按1～10 %的接菌量转接于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于30～37℃、200～220 rpm培养22～26h，得第二培养物；
步骤3：将第二培养物做为固态摇瓶发酵的种子液，按8～12%的接菌量转接至固态摇瓶发酵培养基中，摇匀后于30～37℃培养120～160 h后即得。
6.所述固态摇瓶发酵培养基包括：麦麸26～30 重量份，棉籽皮7～9 重量份；花生饼粉2.5～4.0重量份，水40～45 重量份。
7.根据权利要求3、4或5任一项所述菌肥，其特征在于，其施用量为15～30kg/公顷。
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