CN103725637A - 短小芽孢杆菌及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌(Bacilius.Pumilus)LX11菌株，及其培养方法和应用，本发明提供的短小芽孢杆菌LX11菌株在防治花生根腐病、白绢病和茎腐病上显著效果，不但对病原菌有明显的拮抗作用，而且在盆栽和田间防治花生病害方面效果显著。

Description

短小芽孢杆菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及生物菌种技术领域，尤其是一种短小芽孢杆菌，及该短小芽孢杆菌的培养方法和应用。

背景技术

花生根腐病在世界范围内普遍发生，是危害最大，最难防治的一种土传病害。近年来，该病害在世界各花生主产区呈扩大蔓延趋势，在我国北方花生产区也连年加重。2006年，该病害在河北省行唐县、新乐市、大名县和定州市，河南省濮阳市，山东省青岛市、日照市、临沂市、泰安市大面积发生，重病田发病率超过50%；2009年在北方花生产区大流行，造成花生大幅减产，山东省莒南县、莒县部分地块甚至绝产。由于花生根腐病是由多种真菌引起，不同地区不同年际间优势种不同，山东省临沂地区优势种为镰刀菌、腐霉菌和色二孢菌；青岛地区为丝核菌、镰刀菌，部分年份核盘菌发生严重；河北省主要是镰刀菌和腐霉菌，近几年花生白绢病发生严重；河南省主要是色二孢菌和镰刀菌；广东省为色二孢菌和镰刀菌，近几年部分地区花生黑腐病危害加重；湖北省是是镰刀菌、丝核菌和黑曲霉菌。由于引起花生根腐病病原菌种类繁多，部分地区甚至没有搞清花生根腐病病原，因此防治非常困难。

花生白绢病是一种分布广泛的土传真菌病害(孟宪曾,1982;刘锡若等,1983),其病原菌为齐整小核菌(SclerotiumrolfiiSacc.)属半知菌小核菌属,没有有性抱子,从培养中可产生无性时期。该病菌以菌核形式在土壤、病株残体或在多年生植物寄主的茎基部越冬,菌丝也可以在土表病株残体上腐生,花生的种子及种壳也可带菌传病。该病在世界各大花生产区均有发生,尤以温暖地区更为严重。在南方的花生产区发生较多。近几年来,由于耕作制度的改变,高产新品种的推广应用,带来了田间小气候的显著变化,使花生白绢病由零星发生发展到分布逐年扩大,引起的危害也有逐渐加重的趋势(董炜博等,2001)，现在该病害已成为北方花生生产上重要病害；2004年山东省临沂市大田调查，一些地块平均病株率为67.3%，病情指数为56.8，而且其危害有逐渐加重的趋势（卞建波，2007）。

花生茎腐病分布广泛，国内各花生产区也均有报道，其中以山东、河南、河北、陕西、安徽、湖北、江苏、海南等花生产区发病较为严重。近几年来该病害发生呈上升趋势，尤其是重茬地块，表现尤为突出。据2004年在河北省定州市调查，一般发病地块病株率15～20%，重者达到50%以上，引起整株死亡，造成花生缺苗断垄，甚至成片死亡，颗粒无收。近年来，该病害在部分花生产区发生逐年加重，成为花生上一重要病害。据调查统计，2001～2003年，安徽省阜阳地区发病田块占89.6%,病株率轻的在10%～20%,严重的可达60%以上，甚至成片死亡，颗粒无收。

目前，主要采用化学药剂拌种和灌根的方法防治花生根腐病、白绢病和茎腐病等土传病害，拌种对花生苗期土传病害有一定防效，但对后期发生土传病害基本无效。灌根对后期发生土传病害防治效果也甚微，且污染严重，使相当一部分花生及其产品农药残留严重超标。

生物防治在一定程度上克服了化学防治的弊端，研究发现该方法对部分土传病害经济而有效，因而成为防治土传病害研究的热点,越来越受到人们的重视。国外研究生防菌剂较早，1973年，美国、澳大利亚、新西兰、希腊等国的研究人员利用放射土壤杆菌针对植物根癌病进行研究，效果显著，并实现了商品化。最近几年，美国、阿根廷、印度、泰国等国科学家筛选大量生防菌株，并在生产上用于防治花生根腐病；Dorner等从90年代开始筛选不产毒黄曲霉和寄生曲霉菌株竞争抑制产毒黄曲霉菌株，达到抑制产毒菌株进一步侵染作物的效果，在花生中，接种不产毒的寄生曲霉菌株可使食品级花生的黄曲霉毒素减少83%～98%,同时可使花生储存过程中显著降低黄曲霉毒素污染几率。我国研究花生生防菌剂较晚，但发展较快。封海胜等（1996）报道了微生物菌剂对花生的增产作用，并对减轻或解除花生连作障碍有一定作用；涂显平（2000）研究在花生连作的旱地中施用酵素菌，使青枯病、根腐病等几种主要病害的综合发病率由10.94%下降到2.25%；徐秀娟（2003）、黄亚丽(2006)和刘登望(2006)等报道应用木霉菌拌种防治由丝核菌、镰孢菌引起花生根腐病均效果明显，且能显著提高花生出苗率和成苗率。

山东省花生研究所多年来一直进行花生生物防治研究，筛选出对花生病害防治效果较好菌株20多株，其中以筛选的侧孢芽孢杆菌LX12(菌种保藏编号为CGMCC No.7420)对花生根腐病防效最好，该菌株活力强，繁殖快，耐高温，耐酸碱，在pH5.0-9.0的条件下仍能存活，且对花生根结线虫病有一定防效。我们对该菌株进行发酵条件和培养基优化，筛选优良载体,经载体吸附后制成菌剂。2011和2012年在山东省青岛市、临沂市和泰安市进行田间应用，制成的菌剂对根腐病有较好的防治效果,防效接近60%，得到农技部门、科研人员和农民的一致认可。

但是现有的生防菌剂在应用过程中存在防效不稳定、起效速度慢、作用时间长、难以抵抗环境因素影响等多种问题，使得微生物菌剂的发展受到阻碍，选择新剂型、新助剂，延长活性成分的保质期，是目前亟待解决的问题。针对这些不足，国内已进行非水性剂的开发、紫外光保护剂的应用、增效剂的开发以及各种剂型的研制等工作。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，提出一种短小芽孢杆菌，作用于花生根际生态环境，具有很好的防治花生土传病害能力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种短小芽孢杆菌(Bacilius.Pumilus)LX11菌株，2013年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.7419。

一种如上所述短小芽孢杆菌LX11菌株的培养方法，包括以下步骤：

⑴取花生根际土壤放入蒸馏水中，摇动片刻，吸取上层液加入到无菌水中，制成悬液；

⑵取步骤⑴土壤悬浊液滴加到含2～5%利福平的LB固体培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于28℃恒温培养箱培养1～2天。

优选的，所述LB固体培养基的配方为:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和琼脂粉15g/L。

优选的，步骤⑵培养后的菌置于LB固体培养基平板上，画线倒置于28℃恒温培养箱培养1～2天。

如上所述短小芽孢杆菌LX11菌株在防治花生病害方面的应用。

优选的，包括抑制花生根腐病菌、花生白绢病菌及花生茎腐病菌的作用。

优选的，包括以下步骤：

①.LX11菌株的培养：取花生根际土壤放入蒸馏水中，摇动片刻，吸取上层液加入到无菌水中，制成悬液；取土壤悬浊液滴加到含2～5%利福平的LB固体培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于28℃恒温培养箱培养1～2天；

②.真菌的培养：在无菌操作台中将花生根腐病菌、花生白绢病菌及花生茎腐病菌用镊子取约0.5cm×0.5cm的正方形小块接种至PDA培养基中，于28℃温室中倒置培养3天；

③.接种：待步骤②真菌长至约占培养皿1/3大小时在距离真菌1～2c处接种细菌，继续放置28摄氏度温室培养2～3天。

优选的，所述PDA培养基组成为：马铃薯300克、葡萄糖20克、琼脂15～20克和自来水1000毫升，pH值自然。

与现有技术相比，本发明提供的短小芽孢杆菌LX11菌株在防治花生根腐病、白绢病和茎腐病上显著效果，不但对病原菌有明显的拮抗作用，而且在盆栽和田间防治花生病害方面疗效显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。

实施例1短小芽孢杆菌LX11菌株培养和分离

LB固体培养基的配方为:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和琼脂粉15g/L，121℃灭菌15min后备用。

培养方法：称取5g花生根际土壤放入45ml蒸馏水的三角瓶中，摇动片刻，吸取上层液0.1ml加入到含有4.5ml无菌水试管中，制成1：100浓度的悬液，然后分别吸取10^-2和10^-3土壤悬浊液各0.2ml滴加到含利福平的LB固体培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于28℃恒温培养箱培养1～2天。

分离菌株：挑取平板上的一批单菌落于LB固体培养基平板上画线倒置于28℃恒温培养箱培养1～2天。

实施例2LX11菌株的鉴定

⑴、菌株DNA提取：

参考照TIANGEN TIANampBACTERia DNA Kit试剂盒提取实施例中LX11菌株的总DNA，其步骤如下：

1.取细菌培养液1mL，10000rpm离心1min，尽量吸净上清；

2.向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，震荡至菌体彻底悬浮；

3.加入4μLRNAase（100mg/mL）溶液，震荡15s，室温放置5min；

4.向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；

5.加入220μL缓冲液GB，震荡15s，70℃放置10min，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

6.加入220μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

7.将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱GB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；

8.向吸附柱CB3中放入500μL缓冲液GD（使用前检查是否加收入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；

9.向吸附柱CB3中放入700μL漂洗液PW（使用前检查是否加收入无水乙醇），12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；

10.向吸附柱CB3中放入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱CB3中放入收集管中；

11.将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

12.将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。

⑵、PCR与序列测定：

将上述提取的DNA参照TaKaRa公司的16s rDNA BacterialIdentification PCR Kit试剂盒说明书进行PCR扩增，其中正向引物为：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，反向引物为：3’-CGCTTACCTTGTTACGACTT-5’。PCR扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min；53℃退火1min；72℃延伸90s；72℃后延伸5min，共30个循环。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后置于3UVTMTransilluminator(UVP,USA)下进行观察。

根据预先设计的引物与预期扩增片段大小，结合Marker，目的片段在紫外灯下切割下来，用回收试剂盒Silica Bead DNA GelExtraction Kit进行DNA的回收。16s rDNA序列测定由宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定。通过BLAST程序将测定的序列与GenBank（NCBI，网站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的序列比较，然后从GenBank中获得和试验菌株序列相近种、属的16s rDNA序列进行确定。

完整序列为：

GGGAGGCGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCATAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGATTT

利用NCBI网站上的BLAST程序对该序列进行序列比对，获得已定名的与之相似的属、种的相关信息，结果显示该活性菌株的16s rDNA序列与GenBank基因库中的短小芽孢杆菌(Bacilius.Pumilus)的16s rDNA序列高度同源，菌株LX11与短小芽孢杆菌(Bacilius.Pumilus)单独构成一个分支，进化上的距离最近，反映出它们之间亲缘关系最近。结合传统的生理生化特性鉴定以及16S rDNA序列分析的结果，判定菌株LX11为短小芽孢杆菌(Bacilius.Pumilus)。

实施例3LX11菌株抑制真菌能力

3.1真菌的培养

在无菌操作台中将花生根腐病菌、花生白绢病菌及花生茎腐病菌用镊子取约0.5cm*0.5cm的正方形小块接种至PDA培养基中，于28℃温室中倒置培养3天。

3.2接种细菌

待真菌长至约占培养皿1/3大小时在距离真菌1-2cm处接种实施例2菌株，继续放置28摄氏度温室培养2-3天，观察真菌生长状况。

抑菌率=[(对照真菌生长半径-处理真菌生长半径)/对照真菌生长半径]×100%。

LX11菌株对花生根腐病、白绢病和茎腐病的对峙试验共进行3次，抑制作用明显（见表1、2、3），由此表明，LX11对病原菌有明显的拮抗作用，可以作为潜力生防菌株。

表1LX11与花生根腐病的对峙实验结果（三批实验，每次三个重复）

表2LX11与花生白绢病的对峙实验结果（三批实验，每次三个重复）

表3LX11与花生茎腐病的对峙实验结果（三批实验，每次三个重复）

实施例4LX11菌株对盆栽和田间防治花生病害试验

4.1菌株发酵液制备将实施例2菌株活化后接入LB液体培养基，置于28度摇床中180r/min震荡培养3d。LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L酵母提取物5g/L和氯化钠5g/L；

4.2分别在播种期、播种后5d、10d、15d利用LX11发酵液灌根，每个处理10盆，每盆3株，每盆每次浇稀释100倍发酵液100mL。设置50%多菌灵800倍液和清水两个对照。种植后调查花生根腐病、花生白绢病及花生茎腐病的发病情况。

病株率=发病株数/总株数×100%

病情指数=∑(发病级代表值×各级病株数)×100/(调查总株数×最高级发病代表值)

防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100%

用LX11菌株的发酵液处理花生菌株，室内盆栽和大田试验均表明对花生根腐病、白绢病和茎腐病均有明显防治效果（表4、5、6）。

表4菌株LX11对花生根腐病的防治效果

表5菌株LX11对花生白绢病的防治效果

表6菌株LX11对花生茎腐病的防治效果

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种短小芽孢杆菌(Bacilius.Pumilus)LX11菌株，2013年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.7419。

2.一种如权利要求1所述短小芽孢杆菌LX11菌株的培养方法，包括以下步骤：

⑴取花生根际土壤放入蒸馏水中，摇动片刻，吸取上层液加入到无菌水中，制成悬液；

⑵取步骤⑴土壤悬浊液滴加到含2～5%利福平的LB固体培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于28℃恒温培养箱培养1～2天。

3.如权利要求2所述培养方法，其特征在于：所述LB固体培养基的配方为:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L和琼脂粉15g/L。

4.如权利要求2所述培养方法，其特征在于：步骤⑵培养后的菌置于LB固体培养基平板上，画线倒置于28℃恒温培养箱培养1～2天。

5.如权利要求1所述短小芽孢杆菌LX11菌株在防治花生病害方面的应用。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于：包括抑制花生根腐病菌、花生白绢病菌及花生茎腐病菌的作用。

7.如权利要求6所述应用，包括以下步骤：

①.LX11菌株的培养：取花生根际土壤放入蒸馏水中，摇动片刻，吸取上层液加入到无菌水中，制成悬液；取土壤悬浊液滴加到含2～5%利福平的LB固体培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于28℃恒温培养箱培养1～2天；

②.真菌的培养：在无菌操作台中将花生根腐病菌、花生白绢病菌及花生茎腐病菌用镊子取约0.5cm×0.5cm的正方形小块接种至PDA培养基中，于28℃温室中倒置培养3天；

③.接种：待步骤②真菌长至约占培养皿1/3大小时在距离真菌1～2cm处接种细菌，继续放置28摄氏度温室培养2～3天。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于：所述PDA培养基组成为：马铃薯300克、葡萄糖20克、琼脂15～20克和自来水1000毫升，pH值自然。