CN105543115A - 海洋酵母及其在生物乙醇生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物应用技术领域,本发明公开了一株海洋酵母,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为:CGMCC?No.11364,保藏日期为:2015年9月11日,分类命名为:毕赤酵母(pichia?pastori)JZ09。本发明公开了一株海洋酵母的筛选方法;海洋酵母在生物乙醇生产中的应用以及应用海洋酵母生产生物乙醇的方法。本发明所述海洋酵母能够在巨藻处理液中生长并应用于乙醇生产。其适应海藻中褐藻多酚等物质的抑制作用,并耐受海藻处理液中较高的盐度,而且能够利用海藻中多种碳水化合物作为碳源,达到乙醇的高效产出,对促进海洋藻类生物乙醇生产的产业化发展、以及环境保护、粮食安全保障具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域。更具体地说,本发明涉及一种海洋酵母及其在生物乙醇生产中的应用。
背景技术
能源资源问题深刻影响人类经济社会及我国国家安全和长远发展。全球化石能源将逐渐耗竭。中国化石能源状况则更为严峻。逐步减小我国能源消耗中的化石能源份额,增大可再生生物能源份额,是我国能源可持续发展体系建设的必由之路,各大能源消费国竞先寻求替代石油的新能源。美国和欧洲不约而同地都选择生物燃料乙醇作为主要的替代运输燃料,并制订了雄心勃勃的开发计划。美国计划到2017年燃料乙醇的年使用量达到1325亿升。预计到2020年,所有欧洲汽油的13%都必须来自于可再生原料。欧洲汽油现仅3.5%来自可再生来源生产,预计在今后10年内可再生运输工业将以超过10倍的速度增长。海洋藻类生物质成为我国发展生物能源的首选材料之一。其具有产量高、生长速度快生长不占用淡水和土地资源等突出优势。目前对以海洋藻类产乙醇的研究较少,且大多沿用酿酒酵母等传统乙醇发酵菌种,因为海藻中有大量褐藻多酚等发酵抑制物存在。传统乙醇发酵菌株对海藻水解液适应性较低,所以得到较低的乙醇产率。(NigamPS.,SinghA.,2011.Productionofliquidbiofuelsfromrenewableresources.ProgressinEnergyandCombustionScience.37,52–68.)针对这种现状,我们筛选得到一株海洋酵母并将其应用于生物乙醇生产中。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一株海洋酵母,其能够在巨藻处理液中生长并高效产乙醇;
本发明还有一个目的是提供一株海洋酵母的筛选方法,以提供一种简单有效的方法获得海洋酵母用于高效生产乙醇;
本发明还有一个目的是提供一种应用所述海洋酵母生产生物乙醇的方法,为实际生产乙醇,提供应用该海洋酵母发酵的最适条件和最适培养基,以有效提高乙醇产量。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供了一株海洋酵母,其特征在于,所述海洋酵母在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为:CGMCCNo.11364,保藏日期为:2015年9月11日,分类命名为:巴斯德毕赤酵母(pichiapastori)JZ09。
一株海洋酵母的筛选方法,其特征在于,所述海洋酵母筛选自巨藻自发酵后的发酵液。
优选的是,其中,包括以下步骤:
3.1)初筛:将巨藻自发酵后的发酵液接种固体培养基进行初筛获得初筛菌种,其中,所述固体培养基中的碳源为甘露醇或褐藻酸钠中的一种;以及
3.2)复筛:使用TTC作为显色剂分别对初筛后的菌种进行显色反应,筛选出显红色的阳性菌株为所述海洋酵母。
海洋酵母在生物乙醇生产中的应用。
一种应用所述海洋酵母生产生物乙醇的方法,其特征在于,将所述海洋酵母接种与发酵培养基中进行连续厌氧发酵72-120h,其中,海洋酵母的接种量为占所述培养基体积的6%-12%,发酵温度为25-35℃。
优选的是,其中,向预处理糖化后巨藻水解液中分别溶解入硫酸铵,磷酸二氢钾和七水硫酸镁制备获得发酵培养基,使得其中硫酸铵,磷酸二氢钾和七水硫酸镁的浓度分别为2g-20/L,1-10g/L和0.5-1.5g/L。
本发明至少包括以下有益效果:
本发明所述海洋酵母能够在巨藻处理液中生长并应用于乙醇生产。其适应海藻中褐藻多酚等物质的抑制作用,并耐受海藻处理液中较高的盐度,而且能够利用海藻中多种碳水化合物作为碳源,达到乙醇的高效产出,对促进海洋藻类生物乙醇生产的产业化发展、以及环境保护、粮食安全保障具有重要意义。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一株海洋酵母,其特征在于,所述海洋酵母在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为:CGMCCNo.11364,保藏日期为:2015年9月11日,分类命名为:毕赤酵母(pichiapastori)JZ09。
毕赤酵母(pichiapastori)JZ09的形态特征:单个菌落形态为比较规则的圆形,在YPD培养基中呈乳白色,稍泛微黄,表面光滑圆润。
菌种的基因组学鉴定:
提取酵母的DNA,使用18SrDNA通用上游引物NS2,和下游引物FS1,PCR扩增海洋酵母的18SrDNA序列;
采用20μL反应体系,内含1×PCRbuffer(2.0mMMgCl2),0.2mMdNTP,1UTaqDNA聚合酶,约100ng酵母基因组DNA,上下游引物各0.4mΜ;
PCR扩增条件为:94℃预变性5min,94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环,最后72℃延伸10min,验证后回收并测序。
其中,毕赤酵母(pichiapastori)JZ0918SrDNA的多核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的多核苷酸序列,上游引物NS2的序列为SEQIDNo.2所示的多核苷酸序列,下游引物FS1为SEQIDNo.3所示的多核苷酸序列。
一株海洋酵母的筛选方法,其特征在于,所述海洋酵母筛选自巨藻自发酵后的发酵液。
优选方案是,包括以下步骤:
3.1)初筛:将巨藻自发酵后的发酵液接种固体培养基进行初筛获得初筛菌种,其中,所述固体培养基中的碳源为甘露醇或褐藻酸钠中的一种或两种的组合物;以及
3.2)复筛:使用TTC作为显色剂分别对初筛后的菌种进行显色反应,筛选出显红色的阳性菌株为所述海洋酵母。
海洋酵母在生物乙醇生产中的应用。
一种应用所述海洋酵母生产生物乙醇的方法,其特征在于,将所述海洋酵母接种与发酵培养基中进行连续厌氧发酵72-120h,其中,海洋酵母的接种量为占所述培养基体积的6-12%,发酵温度为25-35℃。
优选方案是,向预处理糖化后巨藻水解液中分别溶解入硫酸铵,磷酸二氢钾和七水硫酸镁制备获得发酵培养基,使得其中硫酸铵,磷酸二氢钾和七水硫酸镁的浓度分别为2g-20/L,1-10g/L和0.5-1.5g/L。
下面结合具体实施例对本发明实施过程作详尽描述:
实施例1:海洋酵母的筛选方法为
初筛:将巨藻自发酵后的发酵液接种固体培养基进行初筛获得初筛菌种,其中,所述固体培养基中的碳源为甘露醇或褐藻酸钠中的一种,具体为:在加入不同水分及通入不同量空气的条件下(如表1所示),使巨藻自发酵,将巨藻自发酵液通过划线培养得到纯化菌株;以及
复筛:使用TTC作为显色剂分别对初筛后的菌种进行显色反应,筛选出显红色的阳性菌株,证明其可能具有利用甘露醇及海藻酸钠产乙醇的能力。
表1巨藻自发酵的条件
实施例2海洋酵母JZ09的生物乙醇生产
将180g/L巨藻预处理糖化后的海藻水解液配以10.8g/L硫酸铵,5.0g/L磷酸二氢钾及1.1g/L七水硫酸镁制成发酵培养基,转入发酵罐中,培养基的装量为发酵罐体积的71.4%;然后接种预先培养好的菌种种子液,接种量为发酵培养基体积的10%,在30℃厌氧发酵72小时,发酵结果为乙醇产量为36.13g/L。
转化率计算:
表2巨藻化学成分
巨藻中可作为发酵底物的碳水化合物总量较高,但其中褐藻胶、及半纤维素水解物通常不能被发酵菌株利用。纤维素、褐藻淀粉水解产物及甘露醇是发酵的主要原料。
转化率计算:
70L发酵罐装液量50L,所用巨藻为18Kg,其中总糖为8.122Kg,乙醇产量为18.07Kg,因此,单位乙醇产量为22.2%。
实施例3海洋酵母JZ09的生物乙醇生产
将100g/L海带预处理糖化后的海藻水解液配以5.4g/L硫酸铵,2.5g/L磷酸二氢钾及1.2g/L七水硫酸镁制成发酵培养基,转入发酵罐中,培养基的装量为发酵罐体积的75%;然后接种预先培养好的菌种种子液,接种量为发酵培养基体积的6%,在35℃厌氧发酵72小时,发酵结果为乙醇产量为15.24g/L,单位乙醇产量为19.3%。
实施例4海洋酵母JZ09的生物乙醇生产
将150g/L泡叶藻预处理糖化后的海藻水解液配以8.1g/L硫酸铵,7.5g/L磷酸二氢钾及1.5g/L七水硫酸镁制成发酵培养基,转入发酵罐中,培养基的装量为发酵罐体积的55%;然后接种预先培养好的菌种种子液,接种量为发酵培养基体积的12%,在28℃厌氧发酵120小时,发酵结果为乙醇产量为14.85g/L,单位乙醇产量为24.5%。
实施例5海洋酵母JZ09的生物乙醇生产
将50g/L昆布预处理糖化后的海藻水解液配以2.7g/L硫酸铵,2.5g/L磷酸二氢钾及0.5g/L七水硫酸镁制成发酵培养基,转入发酵罐中,培养基的装量为发酵罐体积的65%;然后接种预先培养好的菌种种子液,接种量为发酵培养基体积的9%,在32℃厌氧发酵96小时,发酵结果为乙醇产量为9.34g/L,单位乙醇产量为17.6%。
实施例6海洋酵母JZ09的生物乙醇生产
将200g/L裙带菜预处理糖化后的海藻水解液配以10.5g/L硫酸铵,5.0g/L磷酸二氢钾及1.3g/L七水硫酸镁制成发酵培养基,转入发酵罐中,培养基的装量为发酵罐体积的70%;然后接种预先培养好的菌种种子液,接种量为发酵培养基体积的12%,在28℃厌氧发酵84小时,发酵结果为乙醇产量为32.69g/L,单位乙醇产量为20.3%。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (6)
1.一株海洋酵母,其特征在于,所述海洋酵母在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为:CGMCCNo.11364,保藏日期为:2015年9月11日,分类命名为:毕赤酵母(pichiapastori)JZ09。
2.一株如权利要求1所述的海洋酵母的筛选方法,其特征在于,所述海洋酵母筛选自巨藻自发酵后的发酵液。
3.如权利要求2所述的海洋酵母的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
3.1)初筛:将巨藻自发酵后的发酵液接种固体培养基进行初筛获得初筛菌种,其中,所述固体培养基中的碳源为甘露醇或褐藻酸钠中的一种;以及
3.2)复筛:使用TTC作为显色剂分别对初筛后的菌种进行显色反应,筛选出显红色的阳性菌株为所述海洋酵母。
4.如权利要求1所述的海洋酵母在生物乙醇生产中的应用。
5.一种应用如权利要求1所述海洋酵母生产生物乙醇的方法,其特征在于,将所述海洋酵母接种与发酵培养基中进行连续厌氧发酵72-120h,其中,海洋酵母的接种量为占所述培养基体积的6-12%,发酵温度为25-35℃。
6.如权利要求5所述的应用海洋酵母生产生物乙醇的方法,其特征在于,向预处理糖化后的巨藻水解液中分别溶解入硫酸铵,磷酸二氢钾和七水硫酸镁制备获得发酵培养基,使得其中硫酸铵,磷酸二氢钾和七水硫酸镁的浓度分别为2g-20/L,1-10g/L和0.5-1.5g/L。
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