CN102197842B

CN102197842B - 一种控制苹果展青霉素的方法

Info

Publication number: CN102197842B
Application number: CN 201110166738
Authority: CN
Inventors: 张红印; 赵利娜; 任晓锋; 张晓云; 张海晖; 朱淑云
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Dongtai Haibin Science And Technology Pioneer Park Management Co ltd; Jiangsu Huizhi Intellectual Property Services Co ltd
Priority date: 2011-06-21
Filing date: 2011-06-21
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-06-21
Also published as: CN102197842A

Abstract

本发明公开了一种控制苹果展青霉素的方法，属于植物采后病害得控制方法。按照下述步骤进行：将胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)活化，接种到NYDB培养基中进行培养，离心得到菌体；将菌体用0.2%植酸溶液稀释制备成1×10⁸个/mL的菌悬液；在果实伤口处加入30μl酵母菌悬液，自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封。本发明使用植酸结合胶红酵母控制苹果展青霉素，环保、安全、经济、高效、实用，具有重要的社会价值和经济价值。

Description

一种控制苹果展青霉素的方法

技术领域

本发明涉及利用植酸 (phytic acid)和胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）结合使用控制苹果展青霉素的方法，属于植物采后病害得控制方法。

背景技术

展青霉素又称棒曲霉素，是青霉属、曲霉属、丝衣霉属等霉菌代谢产生的一种有毒的真菌代谢产物, 主要存在于霉烂的水果及制品中, 是影响水果及果汁饮料质量的主要因素之一。展青霉素是一种世界范围内的水果污染物，在多种水果、水果制品和果酒中均有发现，特别是苹果及其加工品，展青霉素的污染相当严重。展青霉素的限量标准在大多数欧美国家为0 – 50 μg/kg；WHO推荐展青霉素在苹果汁中的最高限量标准为50 μg/ kg；我国相应的标准规定，苹果、山楂半成品限量标准为100μg/kg，果汁、果酱、果酒、罐头和果脯的限量标准为50 μg/kg。我国水果及其制品上的展青霉素污染，不仅威胁我国人民的身体健康，而且对我国水果及制品的出口创汇造成影响。

引起苹果采后腐烂的致病菌主要有灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和扩展青霉(Penicillium expansum )。灰葡萄孢不会产生展青霉素，苹果中的展青霉素主要是由扩展青霉产生的。因此要控制苹果上的展青霉素，最主要的是防治苹果污染扩展青霉及其产生展青霉素。

低温贮藏、气调贮藏是抑制水果采后病害的有效方法，但两者都需要相应的设备，在广大的发展中国家，已有的设备往往不能满足大多数水果的需要。另外，有些致病霉菌比较耐低温，在冷藏情况下仍能够在水果上生长，并造成水果腐烂，甚至产生霉菌毒素。有些水果，特别是热带亚热带水果不能在低温下贮藏（低温下贮藏冷害严重），只能在亚低温下贮藏，此时致病霉菌繁殖仍然比较快，水果在贮藏期的腐烂比较严重，产生霉菌毒素，特别是展青霉素的机会就更多。长期以来，控制水果采后病害及霉菌毒素污染的主要措施是使用杀菌剂。杀菌剂的长期和大量使用，严重污染环境，有损于人类健康。美国科学院（National Academy of Scinces）的一份报告显示，在用于处理食品的杀菌剂中，60%有致癌的危险性。目前多种杀菌剂（如Captan、Benomyl等）已被美国环保局明令禁止使用或者在部分水果产品上限制使用。为了保证农产品的卫生和安全，各国科学家都在积极地探索能代替化学杀菌剂的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。当前国际上对用拮抗微生物进行水果采后病害的生物防治的研究已经取得了阶段性的成果，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方法之一。

随着酵母分类、生态、生理、生物化学和分子生物学的研究取得进展，人们对果蔬贮藏中利用酵母的兴趣日益提高。国内外的研究表明，许多酵母菌应用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，这些酵母被称为拮抗酵母。酵母菌遗传稳定，抑菌谱广、效价高，一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，安全性高，且对营养要求低，生长快，并对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，对其它化学和物理处理能够相容。因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，受到国际上的广泛关注。

通过近20年的研究，已经有数十种酵母显示具有拮抗真菌的特性，特别是假丝酵母属（Candida）、隐球酵母属（Cryptococcus）、毕赤酵母属（Pichia）、红酵母属（Rhodotorula）、梅奇氏酵母属（Metschnikowia）、丝孢酵母属（Trichosporon）和（类酵母）短梗霉属（Aureobasidium）等的研究相对较多。毕赤酵母（Pichia guilliermondii）是国际上最早被报道能抑制果实病原真菌的生物防治酵母，而Candida oleophilia isolate I-182已经在1995年作为生物杀菌剂在美国环境保护署（EPA）登记，并已经由美国Ecogen公司商业化。此外，在南非一株采后拮抗酵母白隐球酵母（Cryptococcus albidus）也已经商业化，商品名为Yield Plus。

值得注意的是，一些拮抗酵母不仅能直接抑制病原真菌，而且还能分解真菌毒素。Coelho等（2007）用体外试验（In vitro test）的方法研究拮抗酵母对展青霉素的降解作用，结果表明，将223μg的展青霉素添加到含有25mL酵母培养液的三角瓶中，再在其中接种3×10⁶ cells奥默毕赤酵母（Pichiaohmeri），在25°C培养，经过两天，展青霉素减少83%；经过五天，展青霉素减少99%；再经过十五天的培养，展青霉素的量减少到无法测定的水平。近年来，国外一些学者将拮抗酵母应用于苹果等水果展青霉素的控制上，得到了令人振奋的结果。Castoria等（2005）报道粘红酵母（Rhodotorula glutinis）和罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）在体外培养（In vitro test）情况下能分解展青霉素；将其应用于苹果上，可以显著降低展青霉素在苹果上的积累。Morales等（2008）报道清酒假丝酵母（Candida sake）在冷藏条件下（1℃）既能降低苹果上青霉病的发生率，又能防治展青霉素在苹果的积累。Tolaini等（2010）的研究发现，在实验室及半商业贮藏情况下，香菇（Lentinula edodes）培养液能够增强罗伦隐球酵母（C. laurentii）防治苹果上扩展青霉的生长及展青霉素产生的作用。 Lima等（2011）将罗伦隐球酵母（C. laurentii）与低剂量的杀菌剂boscalid (BOSC), cyprodinil (CYPR) 结合使用，有效地降低了苹果上青霉病的发病率及展青霉素的积累。

目前，生物降解展青霉素以降低水果及其制品中霉菌毒素含量已成为国际学术界研究的热点。但到目前为止，已实际应用于生产的拮抗菌种类不多,只有Biosave和Aspire等少数几种产品上市，而我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于商业生产条件下，目前已报道的拮抗微生物的防治效果往往不如化学杀菌剂的效果，从而达不到保鲜要求。这些因素影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的使用。

胶红酵母是我们课题组从镇江江心洲无公害果园的土壤中筛选分离到的一株拮抗酵母。我们的大量研究表明：胶红酵母对草莓、桃、苹果等水果的采后病害具有显著的抑制作用。然而，我们的试验结果也表明胶红酵母对果实病害的防治效力与化学杀菌剂相比仍有较大的差距。因此进一步提高胶红酵母的拮抗效力，是提高其对水果展青霉素控制水平，并将其应用于水果贮藏保鲜的重要策略之一。

植酸是以玉米、米糠或小麦为原料制备的。作为一种可生物降解的天然物质，植酸不仅资源丰富，而且价格低廉、无毒安全。因其具有众多独特的生物学特性，在食品和水果采后保鲜等领域都有着广泛的研究和应用。在水果采后保鲜领域，植酸被作为理想的水果涂层，用来延缓果实中维生素C的降解，保持果实中的可溶性固形物和含酸量。研究表明植酸对多种病原菌引起的腐烂的抑制效果较弱，因此植酸作为保鲜剂应用时，必须与其它防腐剂配合使用。

近年来，如何将植酸与其它安全的非杀菌剂方法有效整合，以获得对水果采后真菌病害更高水平的控制，已成为国际上非常受关注的一个研究热点。但国内外对植酸与拮抗酵母结合使用控制苹果展青霉素尚无相关报道。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术中的不足，提供了一种增强胶红酵母控制苹果展青霉素的方法。胶红酵母与植酸结合使用制备成菌悬液，将菌悬液应用到水果上，能降解苹果果实伤口处的展青霉素。胶红酵母与植酸结合使用，在体外培养（In vitro）情况下，对扩展青霉在PDA平板上生长有抑制作用；降解展青霉素；抑制扩展青霉在NYDB培养基中生长。本发明具有安全、高效、成本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少水果展青霉素造成的损失。

一种利用提高胶红酵母对苹果展青霉素的控制方法，按照下述步骤进行：将胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)活化，接种到NYDB培养基中进行培养，离心得到菌体；将菌体用植酸溶液稀释制备成1×10⁸个/mL的菌悬液；在果实伤口处加入30 μl酵母菌悬液，自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，恒温恒湿培养箱中培养(25℃，RH 95%)，即可控制苹果展青霉素。。

其中所述的NYDB 培养基中酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，自然pH。

其中所述的菌悬液中植酸的质量浓度为0.1%－0.5%，优选质量浓度为0.2%。

其中所述的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，保藏菌株编号为CGMCC No.3617。

本发明的优点：

（1）本发明使用植酸与胶红酵母结合使用，控制苹果展青霉素，使用方法简单，操作方便，效果好，成本低。

（2）植酸与胶红酵母结合使用，可以代替化学杀菌剂防治苹果展青霉素，避免使用化学杀菌剂对人体的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明：

其中图1为植酸与胶红酵母结合对苹果果实伤口展青霉素的控制；注：CK：对照；0：胶红酵母；0.2：0.2%的植酸溶液处理；0+0.2：0.2%的植酸与胶红酵母结合处理。

图2为不同浓度植酸对扩展青霉菌丝体在PDA平板上的生长情况；注：CK: 对照； 0：NYDB培养的酵母菌悬液； 0.1%-0.5%：含0.1%-0.5%植酸溶液培养的酵母菌悬液。腐烂直径是28℃放置7d后测定的结果。不同字母代表差异显著性（p=0.05）。

具体实施方式

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。

胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)系本实验室筛选分离得到，现保存于位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏菌株编号为CGMCC No.3617，于NYDA（NYDB培养基的基础上添加2%的琼脂）培养基4℃低温保存。培养程序为：（1）固体活化：将胶红酵母接种于 NYDA培养基中，在28℃培养48h；（2）液体培养：在250m1的三角瓶中装入50 ml的NYDB种子培养基，用接种环接入两环活化好的胶红酵母，在200 rpm （转/分钟），28℃条件下培养20h；（3）增强：将上述培养混合物7000×g条件下离心10min，无菌生理盐水洗涤两次，以去除培养介质，并用无菌生理盐水重新悬浮酵母细胞，血球记数板调节细胞浓度为5×10⁸ 个/mL。在250m1的三角瓶中分别装入50ml NYDB培养基，并加入上述浓度的酵母细培养液1ml，然后在200 rpm，28℃条件下培养24h；（4）离心分离再悬浮：上述不同处理酵母培养混合物在7000×g条件下，离心10min，并用无菌生理盐水洗涤2次，以去除培养介质，再用无菌生理盐水及植酸溶液稀释到所需浓度。

其中使用的植酸购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

实施例1：植酸与胶红酵母结合对苹果伤口展青霉素的控制

一、试验方案

果实处理后，用消过毒的打孔器在每个果实表面赤道部位形成统一大小和深度的伤口，每个伤口处等量加入30μl以下处理液：（1）1×10⁸ cells/ml的酵母菌（含0.2 % PA）；（2）1×10⁸cells/ml的酵母菌；（3）PA（0.2 %）；（4）无菌水。处理后果实放在塑料筐内，用保鲜膜密封，25℃贮藏。3h后在每个伤口处加入等量30μl 5 ×10⁴spores/ml的P. expansum孢子悬浮液。自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，恒温恒湿培养箱中培养(25℃，RH 95%)。每处理重复3次，每个重复12个果实。

样品提取和净化：苹果经高速组织捣碎机匀浆后作为试样。称取浓缩试样5g，精确至0.01g，置于50ml烧杯中，用20mL蒸馏水稀释并定量的转移到125mL分液漏斗中，用25mL乙酸乙酯振摇5min，静置3min。待分层后，用刻度吸管移取上层有机相于另一分液漏斗中，再加用25mL乙酸乙酯于水相中，重复上述振摇提取过程两次。弃去水层，合并三次乙酸乙酯提取液于分液漏斗中，加入10mL碳酸钠水溶液，立即振摇，静置分层，此净化操作应在2min内完成。再用10mL乙酸乙酯提取碳酸钠水层一次，弃去碳酸钠水层，合并乙酸乙酯提取液，加入5滴冰乙酸后，全部转移至旋转蒸发器于40℃下蒸发至近干，用1ml乙酸盐缓冲溶液溶解残留物，经0.45μm滤膜滤至样品瓶内，采用高效液相色谱测定展青霉素的含量。

二、试验结果

按照上述步骤试验，植酸与胶红酵母结合对苹果果实伤口展青霉素的控制效果如下：

从图1可以看出，0.2%植酸单独使用，可以控制苹果伤口的展青霉素，胶红酵母单独使用，也能控制苹果果实伤口处的展青霉素，展青霉素含量是对照的23.2%。但将0.2%的植酸与胶红酵母结合使用时，其对苹果伤口处展青霉素的控制效果最好，仅为对照的10.4%。

实施例2：不同浓度的植酸结合胶红酵母对扩展青霉（P. expansum）菌丝体生长的抑制效果

一、试验方案

在装有30mL PDA培养基的9cm的培养皿中打直径为10mm的小孔，取1×10⁸ cells/ml的胶红酵母菌悬液（含0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%植酸）以及无菌水100μl于打好的小孔中，3h后，注入浓度为5×10⁴spores/ml扩展青霉（P. expansum）100 μl。每个处理做三个平板，1h后，用聚乙烯（PE）保鲜膜密封以防止交叉感染，放入28℃的恒温恒湿培养箱（RH 95%）中培养，7d后，用游标卡尺测量各种霉菌病斑的直径大小，试验重复三次，以观察胶红酵母对霉菌生长的影响情况。

二、试验结果

按照上述步骤试验，7d后观察的胶红酵母对霉菌生长的影响如下：

由图2可以看出，胶红酵母单独使用，对扩展青霉在PDA平板上生长有抑制作用。0.2%及0.3%浓度的植酸结合胶红酵母对扩展青霉在PDA平板上生长的抑制效果好于胶红酵母单独使用，其中，0.2%植酸与胶红酵母结合使用抑制效果最为显著。

实施例3：植酸结合胶红酵母对展青霉素的降解作用

一、试验方案

在250ml的三角瓶中装入50ml的NYDB（牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，水1000ml）种子培养基，用接种环接入两环活化好的R.mucilaginosa，在200rpm，28℃条件下培养20h；将上述培养混合物7000×g条件下，离心10min，无菌生理盐水洗涤两次，去除培养介质，并用无菌生理盐水重新悬浮酵母细胞，血球记数板调节细胞浓度为5×10⁸cells/ml，在250ml的三角瓶中装入50mlNYDB培养基中加入上述浓度的酵母细胞培养液1ml（植酸含量分别为0、0.2%），同时加入浓度为1mg的展青霉素标准品，然后在200rpm，28℃ 条件下培养24h；上述不同处理酵母培养混合物在7000×g条件下，离心10-15min，上清液经0.45μm滤膜滤至样品瓶内，采用高效液相色谱测定展青霉素的含量。

二、试验结果

按照上述步骤试验，1d后观察植酸结合胶红酵母对展青霉素的降解作用结果如下：

表1 植酸结合胶红酵母对展青霉素的降解作用

从表1可以看出，在体外试验中，胶红酵母无论是单独使用还是与植酸结合使用，都能降解展青霉素，降解率分别为92.1%、92.2%。

Claims

1.一种控制苹果展青霉素的方法，其特征在于按照下述步骤进行：将胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)活化，接种到NYDB培养基中进行培养，离心得到菌体；将菌体用植酸溶液稀释制备成1×10⁸个/mL的菌悬液；在果实伤口处加入酵母菌悬液，自然晾干后，将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，恒温恒湿培养箱中培养，即可控制苹果展青霉素；其中所述的菌悬液中植酸的质量浓度为0.1%－0.5%；

2.根据权利要求1所述的一种控制苹果展青霉素的方法，其特征在于其中所述的胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，保藏菌株编号为CGMCC No.3617。

3.根据权利要求1所述的一种控制苹果展青霉素的方法，其特征在于其中所述的菌悬液中植酸的质量浓度为0.2%。