CN102965306A - 一种枯草芽孢杆菌及其在抗曲霉菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在抗曲霉菌中的应用。本发明枯草芽孢杆菌对黄曲霉菌具有拮抗作用。本发明从土壤中筛选对黄曲霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：a.细菌分离；b.曲霉的培养及孢子液的制备；c.抗曲霉菌株的筛选；d.抗曲霉菌株的复筛。通过黄曲霉毒素平板筛选试验和产毒黄曲霉拮抗试验，从花生种植田间、储存仓库中筛选黄曲霉拮抗菌株。建立合理、有效的黄曲霉拮抗菌株的筛选方法，得到适合需要的黄曲霉毒素抑制菌株。本发明应用于花生等农作物收获前后以及储存期间等易被黄曲霉毒素污染的阶段，能够提高出口花生等农作物的黄曲霉毒素防控水平，降低出口风险，促进农作物及其制品的出口贸易。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及微生物的检测及应用技术领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其在抗曲霉菌中的应用。
背景技术
黄曲霉毒素作为一种天然毒素，在花生田间生长时就可产生。即便通过良好的管理规范也无法将黄曲霉毒素毒素从食物链中去除。生物控制法是刚刚新兴的一种方法，主要是利用微生物间的拮抗，寻找对黄曲霉有抑制作用的微生物；或者通过转基因技术对产毒黄曲霉进行基因修饰，使不产毒的黄曲霉成为可能污染食品的优势菌种，来达到对黄曲霉毒素的控制作用。它经济、有效、并且不会对环境造成二次污染，有望从源头对花生黄曲霉毒素污染加以控制。
到目前为止，国内还没有开发出成型、经济的生物控制剂产品。生物控制剂作为黄曲霉毒素控制的一种很好的手段急需加以研究和开发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，通过黄曲霉毒素平板筛选试验和产毒黄曲霉拮抗试验，从花生种植田间、储存仓库中筛选黄曲霉拮抗菌株。建立合理、有效的黄曲霉拮抗菌株的筛选方法，并对筛选出的拮抗菌的作用效果、安全性进行评估，得到适合需要的黄曲霉毒素抑制菌株。通过细菌分离，发酵培养；制备曲霉的培养及孢子悬液；筛选抗曲霉菌株；抗曲霉菌株的复筛等一系列工作，形成安全、有效、经济的黄曲霉毒素生物控制剂产品。将产品应用于农作物(花生等)收获前后以及储存期间等易被黄曲霉毒素污染的阶段，提高出口农作物(花生等)的黄曲霉毒素防控水平，降低出口风险，促进农作物(花生等)及其制品的出口贸易。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌对黄曲霉菌具有拮抗作用，其保藏编号为：CCTCC M 2012217。保藏日期为2012年6月8日。保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏中心地址：中国.武汉.武汉大学。分类命名为：枯草芽孢杆菌21-1-2(Bacillus subtilis21-1-2)。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种从土壤中筛选对黄曲霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
a.细菌分离；
b.曲霉的培养及孢子液的制备；
c.抗曲霉菌株的筛选；
d.抗曲霉菌株的复筛。
所述步骤a可以进一步包括：称取土壤样品5～10g，加入50～100ml无菌生理盐水，涡旋混匀1～3min，制成体积比为1∶10的悬液，分别用微量移液器吸取100～200μl，涂布LB平板，37℃培养24～36h，挑取单菌落纯化。所述步骤b可以进一步包括：将产毒黄曲霉菌和无毒黄曲霉菌接种到PDA斜面，28℃培养6d，待孢子充分形成后，每个试管中加入4～8ml已灭菌的0.9％生理盐水，震荡后用血球计数板计数，并调至100～110/ml，4℃保存。
所述步骤c可以进一步包括：移液枪取100μl步骤b制备好的孢子液于PDA平板上，涂布器将孢子液涂干；将步骤a分离纯化得到的菌株点种到平板上，每个菌株做两个平行样，28℃培养48h后观察试验菌株周围是否存在抑菌圈。
所述步骤d可以进一步包括：用接种环取步骤c初筛过程中选出的有抑菌活性的菌株一环，接于LB液体培养基中37℃，190r/min发酵24～26h，8000r/min离心10～20min，用一次性滤器过滤滤除菌体；移液枪取100μl制备好的孢子液于PDA平板上，用涂布器将孢子液涂干，每个板上放置三个牛津杯，分别用移液枪加入100μl、200μl滤液，100μl生理盐水作为对照，置于28℃恒温培养箱中培养48h，观察试验菌株周围是否有抑菌圈并用十字测量法测定抑菌圈直径。
为解决上述技术问题，本发明又提供了一种枯草芽孢杆菌，包含下述基因序列：
CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。
为解决上述技术问题，本发明再提供了一种枯草芽孢杆菌，采用如下方法进行鉴定时，包含下述基因序列：
鉴定方法：枯草芽孢杆菌37℃肉汤中培养过夜，取3ml菌液使用OMEGABacterial DNA kit(D3350-01)试剂盒提取基因组DNA；16S rDNA基因序列PCR反应：上游引物：AGAGTTTGATCATGGCTCAG，下游引物：TACGGTTACCTTGTTACGACTT。反应条件：94℃5min；94℃45s，58 ℃30s，72℃45s，共30个循环；72℃10min；
测得的基因序列为：
CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种所述枯草芽孢杆菌在农产品对黄曲霉菌拮抗中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种所述枯草芽孢杆菌在制备黄曲霉菌拮抗制剂中的应用。
本发明有益的技术效果在于：通过黄曲霉毒素平板筛选试验和产毒黄曲霉拮抗试验，从花生种植田间、储存仓库中筛选黄曲霉拮抗菌株。建立合理、有效的黄曲霉拮抗菌株的筛选方法，得到适合需要的黄曲霉毒素抑制菌株。通过细菌分离，发酵培养；制备曲霉的培养及孢子悬液；筛选抗曲霉菌株；抗曲霉菌株的复筛等一系列工作，形成安全、有效、经济的黄曲霉毒素生物控制剂产品。本发明应用于花生等农作物收获前后以及储存期间等易被黄曲霉毒素污染的阶段，能够提高出口花生等农作物的黄曲霉毒素防控水平，降低出口风险，促进农作物及其制品的出口贸易。
附图说明
图1为本发明实施例所述枯草芽孢杆菌21-1-2对黄曲霉菌丝延长的抑制作用照片；
图2为本发明实施例对比使用枯草芽孢杆菌17-3对黄曲霉菌丝延长的抑制作用照片；
图3为本发明实施例对比使用枯草芽孢杆菌38-3对黄曲霉菌丝延长的抑制作用照片。
图4为本发明实施例所述枯草芽孢杆菌16S rDNA序列构建的系统进化树。
具体实施方式
黄曲霉拮抗菌的筛选
1实验材料
1.1实验菌株
样品来源
潍坊诸城，青岛莱西的大片花生种植区采取土壤样品，进行选择性分离，以期得到目标菌。
1.2实验仪器
DHG系列电热恒温鼓风干燥箱 (上海新苗医疗器械制造有限公司)
精密电子天平 (上海民桥精密科学仪器有限公司)
电子万用炉 (北京市永光明医疗仪器厂)
不锈刚手提式灭菌器 (上海申安医疗器械厂)
单人双面超净工作台 (苏州安泰技术有限公司)
HZQ-C空气浴振荡器 (哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)
SPX型智能生化培养箱 (宁波东南仪器有限公司)
台式离心机及离心管 (上海安亭科学仪器厂)
旋转蒸发仪
牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm)
试管
培养皿
三角瓶
烧杯
细菌过滤器
移液枪及枪头
镊子
酒精灯
涂布器
打孔器
滤纸
接种环
1.3培养基
PDA固体培养基(真菌培养基)：
土豆去皮切块，称取200g加入500ml水，煮沸30min。双层纱布过滤至烧瓶中，加入20g蔗糖，20g琼脂粉，加水至1L，115℃高压灭菌20min。
PDA液体培养基：上述操作不加琼脂。
营养肉汤：购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM106。称取19g粉末加入1L水，加热煮沸至完全溶解，分装。121℃高压灭菌15min。
营养琼脂：购于北京路桥技术有限责任公司，货号CM107。称取33g粉 末加入1L水，加热煮沸至完全溶解，分装。121℃高压灭菌15min。冷却至46℃左右倒平板或斜面。
1.4供试菌株：
黄曲霉(Aspergillus flavus)2890，编号CGMCC3.2890；
黄曲霉(Aspergillus flavus)3950，编号CGMCC3.3950；
寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)3，124，编号CGMCC3.124；
均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
2实验方法
2.1细菌分离
称取土壤样品5g，加入50ml无菌生理盐水，涡旋混匀1min，制成比例为1∶10(V/V)的悬液，分别用微量移液器吸取100μl，涂布LB平板，37℃培养24h，挑取单菌落纯化。
2.2抗曲霉菌株的筛选
曲霉的培养及孢子液的制备：将实验室保存的产毒和无毒曲霉接种到PDA斜面，28℃培养6d，待孢子充分形成后，每个试管中加入4ml已灭菌的0.9％生理盐水，充分震荡后用血球计数板计数，并调至107/ml，4℃保存。
抗曲霉菌株的初筛：移液枪取100μl制备好的孢子液于PDA平板上，涂布器将孢子液涂干。将分离纯化得到的菌株点种到平板上，每个平板数量适宜，每个菌株做两个平行。28℃培养48h后观察试验菌株周围是否存在抑菌圈。
抗曲霉菌株的复筛：用接种环取初筛过程中选出的有抑菌活性的菌株一环，接于LB液体培养基中37℃，190r/min发酵24h，8000r/min离心10min，用一次性滤器过滤滤除菌体。移液枪取100μl制备好的孢子液于PDA平板上，用涂布器将孢子液涂干，每个板上放置三个牛津杯，分别用移液枪加入100μl、200μl滤液，100μl生理盐水作为对照，置于28℃恒温培养箱中培养48h，观察试验菌株周围是否有抑菌圈并用十字测量法测定抑菌圈直径。
2.3对曲霉孢子萌发的抑制
将2种产毒曲霉-黄曲霉2890和寄生曲霉3，124的孢子浓度调整为1×106CFU/mL，每种曲霉孢子分别与终浓度为1×107CFU/mL的枯草芽孢杆菌混合培养于PDA液体培养基中(以不加枯草芽孢杆菌的PDA液体培养基为对 照)，放入28℃摇床培养，分别于培养6h和18h后显微镜观察曲霉孢子萌发情况，每个处理随机观察50个黄曲霉孢子，计算孢子萌发率.实验重复4次.
2.4抑制黄曲霉菌丝延长
用无菌打孔器打直径6mm的长有曲霉的琼脂块倒置于PDA培养基平板中央，在距其2cm处分别放置4个直径6mm的无菌滤纸片。将鉴定出的几株细菌37℃肉汤中培养过夜(调整浓度为1×107CFU/mL)，在每张滤纸片上分别滴加10μL的细菌培养液，灭菌生理盐水作为对照，每株细菌重复3次在28℃恒温培养箱中培养6d.
2.5对黄曲霉毒素生物合成的抑制实验
将2种产毒曲霉-黄曲霉2890和寄生曲霉3，124的孢子浓度调整为1×106CFU/mL，分别与终浓度为1×107CFU/mL的枯草芽孢杆菌混合培养于PDA液体培养基中(以不加枯草芽孢杆菌的PDA液体培养基为对照)，28℃下摇床培养4d，Beacon黄曲霉毒素固相萃取柱纯化后，LC-MS/MS检测黄曲霉毒素含量.实验重复3次.
2.6对黄曲霉毒素的分解作用
选取复筛枯草芽孢杆菌菌株接种于肉汤培养基中发酵24h，取5mL菌体发酵液加入黄曲霉毒素4种的标准品至终浓度为20ppb，以无菌的发酵液加入黄曲霉毒素4种作为空白对照，将其置于37℃培养箱培养，2d，4d，6d分别取样，检测黄曲霉毒素的含量，3次重复实验。
2.7菌株鉴定
基因组DNA的提取：枯草芽孢杆菌37℃肉汤中培养过夜，取3ml菌液使用OMEGA Bacterial DNA kit(D3350-01)试剂盒提取。
16S rDNA基因序列PCR反应：上游引物：AGAGTTTGATCATGGCTCAG，下游引物：TACGGTTACCTTGTTACGACTT。反应条件：94℃5min；94℃45s，58℃30s，72℃45s，共30个循环；72℃10min。
测得的基因序列为：
CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAAC CGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。
序列的数据处理：测序结果在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)使用Blast比对。
菌株Y-21-1-2的16S rDNA序列NCBI比对结果
如图4所示，为本发明实施例所述枯草芽孢杆菌16S rDNA序列构建的系统进化树。从GenBank数据库中获得与菌株16S rDNA同源的公认标准序列数据，使用MEGA 4.1软件计算序列相似性并作系统发育分析。系统进化树中，进化树分支上的支持率表明同源性的高低。由上图可以看出，菌株21-1-2与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有最高的同源性，应属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
3实验结果与分析
3.1抗曲霉菌株的筛选
通过牛津杯法筛选出了9株微生物对黄曲霉有一定的抑菌作用，其中2株抑制作用比较明显，对黄曲霉的抑菌圈直径在2cm以上，本发明对其进行了重点研究。
3.2对黄曲霉孢子萌发的抑制作用
通过表1可以看出，2株枯草芽孢杆菌对两种曲霉孢子的萌发具有明显的抑制作用，与枯草芽孢杆菌混合培养后两种曲霉孢子的萌发率均显著降低。
表1.2种枯草芽孢杆菌对两种曲霉孢子萌发的抑制作用
3.3对曲霉菌丝延长的抑制作用
枯草芽孢杆菌对黄曲霉菌丝延长的抑制作用见图1至图3。其中图1至图3分别为三种枯草芽孢杆菌对三种曲霉菌丝延长的抑制作用，图中标号为三种曲霉编号。四个滤纸片分别滴加了10μL的细菌培养液，图1：21-1-2，图2：17-3，图3：38-3。
从图1-图3中可以看出，含1×107CFU/mL枯草芽孢杆菌培养液处理后，在滤纸片周围有白色枯草芽孢杆菌菌落，与对照相比曲霉生长受到明显地抑制。
3.4对黄曲霉毒素生物合成的抑制
枯草芽孢杆菌抑制黄曲霉毒素生物合成的实验结果表明，枯草芽孢杆菌21-1-2在28℃培养6d后能够显著的抑制黄曲霉毒素的合成；枯草芽孢杆菌21-1-2对寄生曲霉3，124产生黄曲霉毒素的抑制作用可达99.8％。
表2.2株枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素生物合成的抑制作用
3.5对黄曲霉毒素的分解作用
如表3所示，2株枯草芽孢杆菌都具有降解黄曲霉毒素的作用，随着时间的增加对黄曲霉毒素的降解率升高，6d时枯草芽孢杆菌17-3对黄曲霉毒素的降解率最高可达90％。
表3.2株枯草芽孢杆菌对黄曲霉毒素的分解作用
所有上述为这一知识产权的首要实施方法，并没有设定限制以其他形式实施这种新方法和/或新产品。本领域技术人员将利用这一重要信息，对上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有基于本发明的修改或改造新方法，属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依 据本发明的技术实质对以上实例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌21-1-2(Bacillus subtilis21-1-2)，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌21-1-2对黄曲霉菌具有拮抗作用，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2012217。
2.一种从土壤中筛选对黄曲霉菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.细菌分离；
b.曲霉的培养及孢子液的制备；
c.抗曲霉菌株的筛选；
d.抗曲霉菌株的复筛。
3.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤a进一步包括：称取土壤样品5～10g，加入50～100ml无菌生理盐水，涡旋混匀1～3min，制成体积比为1∶10的悬液，分别用微量移液器吸取100～200μl，涂布LB平板，37℃培养24～36h，挑取单菌落纯化。
4.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤b进一步包括：将产毒黄曲霉菌和无毒黄曲霉菌接种到PDA斜面，28℃培养6d，待孢子充分形成后，每个试管中加入4～8ml已灭菌的0.9％生理盐水，震荡后用血球计数板计数，并调至100～110/ml，4℃保存。
5.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤c进一步包括：移液枪取100μl步骤b制备好的孢子液于PDA平板上，涂布器将孢子液涂干；将步骤a分离纯化得到的菌株点种到平板上，每个菌株做两个平行样，28℃培养48h后观察试验菌株周围是否存在抑菌圈。
6.根据权利要求2所述枯草芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，所述步骤d进一步包括：用接种环取步骤c初筛过程中选出的有抑菌活性的菌株一环，接于LB液体培养基中37℃，190r/min发酵24～26h，8000r/min离心10～20min，用一次性滤器过滤滤除菌体；移液枪取100μl制备好的孢子液于PDA平板上，用涂布器将孢子液涂干，每个板上放置三个牛津杯，分别用移液枪加入100μl、200μl滤液，100μl生理盐水作为对照，置于28℃恒温培养箱中培养48h，观察试验菌株周围是否有抑菌圈并用十字测量法测定抑菌圈直径。
7.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，包含下述基因序列：
CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。
8.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，采用如下方法进行鉴定时，包含下述基因序列：
鉴定方法：枯草芽孢杆菌37℃肉汤中培养过夜，取3ml菌液使用OMEGABacterialDNA kit(D3350-01)试剂盒提取基因组DNA；
16SrDNA基因序列PCR反应：上游引物：AGAGTTTGATCATGGCTCAG，下游引物：TACGGTTACCTTGTTACGACTT。反应条件：94℃5min；94℃45s，58℃30s，72℃45s，共30个循环；72℃10min；
测得的基因序列为：
CGTGGCGGGGTGCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAGAAAAA。
9.一种如权利要求1，7，8中任一项所述枯草芽孢杆菌在农产品对黄曲霉菌拮抗中的应用。
10.一种如权利要求1，7，8中任一项所述枯草芽孢杆菌在制备黄曲霉菌拮抗制剂中的应用。
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