CN104673682A - 黑曲霉及其在黄曲霉毒素生物防控中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黑曲霉及其在黄曲霉毒素生物防控中的应用。该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCC NO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明所筛选到的黑曲霉菌株，在植物多酚的协同作用下，会大大增强其竞争抑制作用。该菌株不仅显著抑制黄曲霉生长和产毒，降解黄曲霉毒素的效率高、特异性强，具有很高的工业应用价值。对于黄曲霉毒素污染的农产品或饲料，通过该菌株发酵可以分解其中的黄曲霉毒素，含毒玉米发酵48小时后其黄曲霉毒素降低80.7％。

Description

黑曲霉及其在黄曲霉毒素生物防控中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种黑曲霉及其在黄曲霉毒素生物防控中的应用。
背景技术
黄曲霉毒素是一类由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)及特曲霉(Aspergillus nomius)等真菌产生的次级代谢产物。研究表明黄曲霉毒素能够引起中毒性肝炎、肝细胞坏死、免疫抑制和肝癌，其中以黄曲霉毒素B1的毒性和致癌性最强，已被国际癌症研究机构定为人类Ⅰ类致癌物。粮食等农作物在种植、收获、贮藏和加工过程中极易受到黄曲霉毒素的污染，因此黄曲霉毒素给人类动物的健康以及经济发展都具有严重的负面影响。
传统的黄曲霉毒素去毒方法主要包括物理脱毒法和化学处理法。但通常都存在一些问题，比如去毒不完全、易降低饲料的营养价值、成本高、应用性差等缺点，而且过度使用化学物质会对人类健康带来副作用，引起环境污染。因此，生物防控黄曲霉毒素污染成为近来研究的热点，近年来已发现许多细菌和真菌都具有抑制产毒霉菌生长、产毒或者降解黄曲霉毒素的作用，如乳酸菌、链霉菌、链球菌、枯草芽孢杆菌、红串红球菌、黑曲霉、非产毒黄曲霉和寄生曲霉、黑根霉、酿酒酵母、青霉菌、绿色木霉等。但是相关的研究大都局限在实验室研究阶段，工业化应用的研究并不多。
黑曲霉可以分泌多种消化酶，因能促进饲料中的养分消化和吸收利用，成为美国FAD批准允许直接添加到饲料中的添加剂之一。目前关于黑曲霉生物防控黄曲霉毒素的报道很少，Dan Xu等发现一种黑曲霉菌能有效地抑制黄曲霉菌的生长与产毒，发酵培养9d后，其抑制率最高可以达到94.5％。同时，该黑曲霉的发酵物还能降解黄曲霉毒素B1，反应5d后，其降解率可以高达85.8％。但是存在的问题是反应时间太长，这对于饲料厂造成的成本太高。至今为止，未见关于黑曲霉和茶叶提取物相互配伍来协同防控黄曲霉毒素的研究。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种黑曲霉。
本发明的再一目的在于提供所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种黑曲霉，该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCC NO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。
所述的黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株具有以下生物学特性：菌落表面平坦，边缘整齐，培养基背面呈乳白色，中间稍有乳黄色，基内菌丝发达。在25℃的察氏平板培养基上培养8d，RAF106菌落直径为51.0±1.53mm，边缘有少量白色绒毛状气生菌丝，菌落表面呈灰褐色，表面有小滴状黑色渗透液(见图1)。
黑曲霉RAF106菌株rDNA-ITS全长碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的黑曲霉RAF106菌株的种子培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。黑曲霉RAF106菌株的种子培养基也可使用市售的马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基。
所述的黑曲霉RAF106菌株的种子培养条件为：茄子瓶静置培养，培养温度28～35℃，培养时间3～5d。
所述的黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取种子培养基表面，得到黑曲霉分生孢子悬浮液。
所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用；
所述的黑曲霉RAF106应用于抑制黄曲霉的生长、抑制黄曲霉毒素的生物合成或降解黄曲霉毒素。该菌株通过竞争性抑制产毒黄曲霉的生长并抑制其毒素的生物合成，并且通过发酵的方式降解饲料或农产品中的黄曲霉毒素。
所述的黑曲霉RAF106与植物多酚应用于抑制黄曲霉的生长和抑制黄曲霉毒素生物合成具有协同增效作用。
所述的植物多酚优选为茶叶提取物、儿茶素单体及其组合物、茶多酚中的至少一种。
所述的茶叶提取物为茶叶通过水或乙醇浸提然后经浓缩、干燥后粉碎制作，或直接购置市售的茶叶提取物。
所述的儿茶素单体及其组合物、茶多酚可直接从市场购得。
所述的黑曲霉RAF106应用于茶叶的发酵生产过程、农产品的贮藏过程、饲料的生产和贮运中。
所述的农产品优选为玉米或花生。
所述的黑曲霉RAF106应用于普洱茶或黑茶生产过程，包括如下步骤：将黑曲霉RAF106菌株孢子采用蒸馏水配制成108CFU/ml的孢子悬浮液，喷洒至茶叶表面并混合均匀，每千克茶叶中的孢子数量为105～109个，然后再按照其发酵工艺进行渥堆发酵。
所述的黑曲霉RAF106应用于农产品的贮藏过程、饲料的生产和贮运中的方法，包括如下步骤：将茶叶提取物溶于蒸馏水制成茶水，然后将黑曲霉RAF106菌株孢子加入茶水中，配制成108CFU/ml的孢子悬浮液，喷洒至农产品表面或与饲料混合均匀，茶叶提取物添加量为0.02～0.5％，每千克农产品或饲料中的孢子数量为105～109个。
所述的黑曲霉RAF106降解黄曲霉毒素的方法：将污染有黄曲霉毒素的农产品或饲料进行高温杀菌，然后将黑曲霉RAF106菌株孢子加入茶水中，配制成108CFU/ml的黑曲霉RAF106菌株孢子悬浮液，喷洒至农产品表面或与饲料混合均匀，加水调节其含水量为30～80％，茶叶提取物添加量为0.05～1％，每千克农产品或饲料中的孢子数量为106～1010个；在25～42℃发酵，每隔12h翻拌一次，48～72h后结束发酵。
所述的黄曲霉素优选为黄曲霉毒素B1。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明所筛选到的黑曲霉菌株，在植物多酚的协同作用下，会大大增强其竞争抑制作用。该菌株不仅显著抑制黄曲霉生长和产毒，还可以通过发酵方式降解饲料中已有的黄曲霉毒素，降解黄曲霉毒素的效率高、特异性强，具有很高的工业应用价值。
(2)本发明的黑曲霉RAF106与茶叶提取物具有明显的互作效应，茶叶提取物可大大提高RAF106菌株的竞争性，抑制黄曲霉生长和产毒的效率高。本发明黑曲霉RAF106生物防控黄曲霉毒素的方法操作简单，对饲料和环境无污染，不破坏饲料的营养物质，黑曲霉生长过程中产生的纤维素酶、果胶酶和淀粉酶等，可以促进农产品中的纤维素和淀粉有限降解，提高其营养价值。
附图说明
图1为黑曲霉RAF106菌株菌落形态图；
图2为黑曲霉RAF106与茶叶提取物协同增效在对峙培养中对黄曲霉生长的抑制效果图，其中：a为不添加茶叶提取物；b为添加茶叶提取物；
图3为茶叶提取物对黄曲霉产孢的影响结果，其中：组间比较，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)；
图4为黑曲霉RAF106对黄曲霉产孢的影响结果，其中：组间比较，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)；
图5为黑曲霉RAF106与茶叶提取物在玉米粉发酵中对黄曲霉产孢的影响，其中：组间比较，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)；
图6为黑曲霉RAF106与茶叶提取物在抑制黄曲霉毒素B1的协同增效作用，其中：组间比较，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)；
图7为黑曲霉RAF106在玉米粉发酵中对黄曲霉毒素B1的降解结果，其中：组间比较，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCC NO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。
黑曲霉RAF106菌株的种子培养基的配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌15min。也可使用市售的马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基。
黑曲霉RAF106菌株的种子培养条件为：茄子瓶静置培养，培养温度28℃，培养时间4d。
在PDA培养基添加0.5％的茶叶提取物按加入培养基，制作PAD平板，在上述培养基平板中央点接RAF106，在相隔2cm的地方点接黄曲霉As3.4408，28℃恒温培养4d，通过菌落直径观察抑菌效果。
结果如图2所示，与对照组相比，黑曲霉RAF106菌落明显增大，而黄曲霉菌落显著变小，可见，黑曲霉抑制黄曲霉的生长与茶叶提取物具有显著的协同增效作用。
实施例2
黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCC NO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。
黑曲霉RAF106菌株种子培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。也可使用市售的马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基。
黑曲霉RAF106菌株种子培养条件为：茄子瓶静置培养，培养温度30℃，培养时间3d。
黑曲霉RAF106菌株种子分生孢子的获取方法为：将长满分生孢子的茄子瓶采用无菌生理盐水冲洗，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得分生孢子悬浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1×108/mL。
称量粉碎的玉米粉样品50g，加入250mL三角瓶中，高压蒸汽灭菌。添加无菌水，使含水量为50％，茶叶提取物的添加量分别定为0％，0.05％，0.2％，0.5％。将黄曲霉孢子以每g玉米粉106个的接种量，接入冷却后的玉米粉中，搅拌均匀。在发酵温度为30℃条件下发酵72h，每隔12h翻拌一次，改善其通气并再次混匀。采用稀释平板法测定黄曲霉孢子数量。
结果如图3和图4所示，对照组中每克样品中黄曲霉的孢子数(lg值)为5.99，茶叶提取物添加量为0.05％和0.2％时，每克玉米粉中的黄曲霉的孢子数(lg值)分别为5.84和5.79，与对照组相比均不显著；茶叶提取物添加量为0.5％时，每克玉米粉中的黄曲霉的孢子数(lg值)5.60，显著低于对照组。结果表明在玉米粉中添加0.5％茶叶提取物，可以显著抑制黄曲霉的生长。
实施例4
黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCC NO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。
黑曲霉RAF106和黄曲霉菌株种子培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。
黑曲霉RAF106和黄曲霉菌株种子培养条件为：茄子瓶静置培养，培养温度30℃，培养时间3d。
黑曲霉RAF106和黄曲霉菌株种子分生孢子的获取方法为：将长满分生孢子的茄子瓶采用无菌生理盐水冲洗，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得分生孢子悬浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1×108/mL。
称量粉碎的玉米粉样品50g，加入250mL三角瓶中，高压蒸汽灭菌。添加无菌水，使含水量为50％，茶叶提取物添加量为0.5％，将黄曲霉和黑曲霉孢子分别以每g玉米粉106个的接种量，接入冷却后的玉米粉中，搅拌均匀。在发酵温度为30℃条件下发酵72h，每隔12h翻拌一次，改善其通气并再次混匀。将发酵后的玉米粉烘干，称取20g样品，以固相萃取法提取其中黄曲霉毒素，利用高效液相色谱法测定黄曲霉毒素含量。采用稀释平板法测定黄曲霉孢子数量。
结果如图5、6所示，对照组中每克样品黄曲霉菌落数(lg值)为6.35，黄曲霉毒素B1含量为22.04μg/g。接种黑曲霉RAF106并且添加茶叶提取物的实验组的每克样品黄曲霉菌落数(lg值)为5.65，显著低于对照组，抑制率为79.38％；黄曲霉毒素B1为0.040μg/g，显著低于对照组，抑制率高达99.82％。表明黑曲霉RAF106在茶叶提取物的协同作用下，显著抑制黄曲霉的生长和产毒。
实施例5
黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCC NO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。
黑曲霉RAF106菌株种子培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。也可使用市售的马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基。
黑曲霉RAF106菌株种子培养条件为：茄子瓶静置培养，培养温度28℃，培养时间4d。
黑曲霉RAF106和黄曲霉菌株种子分生孢子的获取方法为：将长满黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶采用无菌生理盐水冲洗，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得黑曲霉分生孢子悬浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1×108/mL。
将污染有黄曲霉毒素B1的玉米粉样品烘干，称量50g，加入250mL三角瓶中，高压蒸汽灭菌。添加无菌水，使含水量为50％，茶叶提取物添加量为0.5％，将黑曲霉孢子悬浮液以每g玉米粉105个的接种量，接入冷却后的玉米粉中，搅拌均匀。在发酵温度为32℃条件下发酵72h，每隔12h翻拌一次，改善其通气并再次混匀。将发酵后的玉米粉烘干，称取20g样品，以固相萃取法提取其中黄曲霉毒素，利用高效液相色谱法测定黄曲霉毒素含量。
结果如图7所示，对照组(0h)的黄曲霉毒素B1的含量为148.69ng/g。经黑曲霉RAF106发酵，黄曲霉毒素B1的含量逐渐下降。发酵时间至48h后黄曲霉毒素B1的含量为28.69ng/g，显著低于对照组，降解率达到80.7％。发酵至72h后玉米粉中的AFB1含量趋于稳定，72h和96h时黄曲霉毒素B1的含量分为16.13ng/g、15.08ng/g，显著低于对照组，降解率分别为89.2％、89.9％。结果表明黑曲霉RAF106在茶叶提取物的协同作用下，可以有效的降解饲料中的黄曲霉毒素。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种黑曲霉，其特征在于：所述黑曲霉为黑曲霉(Aspergillus niger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCC NO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用。
3.根据权利要求2所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用，其特征在于，所述的黑曲霉RAF106应用于抑制黄曲霉的生长、抑制黄曲霉毒素的生物合成或降解黄曲霉毒素。
4.根据权利要求3所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用，其特征在于，所述的黑曲霉RAF106与植物多酚应用于抑制黄曲霉的生长和抑制黄曲霉毒素生物合成具有协同增效作用。
5.根据权利要求4所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用，其特征在于，所述的植物多酚为茶叶提取物、儿茶素单体及其组合物、茶多酚中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用，其特征在于，所述的黑曲霉RAF106应用于普洱茶或黑茶生产过程、农产品的贮藏过程、饲料的生产和贮运中；所述的农产品为玉米或花生。
7.根据权利要求6所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用，其特征在于，所述的黑曲霉RAF106应用于普洱茶或黑茶生产过程，包括如下步骤：将黑曲霉RAF106菌株孢子采用蒸馏水配制成108CFU/ml的孢子悬浮液，喷洒至茶叶表面并混合均匀，每千克茶叶中的孢子数量为105～109个，然后再按照其发酵工艺进行渥堆发酵。
8.根据权利要求6所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用，其特征在于，所述的黑曲霉RAF106应用于农产品的贮藏过程、饲料的生产和贮运中，包括如下步骤：将茶叶提取物溶于蒸馏水制成茶水，然后将黑曲霉RAF106菌株孢子加入茶水中，配制成108CFU/ml的孢子悬浮液，喷洒至农产品表面或与饲料混合均匀，茶叶提取物添加量为0.02～0.5％，每千克农产品或饲料中的孢子数量为105～109个。
9.根据权利要求4所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用，其特征在于，所述的黑曲霉RAF106降解黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤：将污染有黄曲霉毒素的农产品或饲料进行高温杀菌，然后将黑曲霉RAF106菌株孢子加入茶水中，配制成108CFU/ml的黑曲霉RAF106菌株孢子悬浮液，喷洒至农产品表面或与饲料混合均匀，加水调节其含水量为30～80％，茶叶提取物添加量为0.05～1％，每千克农产品或饲料中的孢子数量为106～1010个；在25～42℃发酵，每隔12h翻拌一次，48～72h后结束发酵。
10.根据权利要求9所述的黑曲霉在黄曲霉毒素生物防控中的应用，其特征在于，所述的黄曲霉素为黄曲霉毒素B1。
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