CN103988896A - 甜菜碱诱导培养卡利比克毕赤酵母对水果采后病害的防治 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甜菜碱诱导培养卡利比克毕赤酵母对水果采后病害的防治，属于水果采后病害生物防治领域。将卡利比克毕赤酵母（Pichiacaribbica）活化,接种到含有甜菜碱的NYDB培养基中培养24h，离心得到菌体，将菌体稀释成1×10⁸cells/mL的菌悬液；将菌悬液均匀喷洒于水果上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。本发明利用甜菜碱(GB)诱导培养卡利比克毕赤酵母后使用，提高其对水果采后病害生物防治的效力，使用简单，操作方便，效果好，成本低。本方法可以替代化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

Description

甜菜碱诱导培养卡利比克毕赤酵母对水果采后病害的防治

技术领域

本发明涉及一种甜菜碱诱导培养卡利比克毕赤酵母（Pichia caribbica）提高其防治水果采后病害效力的方法，属于水果采后病害生物防治领域。

背景技术

水果腐烂是水果生产与贮藏的大敌，据报道, 发达国家由此造成的损失为10 % ~ 25 % , 而在缺乏冷藏设施的发展中国家则高达40 %~ 50 %。导致水果采后损失的因素很多，由于病原菌侵染造成的腐烂是造成水果采后损失的主要原因，其中霉菌是水果采后主要病原菌。引起水果贮藏期间腐烂的霉菌种类很多，但每种水果占优势的致病菌一般有2-3种。病原真菌对采后水果的危害不仅在于其导致水果在数量上的严重损失，而且许多病原真菌能分泌产生许多次生代谢产物（霉菌毒素），从而引起严重的食品安全问题。如曲霉菌（Aspergillus flavus和Aspergillus parasiticus等）产生的黄曲霉毒素、扩展青霉（Penicillium expansum）产生的棒曲霉素（patulin）等。

长期以来, 使用化学杀菌剂控制水果的采后病害一直被认为是最有效的控制方法。然

而, 随着病原菌抗药性的逐渐增加, 以及人们对水果品质要求的不断提高和环保意识的加强, 人们开始注意到化学杀菌剂的潜在危险。而且，大部分的杀菌剂被用在水果和蔬菜上，果农大多在采前和采后都使用化学杀菌剂以防止水果采后病害的发生，因此比起其它的农药来说人类更易直接接触杀菌剂。过去十多年，公众和科学界对于食品和环境中农药(尤其杀菌剂)残毒问题的关注日益增加。美国国家科学院（NAS）的报道（1987）指出，杀菌剂的应用对人类健康造成了危害；全美9种致瘤化合物的销售量中，杀菌剂占90％左右，在用于食物的全部农药中，杀菌剂构成60％的致瘤危险。

随着经济的发展和人们生活水平的不断提高，对食品安全的呼声日益强烈，生物防治作为一种新型水果采后防腐药剂已经在商品化生产中得到应用，研究并开发替代化学杀菌剂的安全、无毒、高效的新型水果采后病害防治方法，具有重大的社会意义和广阔的应用前景。当前国际上越来越重视用有益微生物进行水果采后病害生物防治的研究，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方向之一。

自从以色列学者Guter首次报道枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对水果病原菌有拮抗作用以来，利用拮抗菌进行水果采后病害的生物防治目前已取得了突破性的进展，被认为是最有希望替代化学杀菌剂的方法。例如在美国，自1979年美国环境保护署批准使用首个生物防治微生物作为生防菌以来，截止到2004年已有26个微生物（14种细菌和12种真菌）被该机构认可并注册。

随着酵母分类、生态、生理、生物化学和分子生物学的研究取得进展，人们对农产品加工贮藏中利用酵母的兴趣日益提高。国内外的研究表明，许多酵母菌应用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，这些酵母被称为拮抗酵母。酵母菌遗传稳定，抑菌谱广、效价高，一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，安全性高，且对营养要求低，生长快，并对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，对其它化学和物理处理能够相容，因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，受到国际上的广泛关注。毕赤酵母（Pichia guilliermondii）是国际上最早被报道能抑制果实病原真菌的生物防治酵母，而Candida oleophilia isolate I-182已经在1995年作为生物杀菌剂在美国环境保护署（EPA）登记，并已经由美国Ecogen公司商业化生产。此外，在南非一株采后拮抗酵母白隐球酵母（Cryptococcus albidus）也已经商业化生产，商品名为Yield Plus。

从国内外文献中可知，利用拮抗菌替代化学杀菌剂用于水果采后病害的防治已显示出巨大的应用前景，水果采后病害的生物防治已成为一个新的研究热点。但到目前为止，只有Biosave和Aspire等少数几种拮抗菌在实际生产中应用。而我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于商业生产条件下，由于环境条件的不确定性，微生物防治的效果往往不如化学杀菌剂的效果，从而达不到保鲜要求。这些因素影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的使用。

拮抗酵母防治水果采后病害的一个主要特点是利用其能在果实受伤处或表面快速生长，从而与病原菌开展营养和空间上的竞争，以达到抑制病原菌的目的。目前即使是已经商业化生产的Candida oleophila（商品名为ASPIRE）也只有在与低剂量杀菌剂同时使用时才能达到足够有效的防护作用，而且它们一般都不能有效地控制处于潜伏状态的病原菌，即仅具有保护效果而缺乏治疗能力，并且对病原菌拮抗的稳定性和广谱性上与化学杀菌剂相比也还有很大的差距。此外，拮抗酵母需要较高浓度下才能有效作用的特点也将产生很大的经济成本压力。这些因素都对其商业化造成了诸多限制。因此拮抗酵母生物防治的效力必须得到进一步的提高和改进。

甜菜碱（Glycine betaine）是一种生物代谢的次生产物，广泛的存在于动物、植物和微生物体内，是非常重要的 渗透调节 物质，易溶于水。甜菜碱一直被广泛应用于食品、制药、添加剂和化学试剂等领域。甜菜碱可从植物的根茎叶中提取，有丰富的生物学功能，如：可维持细胞渗透压，对酶有保护作用，抗盐的持久性，影响无机离子的分布等。

本发明利用甜菜碱（GB）诱导处理卡利比克毕赤酵母，从而提高其对水果采后病害生物防治的效力，降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。

发明内容         

本发明利用甜菜碱诱导处理卡利比克毕赤酵母，从而提高其对水果采后病害生物防治的效力，卡利比克毕赤酵母经甜菜碱诱导后，可以明显地抑制苹果青霉病，防治其采后腐烂。本发明具有安全，高效，成本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少水果采后病害造成的损失。

       本发明提供了甜菜碱诱导培养卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法，按照下述步骤进行：将卡利比克毕赤酵母活化，用含有甜菜碱的NYDB培养基诱导培养卡利比克毕赤酵母，离心得到菌体，调节菌体得到1×10⁸个/mL菌悬液；将菌悬液均匀喷洒在水果上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。

其中所述的NYDB培养基为：酵母膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，纯化水1000ml，pH自然。

       其中所述的卡利比克毕赤酵母（Pichia caribbica）。

其中所述的甜菜碱使用浓度为0.5 mmol/L- 3 mmol/L。

其中所述的配制经甜菜碱诱导培养后的酵母浓度为1×10⁸cells/mL菌悬液方法，按照下述步骤进行：将诱导培养后的卡利比克毕赤酵母离心，酵母沉淀用无菌水洗涤三次，然后将菌体用无菌水稀释制备成1×10⁸cells/mL菌悬液。

       其中所述的水果为苹果。

       本发明的优点：

(1) 本发明所使用的卡利比克毕赤酵母（Pichia caribbica）为本实验室筛选，其拮抗效力强,对人体安全无害。

       (2) 本发明所使用的甜菜碱来源广泛，价格低廉，无毒无害。

(3) 本发明利用甜菜碱诱导处理卡利比克毕赤酵母，诱导后的卡利比克毕赤酵母与未经诱导的卡利比克毕赤酵母处理相比，可以显著提高卡利比克毕赤酵母的拮抗活性，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。

       (4) 本发明使用甜菜碱诱导处理卡利比克毕赤酵母，可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

附图说明

其中图1为经甜菜碱诱导后的卡利比克毕赤酵母对苹果青霉病的控制效果。注：CK：无菌蒸馏水，即对照组；0：1×10⁸ cells/ml的P. carribbica酵母菌悬液（未经甜菜碱诱导培养的酵母）；0.5：1×10⁸ cells/ml的经0.5 mmol/L甜菜碱诱导培养的P. carribbica酵母菌悬液；1：1×10⁸ cells/ml的经1mmol/L甜菜碱诱导培养的P. carribbica酵母菌悬液；2: 1×10⁸ cells/ml的经2 mmol/L甜菜碱诱导培养的P. carribbica酵母菌悬液；3：1×10⁸ cells/ml经3 mmol/L甜菜碱诱导培养的的P. carribbica酵母菌悬液。发病率是25℃放置15 d后测定的结果。不同字母代表差异显著(P=0.05)。

图2为甜菜碱诱导培养的卡利比克毕赤酵母对苹果自然腐烂的影响。注：CK：无菌蒸馏水，即对照组；GB：1 mmol/L的甜菜碱诱导处理后的卡利比克毕赤酵母菌悬液（1×10⁸ cells/ml）；NGB：1×10⁸ cells/ml的未经甜菜碱诱导处理的P. carribbica酵母菌悬液；不同字母代表差异显著 (P=0.05)。

 

具体实施方式

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的,本发明并不受这些实施实例的限制。

卡利比克毕赤酵母(P. carribbica)系本实验室筛选得到,已经获批中国发明专利，专利号201010198119.6，发明名称：卡利比克毕赤酵母、在水果贮藏保鲜中的应用及使用方法。于NYDA(NYDB培养基的基础上添加2%的琼脂(质量计))培养基4℃低温保存。NYDB培养基中酵母膏5 g，牛肉浸膏8 g，葡萄糖10 g，纯化水l000 ml，自然pH。

培养程序为：(1) 固体活化：将卡利比克毕赤酵母接种于NYDA培养基中,在28℃培养48h；(2) 液体培养：在250 ml的三角瓶中装入50ml的NYDB种子培养基，同时加入不同质量的甜菜碱，使甜菜碱浓度分别为0.5 mmol/L，1 mmol/L,  2 mmol/L, 3 mmol/L, 不诱导培养的酵母NYDB培养基不添加甜菜碱。用接种环接入一环活化好的卡利比克毕赤酵母，在190 rpm，28℃条件下培养20h；(3) 离心分离再悬浮：上述酵母培养混合物在7000 g条件下，离心10一15min，并用无菌蒸馏水洗涤2次，以去除培养介质和甜菜碱，用无菌蒸馏水重新再悬浮，并用血球计数板计数，再用灭过菌的生理盐水调节酵母细胞浓度为1×10⁸ cells/ml。

实施例1：卡利比克毕赤酵母经甜菜碱诱导处理后对苹果青霉病的控制效果

一、试验方案

供试的果实经过精细挑选,尽量选择果实均匀一致,表面无擦伤!机械伤和病虫伤害。将水果用无菌打孔器打孔, 苹果的表面伤口为5mm(直径)×3mm(深)。每个伤口处等量加入30 μL以下处理液：(1) 1×10⁸cells/mL的卡利比克毕赤酵母悬液(不经甜菜碱诱导处理)；（2）1×10⁸cells/mL的经不同浓度甜菜碱诱导培养的卡利比克毕赤酵母悬液（甜菜碱浓度分别为0.5 mmol/L，1 mmol/L,  2 mmol/L, 3 mmol/L）；(3) 无菌水。3h后,再向苹果伤口处分别接种30μL 5×10⁸spores/mL的扩展青霉(P. expanusm)孢子悬浮液。自然晾干后,将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封,恒温培养箱中培养(湿度95%),置于25℃。每处理重复3次,每次重复10个果实。整个试验重复2次。经过若干天的培养，记录果实发病率，以此评价卡利比克毕赤酵母的抑菌效果。

发病率的计算公式如下：

发病率(%)=发病的果实/接种病原菌的果实总数×100%

二、试验结果

按照上述步骤试验,统计水果的腐烂率结果如下:

对苹果青霉病的抑制效果

如图1中所示, 对照组苹果青霉病的发病率为91.66%，未经甜菜碱诱导培养的卡利比克毕赤酵母处理组苹果青霉病的发病率为48.805%，说明卡利比克毕赤酵母在25°C下能够有效控制由扩展青霉造成的苹果的采后病害。与此同时，与未用甜菜碱诱导培养的酵母组相比，甜菜碱诱导培养能显著地提高卡利比克毕赤酵母的生防效果。其中1 mmol/L甜菜碱处理组有最好的效果，其苹果青霉病病害发病率为32.14％，即对苹果青霉病的控制效果最为显著。

 

实施例2：甜菜碱诱导培养卡利比克毕赤酵母对苹果自然腐烂的抑制效果

一、试验方案

将以下处理液均匀喷于苹果表面: (1)1×10⁸cells/mL的经1mmol/L甜菜碱诱导培养的卡利比克毕赤酵母菌悬液；(2)1×10⁸cells/mL的卡利比克毕赤酵母菌悬液（未经甜菜碱诱导培养）；(3)无菌水。将苹果自然晾干，将处理好的果实放入塑料筐用保鲜膜密封。在室温下贮藏3个月。取出水果统计腐烂水果个数,并观察腐烂情况。每处理重复3次,整个实验重复2次。甜菜碱诱导培养的卡利比克毕赤酵母对水果自然腐烂的抑制效果以发病率表示。

发病率的计算

公式如下:

发病率(%)=发病的果实/果实总数×100%

二、试验结果

按照上述步骤试验, 统计的苹果自然腐烂率结果见表2所示。

从图2可以看出,经过甜菜碱诱导处理后的卡利比克毕赤酵母和未经甜菜碱处理的卡利比克毕赤酵母的苹果果实发病率均显著低于对照。经过甜菜碱诱导培养的卡利比克毕赤酵母对苹果自然腐烂的控制效果要显著优于未经甜菜碱诱导处理的卡利比克毕赤酵母。

Claims (4)

1.甜菜碱(GB)诱导培养提高卡利比克毕赤酵母对水果采后病害防治效力的方法，其特征在于按照下述步骤进行：将卡利比克毕赤酵母活化, 用含0.5 mmol/L- 3 mmol/L的甜菜碱的NYDB培养基诱导培养卡利比克毕赤酵母，离心得到菌体，配制酵母浓度为1×10⁸ 个/mL菌悬液; 将菌悬液均匀喷洒在水果上,自然风干; 放在塑料筐中, 用保鲜膜密封后, 放在室温条件下存放。

2.根据权利要求1所述的甜菜碱(GB)诱导培养卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害的方法,其特征在于其中所述的NYDB培养基为:酵母膏5 g,牛肉浸膏8 g,葡萄糖10 g,纯化水l000 ml, pH自然。

3.根据权利要求1所述的甜菜碱(GB)诱导培养提高卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害效力的方法,其特征在于其中所述的卡利比克毕赤酵母（Pichia caribbica），保藏菌株编号为CGMCC No.3616。

4.根据权利要求1所述的甜菜碱(GB)诱导培养提高卡利比克毕赤酵母防治水果采后病害效力的方法, 其特征在于其中所述的水果是苹果。