CN106190875A - 一种高盐耐受环境下的耐盐菌菌株及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高盐耐受环境下的耐盐菌菌株及其筛选方法和应用，其特征在于：名称为W2，分类名称：季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)，保藏编号为：CCTCC M 2016127，保藏日期：2016年3月16日，保藏地址为：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心。本发明的菌株的耐盐性好，为酵母真菌，菌落呈白色，表面较光滑，湿润，有光泽，半球状。菌体较大，呈椭圆形，链状分布，而且有出芽生殖的现象，在超高浓度有机物条件下尤其是高盐浓度环境下生存能力强，生长速度快，通过添加该菌，可有效提高对含盐量高的工业污水中COD的去除率。

Description

一种高盐耐受环境下的耐盐菌菌株及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及一种高盐耐受环境下的耐盐菌及其筛选方法和应用，属于微生物育种及生态领域。
背景技术
目前，有机化工、印染、造纸、石油开采等工业产生大量的废水，这些废水除了含有高浓度的有机物以外，还含有大量的无机盐离子，如Cl-、SO4 2-、Na+等离子，这类废水必须经过处理之后才能排放。目前处理高含盐废水的主要方法有物理法、物理化学法和生物法，可是物理法和物理化学法处理废水的成本较高，而且容易造成二次污染，因此，生物法处理高盐废水成为未来较为理想的的污水处理方法，但是工业废水中的高浓度盐离子对微生物细胞造成脱水和对代谢产生抑制作用，这不仅抑制了微生物的生长，而且降低了常规微生物处理高盐工业废水的效果，因此，亟待筛选出能够耐受高盐工业废水环境的菌株，并将其应用于污水处理。
由于利用微生物处理高盐废水的效果取决于从活性污泥中的微生物对高盐环境的耐受能力，因此，能够筛选出对高盐环境耐受的菌株是关键。本发明就是找出一种能够耐受高盐环境的菌株并且将该菌株应用于污水处理。该菌株能够很快适应污水中的高盐浓度环境，能够耐受高盐环境的同时还能够降解污水中有机和无机污染物，具有显著的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种高盐耐受环境下的耐盐菌及其筛选方法和应用。该耐盐菌是从江西沃邦兴环保科技有限公司污水处理厂中分离得到的，该菌株可以应用于污水处理中。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种能在高盐环境下下的耐盐菌菌株，名称为W2,分类名称为季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年3月16日，保藏号为：CCTCC M 2016127，保藏地址是湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心。
本发明所述的耐盐菌菌株固体培养特征为：
固体培养YPD固体培养基，培养温度为：30±1℃，培养2～3天，菌落直径1-2mm，菌落呈白色，表面较光滑，湿润，有光泽，半球状。
本发明所述的耐盐菌菌株在革兰氏染色后的显微形态特征为：
菌体较大，呈椭圆形，链状分布，而且有出芽生殖的现象。
所述耐盐菌菌株的基因登陆号为：KX447139，ITS序列为：
ACTGGGAATTCTACCTGATTGAGGTCAACTTGTTTGGTTGTTGTAAGGCCGGGCCAACAATACCAGAAATATCCCGCCACACCATTCAACGAGTTGGATAAACCTAATACATTGAGAGGTCGACAGCACTATCTAGTACTACCCATGCCAATACTTTTCAAGCAAACGCCTAGTCCGACTAAGAGTATCACTCAATACCAAACCCGGGGGTTTGAGAGAGAAATGACGCTCAAACAGGCATGCCCTCTGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGAAAATCTGCAATTCATATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAAGATTAATTCAAAATTTGACTAACTGTAAAAATAATTAAATTGTGTTTTGTTAAACCTCTGGCCCAACCTATCTCTAGGCCAAACCAAAGCAAGAGTTCTGTATCAAAAAGACACTGTGTGTAAGGTTTTTCGCCGCGCAGTTAAGCGCTGGCAAAAGAATACTGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGATTTTTAACTTCCCATA。
根据所述耐盐菌菌株的形态特征和生理生化特征及其ITS序列在Genbank中的检索结果，绘制系统进化树，综合鉴定该菌株为季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)。
而且，该菌株使用的培养基配方为：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，葡萄糖0.5％，NaCl 2％，pH 7.0。
而且，该菌株的耐盐能力为NaCl质量浓度为8％。
如上所述的高盐环境下耐盐菌菌株的筛选方法，筛选步骤如下：
(1)取样：选取江西沃邦兴环保科技有限公司污水处理厂污水样品，保存在4℃冰箱中备用。
(2)高耐盐菌菌株驯化：将污水样品按2％接种量接种到上述培养基中，30℃培养2～3天之后再取该菌液按2％的接种量接种到质量浓度为4％的NaCl培养基中，依次类推，直到接种到质量浓度为12％的NaCl的上述培养基中，30℃培养2～3天。
(3)高耐盐菌株菌株筛选：将质量浓度为12％的NaCl的培养基中的菌液用无菌蒸馏水梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取10-4～10-7的稀释菌液100μL分别涂布到含有质量浓度为2％的NaCl的上述培养基中，于30℃培养2～3天，挑取不同菌落形态的菌株到斜面上，于4℃冰箱中保存。
如上所述的高盐耐受环境下的耐盐菌菌株在对污水处理方面的应用。
本发明的优点和积极效果如下：
1.本发明的菌株耐盐性好，是真菌，在显微镜下椭圆形，菌体之间呈链状分布，有出芽生殖的现象，在恶劣条件下尤其是高盐浓度环境下生存能力强，生长速度快。
2.本发明利用NaCl作为梯度逐步驯化出高盐耐受环境下的耐盐菌菌株，该方法操作简便，而且给了耐盐菌对高盐环境的逐渐适应的过程，使得高盐浓度的耐盐菌菌株得以筛选和驯化。
3.本发明的菌株污水污水处理效果好，尤其是COD去除率高，并且能够在高盐浓度下生存，该菌株在最适温度和培养基的条件下，有利于扩大培养，并且可以制成菌剂，投放到污水处理池中进行污水处理。
附图说明
图1为本发明所述菌株的菌落形态；
图2为本发明所述菌株革兰氏染色后再400倍显微镜下观察到的菌体形态；
图3为本发明所述菌株ITS序列的PCR电泳图谱；
图4为本发明所述菌株ITS碱基序列；
图5为本发明所述的菌株依据ITS序列建立的系统进化树；
图6为本发明所述的菌株生长曲线。
图7为本发明所述菌株的污水处理效果。
具体实施方式
下面结合实例，对本发明进一步说明。
实施例1：本发明所述菌株筛选：
步骤一、样品采集：，选取江西沃邦兴环保科技有限公司污水处理厂污水样品，然后用样品取样瓶封装，4℃低温保藏。
步骤二、高耐盐菌菌株驯化：将污水样品按2％接种量接种到上述培养基中，30℃培养2～3天之后再取该菌液按2％的接种量接种到质量浓度为4％的NaCl培养基中，依此类推，直到接种到质量浓度为12％的NaCl的上述培养基中，30℃培养2～3天，其中筛选培养基的基础培养基成分为蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，葡萄糖0.5％，pH 7.0，添加的NaCl质量分数梯度依次为2％、4％、6％、8％。
步骤三、高耐盐菌株菌株筛选：将质量浓度为12％的NaCl的培养基中的菌液用无菌蒸馏水梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取10-4～10-7的稀释菌液100μL分别涂布到质平板上，于30℃培养2～3天，挑取不同菌落形态的菌株到斜面上，于4℃冰箱中保存，其中平板的培养基成分是：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，葡萄糖0.5％，NaCl 2％，pH7.0，琼脂2％。
实施例2：本发明菌株的显微形态和分子生物学鉴定
取所筛选得到的菌株进行显微形态和分子生物学方法鉴定，具体过程如下：
(1)采用固体平板培养法：固体培养YPD培养基，培养温度为：30±1℃，培养2～3天，菌落直径1～2mm，菌落呈白色，表面较光滑，湿润，有光泽，半球状，该菌株的菌落图片见说明书附图1。
本发明所述菌株在革兰氏染色后的显微形态特征为：
革兰氏染色后再在400倍显微镜下观察到的菌体形态：菌体较大，呈椭圆形，链状分布，而且有出芽生殖的现象，该菌株的显微图片见说明书附图2。
(2)分子生物学鉴定
①用接种环从斜面上挑一菌环菌体接种到YPD培养基中，培养温度为30℃，转速150r/min，培养时间12h，取培养的发酵液，离心收集菌体。
②把所得的菌体用试剂盒提取总DNA，按照OMEGA公司的Yeast基因组DNA提取试剂盒说明书提取，具体提取步骤参照试剂盒的说明书。
③将提到的总DNA进行ITS序列PCR扩增，依据ITS序列的通用引物ITS 1和ITS 4，ITS 1引物序列为“CTTGGTCATTTAGACGAAGTAA”，ITS 4引物序列为“GCATATCAATAAGCGGAGGA”。PCR反应体系40μL，该体系见表1，采用TAKARA公司的的EX-taq酶进行PCR扩增。热循环参数95℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环29次，72℃延伸5min，最后16℃1min。反应结束后取5μL PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条件为80V，50mA，30min，PCR扩增结果见说明书附图3，然后再将产物送至上海生工进行测序。
表1 PCR反应体系
组分 体积(μL)
Premix rTaq 20
引物1 2
引物2 2
模板 1
dd H2O 15
④扩增获得的序列经测序，菌株W2的ITS核苷酸序列大小为605bp，见说明书附图4，将序列同GenBank数据库中的几个菌株的16S rDNA核苷酸序列进行比较，采用MEGA 6.06软件对菌株的测序结果进行了系统发育分析，采用Nerghbour-joining方法构建系统发育树，并进行Bootstrap分析，重复次数为1000次。构建的系统发育树见说明书附图4。结果显示菌株W2的ITS核苷酸序列与Pichia guilliermondii(登陆号为DQ657827.1)的ITS核苷酸序列同源性最高，最大相似性(max ident)达到99％。综合W2菌株的形态学特征、生理生化特征及同源性和系统发育分析，将菌株W2鉴定为季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)。本发明所述菌株W2的ITS序列和其他几个相似度较高的同源菌株建立的遗传进化树示意图见说明书附图5。
将分离纯化的菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2016年3月16日，保藏号为：CCTCC M2016127。
实施例3：生长曲线的测定
用接种环将实施例1中所获得的耐12％NaCl的上述菌株接种到YPD培养基中摇床培养12h，培养温度为30℃，摇床转速为170r/min。再将培养的菌液接种到含12％NaCl的上述筛选培养基中培养48h，每隔6h取样，选用600nm波长进行光电比浊测定。具体结果见图5。图5为本发明所述的菌株生长曲线。
由图5可以看出，本发明所述菌株在12％NaCl的上述筛选培养基中生长良好，0～6h为该菌株的适应期，6～30h为该菌株的对数生长期，30～33h为该菌株的稳定期，33以后进入衰亡期。
实施例4：本发明所述的菌株的污水处理效果
(1)取山东普润车间两个不同工段的污水PR03和PR09的水样，这两种水样中的COD值等一些参数见表2。
(2)将PR03和PR09的水样进行3种处理后(具体处理方法见表3)都接入20％所述菌株的菌液，静置，培养温度为30℃，培养时间为48h。
表2 两种水样的参数
表3 两种水样的处理方法
名称 PR03体积(mL) PR09体积(mL) 水(mL)
处理一 0 10 10
处理二 5 5 10
处理三 1 5 14
由说明书图6可知，处理二的COD去除率是最高的，即将PR03和PR09工段的废水稀释一倍接种该菌株能够达到很好的去污效果，其次，该菌株对于高盐环境下的生存能力很强，能够在超高浓度有机物的条件下维持自身的新陈代谢，该菌株适合高浓度工业废水处理。

Claims (6)

1.一种高盐耐受环境下的耐盐菌菌株，其特征在于：名称为季也蒙毕赤酵母W2，分类名称：季也蒙毕赤酵母Pichia guilliermondii，保藏编号为：CCTCC M2016127，保藏日期：2016年3月16日，保藏地址为：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心，本发明所述的耐盐菌菌株固体培养特征为：固体培养YPD固体培养基，培养温度为：30±1℃，培养2～3天，菌落直径1～2mm，菌落呈白色，表面较光滑，湿润，有光泽，半球状，本发明所述的耐盐菌菌株在革兰氏染色后的显微形态特征为：菌体较大，呈椭圆形，链状分布，而且有出芽生殖的现象，所述耐盐菌菌株的基因登陆号为：KX447139，ITS序列为：
ACTGGGAATTCTACCTGATTGAGGTCAACTTGTTTGGTTGTTGTAAGGCCGGGCCAACAATACCAGAAATATCCCGCCACACCATTCAACGAGTTGGATAAACCTAATACATTGAGAGGTCGACAGCACTATCTAGTACTACCCATGCCAATACTTTTCAAGCAAACGCCTAGTCCGACTAAGAGTATCACTCAATACCAAACCCGGGGGTTTGAGAGAGAAATGACGCTCAAACAGGCATGCCCTCTGGAATACCAGAGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGAAAATCTGCAATTCATATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGAAGATTAATTCAAAATTTGACTAACTGTAAAAATAATTAAATTGTGTTTTGTTAAACCTCTGGCCCAACCTATCTCTAGGCCAAACCAAAGCAAGAGTTCTGTATCAAAAAGACACTGTGTGTAAGGTTTTTCGCCGCGCAGTTAAGCGCTGGCAAAAGAATACTGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGATTTTTAACTTCCCATA。
2.根据权利要求1所述的一种高盐耐受环境下的耐盐菌菌株，其特征在于：所述菌株的耐盐性为NaCl质量浓度的12％。
3.根据权利要求1所述的的一种高盐耐受环境下的耐盐菌菌株，其特征在于：所述菌株使用的筛选培养基配方为：蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，葡萄糖0.5％，pH 7.0，添加的NaCl质量分数梯度依次为2％、4％、6％、8％、10％、12％。
4.一种权利要求1所述的一种高盐耐受环境下的耐盐菌菌株筛选方法，其特征在于：筛选步骤如下：
(1)取样：选取江西沃邦兴环保科技有限公司污水处理厂污水样品，保存在4℃冰箱中备用；
(2)高耐盐菌菌株驯化：将质量浓度为12％的NaCl的培养基中的菌液用无菌蒸馏水梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取10-4～10-7的稀释菌液100μL分别涂布到含有质量浓度为2％的NaCl的上述培养基中，于30℃培养2～3天，挑取不同菌落形态的菌株到斜面上，于4℃冰箱中保存；
(3)高耐盐菌株菌株筛选：将质量浓度为12％的NaCl的培养基中的菌液用无菌蒸馏水梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取10-4～10-7的稀释菌液100μL分别涂布到含有质量浓度为2％的NaCl的上述培养基中，于30℃培养2～3天，挑取不同菌落形态的菌株到斜面上，于4℃冰箱中保存。
5.根据权利要求1至4任一项所述的高盐环境下耐盐菌菌株在对污水处理方面的应用。
6.根据权利要求1至4任一项所述的高盐环境下耐盐菌菌株制备得到的菌种发酵剂。
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