CN113604368A - 一种复合菌剂及其检测方法、复合菌制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及有害微生物防治菌剂的技术领域，具体公开了一种复合菌剂及其检测方法、复合菌制剂及其用途。所述复合菌剂由不产黄曲霉毒素的霉菌组成；具体包括A‑1菌株、A‑2菌株、F‑501菌株、H‑1菌株以及Q‑281菌种中的至少两种；以及上述复合菌剂对产毒黄曲霉抑制作用的检测方法；以及包括上述复合菌剂及可用于承载复合菌剂的菌剂载体的复合菌制剂；以及该复合菌制剂的用途。本申请能够提高生物脱毒法在产毒黄曲霉及黄曲霉毒素防治方面的应用。

Description

一种复合菌剂及其检测方法、复合菌制剂及其用途
技术领域
本申请涉及有害微生物防治菌剂的技术领域，更具体地说，它涉及一种复合菌剂及其检测方法、复合菌制剂及其用途。
背景技术
黄曲霉毒素对人畜有强烈的致病性和致癌性，严重危害人体健康，已被世界卫生组织的癌症研究机构划为ⅣA级(I类)危险物。产毒黄曲霉在自然界中广泛存在，可以在田间感染农作物，并产生黄曲霉毒素，因而常导致植物性食物或饲料污染，如小麦、稻米、花生、玉米、豆类、坚果以及牧草等，其中以玉米和花生受污染最为严重。其中以黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最强，毒性为氰化钾的10倍，砒霜的68倍。
目前，对黄曲霉毒素的防控方法主要有物理脱毒法、化学脱毒法和生物脱毒法。其中，物理脱毒法是利用物理措施，如温度、辐射、吸附、光学影像对黄曲霉毒素进行灭活或者是破坏把生物毒素致癌性等结构进行破坏，以此达到消解作用。在饲料生产过程中，物理吸附是常用的脱毒手段。化学脱毒法是让生物毒素结构在酸碱等条件下发生改变，破坏生物毒素的分子结构，降低或者是消除其毒性。但化学脱毒一般会破坏饲料的营养成分、影响口感质量，也有可能会残留一些试剂，造成一定的污染。生物脱毒法是利用微生物降解毒素，或者是用能抑制拮抗毒素的特定目标基因制成生物阻抗消解剂来达到脱毒的目的。
相对于物理脱毒法和化学脱毒法，生物脱毒法可有效解决饲料或者食品中黄曲霉毒素残留的问题。然而，生物脱毒法对其使用条件的要求较高，故生物脱毒法的广泛应用受到了限制。
发明内容
为了提高生物脱毒法在产毒黄曲霉及黄曲霉毒素防治方面的应用，本申请提供一种复合菌剂及其检测方法、复合菌制剂及其用途。
第一方面，本申请提供一种用于抑制产毒黄曲霉的复合菌剂，采用如下的技术方案：
一种用于抑制产毒黄曲霉的复合菌剂，所述复合菌剂由不产黄曲霉毒素的霉菌组成。
通过采用上述技术方案，本申请提供的复合菌剂是由霉菌组成的，而非细菌类微生物。一方面，从生物进化的角度来看，细菌为没有细胞核的原核生物，而霉菌是有细胞核和复杂细胞器的真核生物，可见，霉菌在细胞结构上比细菌更加复杂。同时，霉菌分泌物的种类也会比细菌分泌物的种类更加繁多，故利用同一霉菌的一种分泌物或者是多种分泌物同时抑制产毒黄曲霉生长的可能性更大。另一方面，霉菌的存活条件要比细菌的存活条件更加广泛，且霉菌的适应力要更强，而细菌的适应力则较弱，例如某些细菌在高温、高湿、营养缺乏等环境下还会形成芽孢休眠体，因此，相对细菌而言，霉菌的适应力要更强。
谷物等粮食作物均在自然环境下土壤中生长，不可抗逆的因素较多。而霉菌的菌落较大，其生长速度较快，其孢子容易四处飘落，能够在最短的时间占据有利空间，竞争营养物质，从而能够从空间和营养物质两方面与产毒黄曲霉竞争，从而使得产毒黄曲霉因缺乏生存空间或营养物质而缓慢生长，从而起到抑制产毒黄曲霉生长的作用。因此，选择霉菌作为产毒黄曲霉的生物防治菌，对产毒黄曲霉的防治以及抑制黄曲霉毒素的产量具有重要意义。
另外，本申请提供的复合菌剂中的霉菌选择的是不产黄曲霉毒素的霉菌。一方面，当选用产黄曲霉毒素的霉菌作为复合菌剂的基础菌株时，复合菌剂中产黄曲霉毒素的菌株会产生黄曲霉毒素，作为目的抑制菌株的产毒黄曲霉也产生黄曲霉毒素，因此，会导致整个复合菌剂作用的环境中的黄曲霉毒素增加，甚至无法辨别检测到的黄曲霉毒素是复合菌剂中的产黄曲霉毒素的霉菌产生的，还是作为目的抑制菌株的产毒黄曲霉产生的；另一方面，为了尽量避免在以复合菌剂中的产黄曲霉毒素的霉菌抑制产毒黄曲霉生长的过程中，在田间引入新的生物危机，给农作物带来新的黄曲霉危害，因此，本申请提供的复合菌剂中的基础菌株选择的是不产黄曲霉毒素的霉菌，从而有效提高了生物脱毒法在产毒黄曲霉及黄曲霉毒素防治方面的应用。
优选的，所述复合菌剂包括A-1菌株、A-2菌株、F-501菌株、H-1菌株以及Q-281菌种中的至少两种。
优选的，所述复合菌剂包括A-1菌株、A-2菌株和Q-281菌种中的至少两种。
本申请提供的复合菌剂中，A-1菌株为木霉属菌株，具体可以是Trichodermaharzianum；A-2菌株为木霉属菌株，具体可以是Trichoderma virens；F-501菌株为曲霉属菌株，具体可以是Aspergillus terreus；H-1菌株为根霉属菌株，具体可以是Rhizopusnigricans；Q-281菌株为青霉属菌株，具体可以是Penicillium oxalicum。
通过检测田间筛选出的不产黄曲霉毒素的霉菌对产毒黄曲霉生长的抑制作用，筛选出上述5株对产毒黄曲霉具有较好抑制作用的霉菌。经过试验分析，利用上述5株菌株中的至少两种菌株的任意组合形成的复合菌剂，尤其是利用A-1菌株、A-2菌株和Q-281菌种中的至少两种菌株的任意组合形成的复合菌剂，均可以对产毒黄曲霉的生长起到较好的抑制作用。
在一个具体的实施方式中，所述复合菌剂可以包含A-1菌株、A-2菌株。
在一个具体的实施方式中，所述复合菌剂可以包含A-1菌株、F-501菌株。
在一个具体的实施方式中，所述复合菌剂可以包含A-1菌株、H-1菌株。
在一个具体的实施方式中，所述复合菌剂可以包含A-1菌株、Q-281菌种。
在一个具体的实施方式中，所述复合菌剂可以包含A-2菌株、F-501菌株。
在一个具体的实施方式中，所述复合菌剂可以包含A-2菌株、H-1菌株。
在一个具体的实施方式中，所述复合菌剂可以包含A-2菌株、Q-281菌种。
在一个具体的实施方式中，所述复合菌剂可以包含A-1菌株、A-2菌株、F-501菌株。
在一个具体的实施方式中，所述复合菌剂可以包含A-1菌株、A-2菌株、H-1菌株。
在一个具体的实施方式中，所述复合菌剂可以包含A-1菌株、A-2菌株、Q-281菌种。
优选的，所述复合菌剂中A-1菌株的孢子浓度为1×104/mL～1×106/mL。
优选的，所述复合菌剂中A-2菌株的孢子浓度为1×104/mL～1×106/mL。
优选的，所述复合菌剂中Q-281菌种的孢子浓度为1×104/mL～1×106/mL。
通过采用上述技术方案，经过试验分析，当复合菌剂中包含A-1菌株、A-2菌株、Q-281菌种时，各菌株的孢子浓度分别限定在1×104/mL～1×106/mL的范围内时，制备的复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制作用最好。
在一个具体的实施方式中，各菌株的孢子浓度可以分别是1×104/mL、1×104/mL、1×104/mL。
在一个具体的实施方式中，各菌株的孢子浓度可以分别是1×104/mL、1×104/mL、1×105/mL。
在一个具体的实施方式中，各菌株的孢子浓度可以分别是1×104/mL、1×105/mL、1×105/mL。
在一个具体的实施方式中，各菌株的孢子浓度可以分别是1×104/mL、1×105/mL、1×104/mL。
在一个具体的实施方式中，各菌株的孢子浓度可以分别是1×104/mL、1×106/mL、1×104/mL。
在一个具体的实施方式中，各菌株的孢子浓度可以分别是1×104/mL、1×106/mL、1×105/mL。
在一个具体的实施方式中，各菌株的孢子浓度可以分别是1×104/mL、1×106/mL、1×106/mL。
第二方面，本申请提供一种上述复合菌剂对产毒黄曲霉抑制作用的检测方法，采用如下的技术方案：
一种复合菌剂对产毒黄曲霉抑制作用的检测方法，所述检测方法具体包括以下步骤：
制备培养基固体平板；
在培养基固体的两侧打孔，两孔径均距离培养基中心20-40mm，一孔注入混合均匀的100-300μL复合菌剂，另一孔注入同体积的产毒黄曲霉孢子悬液，并用同类培养基填充孔径至与平板表面齐平，作为试验组；在另一培养基固体平板正中心打孔，注入同体积产毒黄曲霉孢子悬液，并用同类培养基填充孔径至与平板表面齐平，作为对照组；
待填充孔径的培养基凝固后，将实验组与对照组均置于同等环境条件下培养，观察产毒黄曲霉与复合菌剂的生长状况，计算复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制率；
复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制率的计算公式如下：
抑制率(％)＝(对照组中产毒黄曲霉的生长面积-实验组中产毒黄曲霉的生长面积)/对照组中产毒黄曲霉的生长面积×100％。
在实验室阶段，复合菌剂中基础菌株的配方不同，对产毒黄曲霉生长的影响不同，为能得到最高效能的复合菌剂，本申请研究了不同配方的复合菌剂对产毒黄曲霉生长的影响。然而由于复合菌剂为液体，无法使用菌块对峙法来探究。在试验阶段，还考虑到将创建的复合菌剂与PDA培养基做成混合平板，使其生长，得到含有复合菌剂的菌块，但该方法不能保证所选取的复合菌剂的菌块中均含有复合菌剂中的三种菌株。
本申请进一步对菌块平板对峙法进行改进，在距离平板中心20-40mm的位置进行打孔，一孔注入混合均匀的产毒黄曲霉孢子悬液，另一孔注入等体积的、混合均匀的复合菌剂，用PDA培养基加入到两孔中，与孔径边缘齐平，培养基凝固，为了方便操作，选择温度为45℃的培养基。利用上述方法，一方面，可以保证含有复合菌剂中的三种菌株；另一方面，往孔径中加入温度适宜的培养基，可以让孢子悬液与培养基融合，进而凝固，在后续培养的过程中，可以倒置培养，不用担心培养的过程中，培养皿上的冷凝水滴落到培养基上影响试验以及试验结果的观察。
从复合菌剂与产毒黄曲霉的平板对峙试验效果来看，使用改进后的方法进行平板对峙，检测获得的复合菌剂对产毒黄曲霉生长的抑制效果更准确。
第三方面，本申请提供一种复合菌制剂，采用如下的技术方案：
一种复合菌制剂，所述复合菌制剂包括上述复合菌剂，以及可用于承载复合菌剂的菌剂载体。
优选的，所述菌剂载体为农作物中的秸秆、谷壳和/或干果的壳类。
通过采用上述技术方案，将复合菌剂负载于菌剂载体上，制成复合菌制剂，从而便于复合菌剂在田间的应用。另外，菌剂载体可以是农作物中的秸秆、谷壳，也可以是干果中的壳类，凡是能够作为真菌载体的物质，均可以作为本申请中的菌剂载体。同时，本申请中的菌剂载体选择的是农作物以及干果的废弃物，能够将该类废弃物重新利用到田间，做到了废物利用，已废治废，在抑制田间产毒黄曲霉的生长以及黄曲霉毒素产量的同时，还将其产生的废弃物进行了有效利用。
第四方面，本申请提供一种复合菌制剂的用途，采用如下的技术方案：
上述复合菌制剂的用途：将所述复合菌制剂直接放置于田间以抑制特定范围内的产毒黄曲霉的生长以及黄曲霉毒素B1的产量。
通过采用上述技术方案，本申请制备的复合菌制剂可用于田间，抑制特定范围内的产毒黄曲霉的生长以及黄曲霉毒素B1的产量，同时，其使用方法简便，不受其他条件的限制，能够进一步有效提高生物脱毒法在产毒黄曲霉及黄曲霉毒素防治方面的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请利用不产黄曲霉毒素的霉菌制成的复合菌剂，能够对产毒黄曲霉的生长以及黄曲霉毒素的产量起到较好的抑制作用，从而有效提高了生物脱毒法在产毒黄曲霉及黄曲霉毒素防治方面的应用。
2、本申请提供了复合菌剂对产毒黄曲霉抑制作用的检测方法，一方面，可以保证含有复合菌剂中的菌株；另一方面，往孔径中加入温度适宜的培养基，可以让孢子悬液与培养基融合，进而凝固，在后续培养的过程中，可以倒置培养，不用担心培养的过程中，培养皿上的冷凝水滴落到培养基上影响试验以及试验结果的观察。
3、本申请将复合菌剂负载于菌剂载体上，制成复合菌制剂，从而便于复合菌剂在田间的应用，同时，在抑制田间产毒黄曲霉的生长以及黄曲霉毒素产量的同时，还将其产生的废弃物进行了有效利用。
4、本申请制备的复合菌制剂可用于田间，抑制特定范围内的产毒黄曲霉的生长以及黄曲霉毒素B1的产量，同时，其使用方法简便，不受其他条件的限制，能够进一步有效提高生物脱毒法在产毒黄曲霉及黄曲霉毒素防治方面的应用。
附图说明
图1为实施例1-9制备的复合菌剂对产毒黄曲霉生长的抑制情况(其中，a-i分别表示实施例1-9制备的复合菌剂，每个实施例设置2个平行样；p表示产毒黄曲霉)。
具体实施方式
在本申请中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
本申请提供了一种用于抑制产毒黄曲霉的复合菌剂，该复合菌剂由不产黄曲霉毒素的霉菌组成。同时，该复合菌剂包括A-1菌株、A-2菌株、F-501菌株、H-1菌株以及Q-281菌种中的至少两种。
进一步地，所述复合菌剂包括A-1菌株、A-2菌株和Q-281菌种中的至少两种。其中，A-1菌株的孢子浓度为1×104/mL～1×106/mL；A-2菌株的孢子浓度为1×104/mL～1×106/mL；Q-281菌种的孢子浓度为1×104/mL～1×106/mL。
本申请提供的复合菌剂，能够对产毒黄曲霉的生长以及黄曲霉毒素的产量起到较好的抑制作用，从而有效提高了生物脱毒法在产毒黄曲霉及黄曲霉毒素防治方面的应用。
本申请还提供了上述复合菌剂对产毒黄曲霉抑制作用的检测方法，该检测方法具体包括以下步骤：
制备培养基固体平板；
在培养基固体的两侧打孔，两孔径均距离培养基中心20-40mm，一孔注入混合均匀的100-300μL复合菌剂，另一孔注入同体积的产毒黄曲霉孢子悬液，并用同类培养基填充孔径至与平板表面齐平，作为试验组；在另一培养基固体平板正中心打孔，注入同体积产毒黄曲霉孢子悬液，并用同类培养基填充孔径至与平板表面齐平，作为对照组；
待填充孔径的培养基凝固后，将实验组与对照组均置于同等环境条件下培养。观察产毒黄曲霉与复合菌剂的生长状况，计算复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制率；
复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制率的计算公式如下：
抑制率(％)＝(对照组中产毒黄曲霉的生长面积-实验组中产毒黄曲霉的生长面积)/对照组中产毒黄曲霉的生长面积×100％。
本申请还提供了一种复合菌制剂，该复合菌制剂包括上述制备的复合菌剂，以及可用于承载复合菌剂的菌剂载体。其中，菌剂载体为农作物中的秸秆、谷壳和/或干果的壳类。该复合菌制剂的用途可以是将上述复合菌制剂直接放置于田间以抑制特定范围内的产毒黄曲霉的生长以及黄曲霉毒素B1的产量。其使用方法简便，不受其他条件的限制，能够进一步有效提高生物脱毒法在产毒黄曲霉及黄曲霉毒素防治方面的应用。
本申请所用的培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司，具体成分及制备方法如下：
马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)：马铃薯200g，葡萄糖20g，去离子水1000mL，pH自然。称取200g土豆并切块，加去离子水1000mL，在加热器上加热至沸腾后，继续加热20-30min后，补水至1000mL，用双层纱布进行过滤，按照每瓶50mL分装至锥形瓶中，于121℃灭菌20min，常温保存。
马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)：在PDB液体培养基中加入琼脂至终浓度为1.5％-2％(w/v)，pH自然。按每瓶300mL分装于500mL三角瓶中，每管5mL分装于试管中，于121℃灭菌20min，试管摆置成斜面，常温保存。
黄曲霉固体培养基(AFPA)：蛋白胨10g，酵母提取物20g，柠檬酸铁铵0.5g，氯硝铵0.002g，氯霉素0.1g，琼脂15g，加去离子水定容至1000mL，pH 6.3±0.2，平均分装到锥形瓶中，于121℃灭菌20min，常温保存。
生理盐水：称取9g NaCI，加蒸馏水定容至1L。按照每瓶90mL分装于150mL三角瓶中，每管9mL分装于试管中，于121℃灭菌30min，常温保存。
本申请中所用的产毒菌株为黄曲霉GDMCC3.18 Aspergillus flavus，由华南农业大学食品学院保存，以下简称产毒黄曲霉。
本申请提供的复合菌剂中，A-1菌株为Trichoderma harzianum；A-2菌株为Trichoderma virens；F-501菌株为Aspergillus terreus；H-1菌株为Rhizopusnigricans；Q-281菌株为Penicillium oxalicum。
以下结合附图1、制备例1-5和实施例1-26对本申请作进一步详细说明。
制备例
制备例1
本制备例提供了一种从土壤样品中分离纯化霉菌的方法。其中，土壤样品采集点为广东省5种具有代表性的田地。
(1)土壤样品的采集
将番薯地、花生地、玉米地、香蕉地、艾草地作为土壤样品采集点，进行土壤样品的采集。
具体操作步骤如下：每个土壤样品采集点分别确定10m×10m的范围，并按照对角线均匀确定5个采集小样点；将每个采集小样点表层5cm厚的土壤除去，并采集20g土壤小样，获得5份土壤小样；将5份土壤小样混合作为一份土壤样品；最终每个土壤样品采集点获得一份100g的土壤样品；将每个土壤样品采集点的土壤样品装入塑料袋中，扎好并将塑料袋戳孔，便于土壤样品与外界进行气体交换，便于维持土壤样品中微生物的正常生理需求，4℃保存备用。
(2)土壤样品中霉菌的分离、纯化
分别对步骤(1)采集获得的5份土壤样品中的霉菌进行分离、纯化。
具体操作步骤如下：称取10g土壤样品于90mL灭菌生理盐水中，漩涡震荡1min后置于28℃摇床培养1h，为10-1土壤悬液；采用10倍系列稀释方法，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7土壤悬液；分别移取10-5、10-6、10-7梯度的土壤悬液100μL，涂布于PDA平板培养基上，每个处理重复3次，28℃黑暗条件下倒置培养5天。挑取生长速度较快的菌落边缘的菌丝，接种于新的PDA平板培养基上，重复3-4次，得到纯化的霉菌，4℃保存备用。
本制备例从上述5种土壤样品采集点获得的5种土壤样品中分离、纯化获得281株霉菌。
制备例2
本制备例提供了一种鉴定霉菌是否产黄曲霉毒素的方法。鉴定对象为制备例1分离纯化获得的霉菌。
具体操作步骤如下：分别将制备例1步骤(2)获得的霉菌培养至第3天，用波长为365nm的紫外笔照射，鉴别霉菌的产毒情况。鉴别方法具体为：观察霉菌菌落周围的培养基是否有蓝色或黄色荧光。若有荧光，表明该霉菌能够产生黄曲霉毒素，则舍去；若无荧光，表明该霉菌不产生黄曲霉毒素，继续培养该菌株，次日重复上述操作，直至第7天。
鉴定结果：制备例1纯化的281株霉菌中，有17株霉菌能够产生黄曲霉毒素，为产黄曲霉毒素的霉菌，舍去；其余264株为不产黄曲霉毒素的霉菌，4℃保存备用。
制备例3
本制备例提供了一种检测霉菌对产毒黄曲霉抑制作用的方法。检测对象为制备例2鉴定获得的264株不产黄曲霉毒素的霉菌，检测方法为对峙培养法，以获得其对产毒黄曲霉的抑制率。
具体操作步骤如下：
将产毒黄曲霉接种到PDA平板培养基上进行活化，待产毒黄曲霉菌落布满平板后，用接种环从菌落的外边缘挑取边长为5mm的方形菌丝块；将菌丝块接种至新鲜PDA平板培养基上，接种位置为距离新鲜PDA平板培养基中心10mm-20mm的位置；
分别将制备例2鉴定获得的不产黄曲霉毒素的霉菌接种到PDA平板培养基上进行活化，待不产黄曲霉毒素的霉菌菌落布满平板后，用接种环从菌落的外边缘挑取大约5mm的方形菌丝块；将菌丝块接种到已接种产毒黄曲霉菌丝块的新鲜PDA平板培养基上，接种位置为距产毒黄曲霉菌丝块40mm的位置；该接种产毒黄曲霉菌丝块和不产黄曲霉毒素的霉菌菌丝块的PDA平板培养基，作为对峙组；
同时，用接种环从产毒黄曲霉菌落的外边缘挑取另一边长为5mm的方形菌丝块，将菌丝块接种于新鲜PDA平板培养基的中央；该仅接种产毒黄曲霉菌菌丝块的PDA平板培养基，作为对照组；
将对峙组和对照组均置于28℃的条件下培养7天，对峙组和对照组均设置3组。分别观察接种后3天、5天、7天，产毒黄曲霉与不产黄曲霉毒素的霉菌的生长状况，并利用CAD软件计算培养至第7天的对峙结果，计算不产黄曲霉毒素的霉菌对产毒黄曲霉的抑制率。
不产黄曲霉毒素的霉菌对产毒黄曲霉的抑制率的计算公式如下：
抑制率(％)＝(对照组中产毒黄曲霉的生长面积-对峙组中产毒黄曲霉的生长面积)/对照组中产毒黄曲霉的生长面积×100％
检测结果：
264株不产黄曲霉毒素的霉菌中，有125株霉菌对产毒黄曲霉的抑制率在30％以上，有107株霉菌对产毒黄曲霉的抑制率在20-30％之间，其余霉菌对产毒黄曲霉的抑制率在10％以下。
根据不产黄曲霉毒素的霉菌在培养基上的生长速度、表现性能、对产毒黄曲霉生长的抑制效果进行综合考虑，挑选出5株不产黄曲霉毒素的霉菌进一步研究，分别命名为A-1、A-2、F-501、H-1、Q-281。上述5株不产黄曲霉毒素的霉菌对产毒黄曲霉的抑制率如表1所示。5株不产黄曲霉毒素的霉菌对产毒黄曲霉的生长抑制率均高于50％。其中，A-2菌株对产毒黄曲霉的抑制效果最强，抑制率达到66％；其次为H-1、F-501、Q-281、A-1，对产毒黄曲霉的抑制率分别为62％、61％、53％、51％。
表1 5株不产黄曲霉毒素的霉菌对产毒黄曲霉的抑制率
Figure BDA0003255348960000091
Figure BDA0003255348960000101
在对峙培养的过程中，培养至第3天，5株不产黄曲霉毒素的霉菌均已在培养基上占据大部分，其中H-1菌株生长速度最快，培养至第2天，其菌丝已明显超过培养基的一半，培养至第3天，目标菌H-1开始从平板上方空间向产毒黄曲霉菌块方向覆盖；培养至第5天，F-501菌株、Q-281菌株与产毒黄曲霉接触，两菌双方停止向前生长；A-1菌株、A-2菌株与产毒黄曲霉交界处有一条抑菌带。
制备例4
本制备例提供了一种检测霉菌发酵产物对产毒黄曲霉生长抑制作用的方法。检测对象为制备例3获得的5株不产黄曲霉毒素的霉菌。
具体操作步骤如下：
分别将A-1、A-2、F-501、H-1和Q-281菌株接种于PDA平板培养基上，并置于28℃的条件下培养3天；活化后的5种菌株分别接种于含有50mL PDB培养基的三角瓶中，置于28℃、180r/min的摇床中避光培养3天；分别取每种菌株的发酵液4000r/min离心30min，分别获得5种菌株的无菌上清液，4℃保存备用；
用接种环取一环产毒黄曲霉于1mL无菌水中，充分震荡，制成孢子悬液；移取0.5mL孢子悬液于50ml 45℃的PDA培养基中，充分混匀；
移取20mL新鲜的PDA培养基于灭菌培养皿内，充分凝固后，移取5mL含产毒黄曲霉孢子的PDA培养基于底层平板上迅速铺平，待凝固；每个平板放置牛津杯，10min后分别加入200μL每种菌株的无菌上清液，并设置无菌水为阴性对照，并置于28℃的温度条件下培养3天后，观察产毒黄曲霉生长受抑制的情况。
检测结果：检测结果如表2所示。
表2 5株不产黄曲霉毒素的霉菌发酵产物对产毒黄曲霉的抑制率
Figure BDA0003255348960000102
Figure BDA0003255348960000111
其中，A-2、F-501、H-1和Q-281菌株发酵产物粗提取物均对产毒黄曲霉的生长没有抑制作用，而A-1菌株的发酵产物粗提取物对产毒黄曲霉的生长具有抑制效果，其抑菌圈直径为18.00mm。结合制备例3的检测结果推测，A-1菌株除了能在生长营养空间上对黄曲霉进行拮抗作用外，其还能分泌或代谢某些产物，该产物能直接抑制产毒黄曲霉的生长，其余4株菌株可能是在生长营养空间上对黄曲霉进行拮抗作用。
制备例5
本制备例探究了制备例3获得的5株不产黄曲霉毒素的霉菌相互之间的生长抑制作用。具体操作步骤与制备例4中的操作步骤基本相同，不同之处在于：分别以5株不产黄曲霉毒素的霉菌中的一株为检测抑制率的对象，检测其余4株不产黄曲霉毒素的霉菌对该菌株的抑制率。
检测结果如表3所示。
表3 5株不产黄曲霉毒素的霉菌发酵产物对不产黄曲霉毒素的霉菌的生长抑制情况
Figure BDA0003255348960000112
其中，A-1菌株发酵产物对Q-281菌株的生长有抑制作用，抑菌圈直径为8.12mm；A-2菌株发酵产物对A-1菌株和F-501菌株的生长有抑制作用，抑菌圈直径均为10.52mm；F-501菌株发酵产物对A-1菌株的生长有抑制作用，抑菌圈直径为12.22mm；H-1菌株和Q-281菌株对其他菌株的生长均无抑制作用。
根据制备例1-5，以5种田地作为土壤样品采集点，筛选对产毒黄曲霉的生长有抑制作用的不产黄曲霉毒素的霉菌。经过筛选，共筛选出261株不产黄曲霉毒素的霉菌，其中，5种不产黄曲霉毒素的霉菌对产毒黄曲霉的抑制作用较好，该5种不产黄曲霉毒素的霉菌分别为A-1、A-2、F-501、H-1和Q-281菌株，以A-2菌株对产毒黄曲霉生长的抑制作用最好。通过进一步探究上述5种不产黄曲霉毒素的霉菌代谢产物对产毒黄曲霉生长的抑制作用，发现A-1菌株发酵产物对产毒黄曲霉的抑制作用最好。
另外，通过探究上述5种不产黄曲霉毒素的霉菌发酵产物对其他不产黄曲霉毒素的霉菌生长的抑制情况，发现F-501菌株发酵产物对A-1菌株的生长有抑制作用，Q-281菌株对其他菌株的生长均无抑制作用。虽然H-1菌株对其他菌株的生长也无抑制作用，但在H-1菌株培养的过程中发现，H-1菌株的生长速度较快，为了避免后期出现新的生物防治危机，H-1菌株并不是作为用于田间生物防治的理想菌种。
实施例
实施例1-9
实施例1-9分别提供了一种复合菌剂，均以A-1、A-2和Q-281菌株为基础菌株，制备复合菌剂。实施例1-9的不同之处在于制备的复合菌剂中，每种基础菌株孢子悬液的浓度。实施例1-9中，A-1、A-2和Q-281菌株各自对应的孢子悬液如表4所示。
具体操作步骤如下：
(1)将A-1、A-2和Q-281菌株分别接种到PDA斜面试管培养基上，置于28℃的恒温条件下培养5天；A-1菌株培养至第2天时，为白色菌丝；之后菌丝变成绿白相间，绿色部分随培养时间增长而加深，孢子为青绿色，卵圆形；A-2菌株生长速度快，培养至第2天，为白色菌丝，3天后菌丝呈浅黄绿色，孢子为黄绿色，球形；Q-281菌株培养至第3天，菌落呈浅黄色，之后慢慢呈现绿色，形成同心环纹，分生孢子梗呈扫帚状。
(2)分别向步骤(1)接种菌株后的PDA斜面试管中加入5mL无菌水，并将霉菌孢子刮下，倒入装有无菌水的三角瓶，置于摇床振荡1.5h；利用血球计数板计数孢子数，分别制备A-1、A-2、Q-281菌株的1×104/mL、1×105/mL及1×106/mL三种孢子浓度的悬液；
(3)按照表4所示的各实施例的孢子悬液浓度，分别取上述3种菌株的孢子悬液各200μL于灭菌EP管中，漩涡震荡1min，使孢子充分混匀，得到600μL的复合菌剂悬液，备用。
表4实施例1-9制备的复合菌剂中各菌株的孢子悬液
Figure BDA0003255348960000131
实施例10-12
实施例10-12分别提供了一种复合菌剂，均以A-1、A-2、Q-281和F-501菌株为基础菌株，制备复合菌剂。实施例10-12的不同之处在于制备的复合菌剂中，每种基础菌株孢子悬液的浓度。实施例10-12中，A-1、A-2、Q-281和F-501菌株各自对应的孢子悬液如表5所示。
具体操作步骤如下：
(1)将A-1、A-2、Q-281和F-501菌株分别接种到PDA斜面试管培养基上，置于28℃的恒温条件下培养5天；
(2)分别向步骤(1)接种菌株后的PDA斜面试管中加入5mL无菌水，并将霉菌孢子刮下，倒入装有无菌水的三角瓶，置于摇床振荡1.5h；利用血球计数板计数孢子数，分别制备A-1、A-2、Q-281、F-501菌株的1×104/mL、1×105/mL及1×106/mL三种孢子浓度的悬液；
(3)按照表5所示的各实施例的孢子悬液浓度，分别取上述4种菌株的孢子悬液各200μL于灭菌EP管中，漩涡震荡1min，使孢子充分混匀，得到800μL的复合菌剂悬液，备用。
表5实施例10-12制备的复合菌剂中各菌株的孢子悬液
Figure BDA0003255348960000132
Figure BDA0003255348960000141
实施例13-15
实施例13-15分别提供了一种复合菌剂，均以A-1、A-2、Q-281和H-1菌株为基础菌株，制备复合菌剂。实施例13-15的不同之处在于制备的复合菌剂中，每种基础菌株孢子悬液的浓度。实施例13-15中，A-1、A-2、Q-281和H-1菌株各自对应的孢子悬液如表6所示。
具体操作步骤如下：
(1)将A-1、A-2、Q-281和H-1菌株分别接种到PDA斜面试管培养基上，置于28℃的恒温条件下培养5天；
(2)分别向步骤(1)接种菌株后的PDA斜面试管中加入5mL无菌水，并将霉菌孢子刮下，倒入装有无菌水的三角瓶，置于摇床振荡1.5h；利用血球计数板计数孢子数，分别制备A-1、A-2、Q-281、H-1菌株的1×104/mL、1×105/mL及1×106/mL三种孢子浓度的悬液；
(3)按照表6所示的各实施例的孢子悬液浓度，分别取上述4种菌株的孢子悬液各200μL于灭菌EP管中，漩涡震荡1min，使孢子充分混匀，得到800μL的复合菌剂悬液，备用。
表6实施例13-15制备的复合菌剂中各菌株的孢子悬液
Figure BDA0003255348960000142
实施例16-18
实施例16-18分别提供了一种复合菌剂，均以A-1、A-2、F-501和H-1菌株为基础菌株，制备复合菌剂。实施例16-18的不同之处在于制备的复合菌剂中，每种基础菌株孢子悬液的浓度。实施例16-18中，A-1、A-2、F-501和H-1菌株各自对应的孢子悬液如表7所示。
具体操作步骤如下：
(1)将A-1、A-2、F-501和H-1菌株分别接种到PDA斜面试管培养基上，置于28℃的恒温条件下培养5天；
(2)分别向步骤(1)接种菌株后的PDA斜面试管中加入5mL无菌水，并将霉菌孢子刮下，倒入装有无菌水的三角瓶，置于摇床振荡1.5h；利用血球计数板计数孢子数，分别制备A-1、A-2、F-501、H-1菌株的1×104/mL、1×105/mL及1×106/mL三种孢子浓度的悬液；
(3)按照表7所示的各实施例的孢子悬液浓度，分别取上述4种菌株的孢子悬液各200μL于灭菌EP管中，漩涡震荡1min，使孢子充分混匀，得到800μL的复合菌剂悬液，备用。
表7实施例16-18制备的复合菌剂中各菌株的孢子悬液
Figure BDA0003255348960000151
实施例19-21
实施例19-21分别提供了一种复合菌剂，均以A-1、F-501、H-1和Q-281菌株为基础菌株，制备复合菌剂。实施例19-21的不同之处在于制备的复合菌剂中，每种基础菌株孢子悬液的浓度。实施例19-21中，A-1、F-501、H-1、Q-281菌株各自对应的孢子悬液如表8所示。
具体操作步骤如下：
(1)将A-1、F-501、H-1、Q-281菌株分别接种到PDA斜面试管培养基上，置于28℃的恒温条件下培养5天；
(2)分别向步骤(1)接种菌株后的PDA斜面试管中加入5mL无菌水，并将霉菌孢子刮下，倒入装有无菌水的三角瓶，置于摇床振荡1.5h；利用血球计数板计数孢子数，分别制备A-1、F-501、H-1、Q-281菌株的1×104/mL、1×105/mL及1×106/mL三种孢子浓度的悬液；
(3)按照表8所示的各实施例的孢子悬液浓度，分别取上述4种菌株的孢子悬液各200μL于灭菌EP管中，漩涡震荡1min，使孢子充分混匀，得到800μL的复合菌剂悬液，备用。
表8实施例19-21制备的复合菌剂中各菌株的孢子悬液
Figure BDA0003255348960000161
实施例22-24
实施例22-24分别提供了一种复合菌剂，均以A-2、F-501、H-1和Q-281菌株为基础菌株，制备复合菌剂。实施例22-24的不同之处在于制备的复合菌剂中，每种基础菌株孢子悬液的浓度。实施例22-24中，A-2、F-501、H-1、Q-281菌株各自对应的孢子悬液如表9所示。
具体操作步骤如下：
(1)将A-2、F-501、H-1、Q-281菌株分别接种到PDA斜面试管培养基上，置于28℃的恒温条件下培养5天；
(2)分别向步骤(1)接种菌株后的PDA斜面试管中加入5mL无菌水，并将霉菌孢子刮下，倒入装有无菌水的三角瓶，置于摇床振荡1.5h；利用血球计数板计数孢子数，分别制备A-2、F-501、H-1、Q-281菌株的1×104/mL、1×105/mL及1×106/mL三种孢子浓度的悬液；
(3)按照表9所示的各实施例的孢子悬液浓度，分别取上述4种菌株的孢子悬液各200μL于灭菌EP管中，漩涡震荡1min，使孢子充分混匀，得到800μL的复合菌剂悬液，备用。
表9实施例22-24制备的复合菌剂中各菌株的孢子悬液
Figure BDA0003255348960000171
实施例25
本实施例以产毒黄曲霉为基础菌株，制备产毒黄曲霉的孢子悬液。具体操作方法如下：
(1)将产毒黄曲霉接种到PDA斜面试管培养基上，置于28℃的恒温条件下培养5天；
(2)向步骤(1)接种菌株后的PDA斜面试管中加入5mL无菌水，并将霉菌孢子刮下，倒入装有无菌水的三角瓶，置于摇床振荡1.5h；利用血球计数板计数孢子数，制备产毒黄曲霉的1×105/mL孢子浓度的悬液；备用。
检测试验一
检测实施例1-9制备的复合菌剂对实施例25制备的产毒黄曲霉孢子悬液的抑制率。
具体操作步骤如下：
在PDA平板的两侧进行打孔，孔的直径分别为5mm，两孔径均距离培养基中心20mm，一孔注入混合均匀的200μL复合菌剂，另一孔注入200μL产毒黄曲霉孢子悬液，并用PDA培养基填充孔径至与平板表面齐平，作为试验组；在另一块PDA平板正中心打孔，注入200μL产毒黄曲霉孢子悬液，并用PDA培养基填充孔径至与平板表面齐平，此为对照组；每处理重复2次。
待填充孔径的PDA培养基凝固后，将实验组与对照组均置于28℃的环境条件下培养7天。观察接种后3天、5天、7天产毒黄曲霉与复合菌剂的生长状况。利用CAD软件对培养至第7天的对峙结果，计算复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制率。
复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制率的计算公式如下：
抑制率(％)＝(对照组中产毒黄曲霉的生长面积-实验组中产毒黄曲霉的生长面积)/对照组中产毒黄曲霉的生长面积×100％
图1为实施例1-9制备的复合菌剂对产毒黄曲霉生长的抑制情况，同时，实施例1-9相应的抑制结果如表4所示。
结合表4和图1，可知实施例1-9利用A-1、A-2和Q-281菌株制备的复合菌剂对产毒黄曲霉生长的抑制作用均大于A-1、A-2或Q-281菌株单独对产毒黄曲霉生长的抑制作用。其中，实施例3制备的复合菌剂对产毒黄曲霉生长的抑制作用最好，抑制率达到了73％。
利用上述检测方法检测实施例10-24制备的复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制作用，检测结果分别如表5、6、7、8和9所示。
通过实施例1-3与实施例10-24检测结果的对比，可知仅利用A-1、A-2和Q-281菌株制备的复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制作用最好。另外，通过实施例1-3与实施例10-15检测结果的对比，可知仅利用A-1、A-2和Q-281菌株制备的复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制作用，优于同等浓度下，在三种菌株的基础上，再加入F-501菌株或H-1菌株制备的复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制作用。
检测试验二
本试验模拟产毒黄曲霉感染农作物，检测复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制作用。其中，采用的复合菌剂为实施例3制备的复合菌剂，选择的农作物为新鲜玉米。本实施例中所用的新鲜玉米购自广州市天河区小新塘菜市场。
具体操作步骤如下：
(1)称取完整无破损的玉米粒30g于三角瓶中，并于121℃下灭菌30min；
(2)向三角瓶中加入300μL复合菌剂，以及300μL产毒黄曲霉孢子悬液，轻轻摇晃，使复合菌剂和产毒黄曲霉孢子悬液均覆盖到玉米粒上，作为试验组；
另外，向三角瓶中加入300μL无菌水，以及300μL产毒黄曲霉孢子悬液，轻轻摇晃，使无菌水和产毒黄曲霉孢子悬液均覆盖到玉米粒上，作为对照组；
每处理重复2次；
(3)将试验组和对照组均置于28℃且黑暗的条件下培养14天；试验结束后，将玉米粒于121℃灭菌30min。
利用免疫荧光层析法测定上述获得的玉米粒中黄曲霉毒素B1的含量。免疫荧光层析法具体包括以下步骤：
取20g玉米粒粉碎均匀至无明显颗粒，制成粉碎样品；称取1.0g粉碎样品加入到10mL离心管中，继续加入5mL黄曲霉毒素B1提取液(市售)，充分震荡混匀1min，4000r/min离心30s，直至上层液清澈不浑浊；取50μL上清液到1.5mL离心管中，加入950μL黄曲霉毒素B1稀释液(市售)，充分混匀1min，制成样本待测液，待检测。
将黄曲霉毒素B1快速检测卡(市售)和黄曲霉毒素B1荧光液(市售)恢复至室温，并向1.5mL离心管中加入充分摇匀的黄曲霉毒素B1荧光液60μL及样本待测液60μL，将两者充分摇匀，混合5min，制成混合液；取80μL混合液滴入到黄曲霉毒素B1快速检测卡中。10min后，将黄曲霉毒素B1快速检测卡插入荧光免疫层析分析仪中，进行快速检测，10s后荧光免疫层析分析仪显示定量检测结果，并计算实施例3制备的复合菌剂在模拟环境下对产毒黄曲霉的抑制结果，结果如表10所示。
表10实施例3制备的复合菌剂在模拟环境下对产毒黄曲霉的抑制结果
菌株类型 产毒量(ng/g) 抑制产毒率(％)
产毒黄曲霉 4.85 -
产毒黄曲霉+实施例3制备的复合菌剂 1.23 75
由表10可知，本申请实施例3制备的复合菌剂对黄曲霉B1的抑制率达到75％。
根据上述检测结果，说明本申请制备的复合菌剂应用于田间，可对产毒黄曲霉的生长起到较好的抑制作用，同时可有效降低田间黄曲霉B1的含量，从而有效降低田间农作物的致病率，提高田间农作物的产率。
实施例26
根据“检测试验一”的结果，对产毒黄曲霉生长抑制作用最好的复合菌剂中各菌株的孢子悬液(个/ml)为：A-1菌株1×104、A-2菌株1×106、Q-281菌株1×106。本实施例将三种菌株按照上述配方，制成以混合物基质为载体的复合菌制剂。
具体操作步骤如下：
(1)利用实施例1-9所示的方法，分别制备A-1、A-2、Q-281菌株的孢子悬液，并调整各菌株的孢子悬液浓度至1×107个/mL，分别制成各菌株种子液；
(2)按照1：1：3：1：2的重量比例，将玉米粉、花生粉、稻壳、麸皮、尿素混匀，形成混合物基质，放入塑料袋中，并调整混合物基质的水分为60-80％，采用4层纱布密封，于28℃下高压灭菌1h；
(3)取步骤(2)制备的混合物基质3份，按照0.5％的接种量(v/m)，分别将各菌株种子液接种于混合物基质上，并置于28℃的黑暗条件下培养5d，期间进行搅拌；
培养至第2天时，混合物基质表面有大量霉菌生长；
培养至第3天时，搅拌期间能看到明显的孢子飞溅现象；
(4)培养结束后，采用粉碎机对培养后的混合物基质进行粉碎，并采用血球计数板对其孢子进行计数，调节其孢子数，进行配比，将各菌株对应的混合物基质混合，并控制最终获得的混合物基质中A-1、A-2、Q-281菌株的孢子浓度为1×104个/g、1×106个/g及1×106个/g，获得复合菌制剂。
将本实施例制成的复合菌制剂均匀放置于田间，利用每个复合菌制剂所携带的霉菌孢子抑制田间产毒黄曲霉的生长，每个复合菌制剂均能够对田地中特定范围内的产毒黄曲霉的生长进行抑制，从而有效降低了田间农作物因产毒黄曲霉导致的致病率，提高了农作物的状态和产量。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种用于抑制产毒黄曲霉的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂由不产黄曲霉毒素的霉菌组成。
2.根据权利要求1所述的一种用于抑制产毒黄曲霉的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂包括A-1菌株、A-2菌株、F-501菌株、H-1菌株以及Q-281菌种中的至少两种。
3.根据权利要求1所述的一种用于抑制产毒黄曲霉的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂包括A-1菌株、A-2菌株和Q-281菌种中的至少两种。
4.根据权利要求3所述的一种用于抑制产毒黄曲霉的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂中A-1菌株的孢子浓度为1×104 /mL~1×106 /mL。
5.根据权利要求3所述的一种用于抑制产毒黄曲霉的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂中A-2菌株的孢子浓度为1×104 /mL~1×106 /mL。
6.根据权利要求3所述的一种用于抑制产毒黄曲霉的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂中Q-281菌种的孢子浓度为1×104 /mL~1×106 /mL。
7.如权利要求1-6所述的复合菌剂对产毒黄曲霉抑制作用的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：
制备培养基固体平板；
在培养基固体的两侧打孔，两孔径均距离培养基中心20-40mm，一孔注入混合均匀的100-300μL复合菌剂，另一孔注入同体积的产毒黄曲霉孢子悬液，并用同类培养基填充孔径至与平板表面齐平，作为试验组；在另一培养基固体平板正中心打孔，注入同体积产毒黄曲霉孢子悬液，并用同类培养基填充孔径至与平板表面齐平，作为对照组；
待填充孔径的培养基凝固后，将实验组与对照组均置于同等环境条件下培养；
观察产毒黄曲霉与复合菌剂的生长状况，计算复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制率；
复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制率的计算公式如下：
抑制率（%）=（对照组中产毒黄曲霉的生长面积-实验组中产毒黄曲霉的生长面积）/对照组中产毒黄曲霉的生长面积×100%。
8.一种复合菌制剂，其特征在于：所述复合菌制剂包括权利要求1-6任一所述的复合菌剂，以及可用于承载复合菌剂的菌剂载体。
9.根据权利要求8所述的一种复合菌制剂，其特征在于：所述菌剂载体为农作物中的秸秆、谷壳和/或干果的壳类。
10.权利要求8所述的一种复合菌制剂的用途，其特征在于：将所述复合菌制剂直接放置于田间以抑制特定范围内的产毒黄曲霉的生长以及黄曲霉毒素B1的产量。
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