CN108220169A - 一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选及其鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选及其鉴定方法，该菌种定名为：黑曲霉(Aspergillus niger)，已于2017年10月31日提交中国普通微生物保藏中心保存，保藏编号为CGMCC No.14629。该菌种采用黄粉虫为菌株来源体，先对选取的黄粉虫进行喂食聚苯乙烯，然后提取黄粉虫肠道微生物，采用多种培养基富集培养的方式进行菌种的分离筛选，并对筛选出的菌种采用自展法进行检测，采用Neighbor‑Joining法构建邻接树，根据系统发育树中组群关系对菌株进行分类，并结合菌株的形态观察结果确定菌株的分类地位，鉴定结果显示黄粉虫肠道中分离出的KHJ‑1菌株为黑曲霉Aspergillus niger，具有较好的降解聚苯乙烯的作用。

Description

一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选及其鉴定方法
本发明生物材料样品保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏日期为：2017年10月31号，保藏编号为：CGMCC No.14629，分类命名为：黑曲霉Aspergillus niger。
技术领域
本发明属于菌种分离鉴定技术领域，具体涉及一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选及其鉴定方法。
背景技术
石油基塑料的环境污染是世界性难题，据统计，2015年全球消耗塑料年产量3亿吨，其中应用最广的热塑性聚苯乙烯塑料占7.1％。聚苯乙烯塑料相对分子质量较高、耐腐蚀性好、稳定性甚强，普遍认为微生物无法降解。传统处理废旧塑料的焚烧法、掩埋法均不能从根本上解决污染问题，再加工受到加工次数的限制且应用范围较窄，为减缓塑料累积速度而研发的生物可降解塑料，并不能清除已形成的塑料垃圾。通常高聚物的降解如光氧化、臭氧诱发、催化降解及生物降解等，其中生物降解是由生长在聚合物表面或内部的微生物引起，能耗低且不会造成二次污染，因此生物法降解是绿色环保的降解方式。
黄粉虫俗称面包虫，为全变态类昆虫，研究表明黄粉虫幼虫可富集重金属与微量元素于体内，并逐渐适应重金属污染的环境，有科学报道中学生陈重光的科研实践中发现黄粉虫幼虫可消化与吸收塑料；沈叶红等从黄粉虫肠道中分离出8株细菌，并对黄粉虫降解塑料的机理进行了初步探究；杨军等发现以聚苯乙烯泡沫塑料为单一食源喂养黄粉虫幼虫，100只幼虫每天可以吃掉34-39mg的泡沫塑料；陈冠舟等以高通量测序法探究啮食聚苯乙烯泡沫塑料黄粉虫肠道菌群结构，揭示了肠道细菌具多样性，并且肠道细菌可能在黄粉虫生物降解塑料的过程中起主导作用。由于昆虫肠道菌可分泌帮助昆虫肠道消化的酶，具有非常丰富的物种多样性及代谢途径多样性，因此从昆虫中分离降解菌是开发高分子材料生物降解的重要途径之一。
发明内容
根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种从昆虫中分离降解聚苯乙烯菌种，并对菌种进行鉴定。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选，具体包括如下步骤：
1)选取体态均匀的黄粉幼虫，进行60天的聚苯乙烯白色泡沫塑料喂养，收集黄粉幼虫；
2)黄粉虫肠道微生物的分离纯化：将上述收集的黄粉幼虫依次经酒精消毒、SAB缓冲液漂洗及无菌水清洗后，解剖取出肠道，加入无菌氯化钠溶液，无菌研磨至无可见颗粒，然后向研磨物中加入无菌氯化钠溶液进行梯度稀释，将稀释液涂布于CA培养基、CYA培养基与MEA培养基，30℃恒温培养，待菌株长出后，挑取菌株边缘菌丝进行培养，反复直至纯化后转接试管中保存。
优选的，所述酒精消毒的酒精浓度为75％，消毒时间为1min。
优选的，所述SAB缓冲液为100ml浓度为1.5％的醋酸溶液和200ml物质量浓度2.72％醋酸钠溶液的混合液，pH为5.6。
优选的，所述CA培养基的pH为7，每升含有NaNO3 3g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖30g，琼脂15g；所述CYA培养基每升含有K2HPO4 1g，查氏浓缩液10mL，酵母提取物5g，蔗糖30g，琼脂15g；所述MEA培养基每升含有生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨1g，氯霉素0.1g，琼脂15g。
优选的，所述步骤(2)中的梯度稀释的稀释浓度为103-105。
优选的，所述振荡培养的转速为150r/min。
一种分离筛选出的菌种的鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)形态观察：接种针挑取菌体制做显微镜观察载片，使用乳酸苯酚溶液染色固定，于普通光学显微镜下观察分生孢子头、顶囊、产孢结构以及分生孢子；
2)分子生物学鉴定：参照真菌提取试剂盒附带提取方法提取DNA，配置好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳测其纯度，扩增产物经检测后，进行测序，观察与拍摄结果；
3)选取代表性菌株序列作进一步的分析，先采用Clustal X 1.8将序列对齐，利用MEGA6.0软件进行系统发育分析，并以自展法进行检测，共循环1000次，Neighbor-Joining法构建邻接树，根据系统发育树中组群关系对菌株进行分类，并结合菌株的形态观察结果确定菌株的分类地位。
优选的，所述PCR仪的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃50s，72℃1min，共32个循环；72℃10min；4℃保存。
优选的，所述肠道真菌菌株ITS rDNA区域扩增采用通用引物ITS1(forward):
5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4(reverse):5'-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3'。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明中采用以黄粉虫虫体为菌种来源材料，具有成本低，原料丰富的优点。
2.本发明通过采用多种培养基富集培养，大幅度提高了菌种分离筛选的成功率，分离筛选出的菌种为聚苯乙烯塑料降解提供良好的理论参考。
附图说明
为了更清楚地说明本发明中具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面描述中的附图是本发明中的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
1.图1是本发明分离出的KHJ-1菌株在不同培养基平板上的生长状况。
2.图2是本发明分离出的KHJ-1菌株的菌丝体及孢子形态图。
3.图3是本发明分离出的KHJ-1菌株生长对聚苯乙烯颗粒重量的影响。
4.图4是本发明分离出的菌株真菌KHJ-1的基于ITS区rDNA序列基因片段序列的系统发育树。
1A、KHJ-1菌株在MEA培养基正面的生长状况，1B、KHJ-1菌株在MEA培养基反面的生长状况，1C、KHJ-1菌株在CYA培养基正面的生长状况,1D、KHJ-1菌株在CYA培养基反面的生长状况，1E、KHJ-1菌株在CA培养基正面的生长状况，1F、KHJ-1菌株在CYA培养基反面的生长状况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选，具体包括如下步骤：
1)选取体态均匀的黄粉幼虫，进行60天的聚苯乙烯白色泡沫塑料喂养，收集黄粉幼虫；
2)黄粉虫肠道微生物的分离纯化：将经过白色聚苯乙烯泡沫塑料60天饲喂处理的黄粉虫幼虫，在超净工作台上先用75％酒精对虫体消毒1min，然后用SAB缓冲液反复漂洗至白色肉体，再用无菌水清洗3次，然后在蜡盘中解剖取出肠道，加入200μL无菌的0.9％NaCl溶液，用灭菌的研磨棒研磨至无可见颗粒，作为肠道微生物培养母液，将研磨物母液中加入无菌的0.9％NaCl溶液进行梯度稀释，取稀释倍数103、104、105的培养液200μL涂布于CA培养基、CYA培养基与MEA培养基，在0.105×106pa，121℃灭菌20min后，在30℃恒温培养，待菌株长出后，挑取菌株边缘菌丝进行培养，反复直至纯化后转接试管中保存；
其中SAB缓冲液为100ml浓度为1.5％的醋酸溶液和200ml物质量浓度2.72％醋酸钠溶液的混合液，pH为5.6；CA培养基的pH为7，每升含有NaNO3 3g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖30g，琼脂15g；CYA培养基每升含有K2HPO4 1g，查氏浓缩液10mL，酵母提取物5g，蔗糖30g，琼脂15g；MEA培养基每升含有生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨1g，氯霉素0.1g，琼脂15g。
对分离筛选出的菌体进行鉴定，具体步骤如下：
1)形态观察：从肠道提取液中分离到一株降解聚苯乙烯性能较好的的真菌，命名为KHJ-1，将KHJ-1菌株点植于MEA培养基，CYA培养基与CA培养基中培养10d，在不同培养基中生长状况描述如表1所示。
2)分子生物学鉴定：肠道真菌菌株基因组DNA为模板进行ITS rDNA的区域扩增，采用通用引物ITS1(forward):5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4(reverse):
5'-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3'进行扩增。PCR反应程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃50s，72℃1min，共32个循环；72℃10min；4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳测其纯度，扩增产物经检测后进行测序，选取代表性菌株序列作进一步的分析，首先采用Clustal X 1.8将序列对齐，利用MEGA6.0软件进行系统发育分析，并以自展法(bootstrap)进行检测，共循环1000次，Neighbor-Joining法构建邻接树。根据系统发育树中组群关系对菌株进行分类，并结合菌株的形态观察结果确定菌株的分类地位。测得KHJ-1菌株ITS序列长度为570bp(GenBank登录号：MF928710)，Blast对比发现KHJ-1的序列Aspergillus nigerATCC 16888(T)(AY373852)序列相似性达100％，序列比对覆盖率达96％，结合形态学特征，菌株KHJ-1鉴定为黑曲霉Aspergillus niger。
对分离的KHJ-1菌株进行聚苯乙烯颗粒的降解性能研究：
将菌种KHJ-1接种若干瓶加有5g质量的聚苯乙烯颗粒的查氏液体培养基中，30℃振荡培养60d，每5d取样一次，洗涤聚苯乙烯颗粒并烘干至恒重，称量后计算颗粒的失重率，空白组与实验组各3个平行如图3，培养过程中菌株生长呈趋势增加，60d干细胞最大值为1.641mg，从5d、10d、15d、20d时聚苯乙烯颗粒失重分别为5.8mg、25.8mg、37.6mg、54mg，20d后将菌种第一次重新转接新鲜培养基，导致25d时PS颗粒重量变化出现了平缓，失重只有57mg，与上次测量相差仅3mg左右，菌株在20d-25d间也表现为生长停滞(图中菱形标注)，导致代谢缓慢；30d时菌株迅速适应新环境，达到了对数生长，PS失重达81.6mg，与上次测量差值高达24.6mg；培养40d后第二次重新转接，降解又出现平缓，45d测量与上次失重相差5.3mg；50d时菌株又重新适应新环境，60d时PS失重高达214.8mg，失重率为4.29％。结论得出菌株在迟滞生长时颗粒失重也较慢，达到对数生长时，PS失重也大幅增加，而空白组中颗粒实验前后几乎无变化，说明聚苯乙烯颗粒的降解是菌株作用的结果而非水解作用。
上面结合具体实施例对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)选取体态均匀的黄粉幼虫，进行60天的聚苯乙烯白色泡沫塑料喂养，收集黄粉幼虫；
2)黄粉虫肠道微生物的分离纯化：将上述收集的黄粉幼虫依次经酒精消毒、SAB缓冲液漂洗及无菌水清洗后，解剖取出肠道，加入无菌氯化钠溶液，无菌研磨至无可见颗粒，然后向研磨物中加入无菌氯化钠溶液进行梯度稀释，将稀释液涂布于CA培养基、CYA培养基与MEA培养基，30℃恒温培养，待菌株长出后，挑取菌株边缘菌丝进行培养，反复直至纯化后转接试管中保存。
2.根据权利要求1所述的降解聚苯乙烯菌种的分离筛选，其特征在于，所述酒精消毒的酒精浓度为75％，消毒时间为1min。
3.根据权利要求1所述的降解聚苯乙烯菌种的分离筛选，其特征在于，所述SAB缓冲液为100ml浓度为1.5％的醋酸溶液和200ml物质量浓度2.72％醋酸钠溶液的混合液，pH为5.6。
4.根据权利要求1所述的降解聚苯乙烯菌种的分离筛选，其特征在于，所述CA培养基的pH为7，每升含有NaNO3 3g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖30g，琼脂15g；所述CYA培养基每升含有K2HPO4 1g，查氏浓缩液10mL，酵母提取物5g，蔗糖30g，琼脂15g；所述MEA培养基每升含有生麦芽20g，蔗糖20g，蛋白胨1g，氯霉素0.1g，琼脂15g。
5.根据权利要求1所述的降解聚苯乙烯菌种的分离筛选，其特征在于，所述步骤(2)中的梯度稀释的稀释浓度为103-105。
6.根据权利要求1所述的降解聚苯乙烯菌种的分离筛选，其特征在于，所述振荡培养的转速为150r/min。
7.一种权利要求1-6任一所述分离筛选出的菌种的鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)形态观察：接种针挑取菌体制做显微镜观察载片，使用乳酸苯酚溶液染色固定，于普通光学显微镜下观察分生孢子头、顶囊、产孢结构以及分生孢子；
2)分子生物学鉴定：参照真菌提取试剂盒附带提取方法提取DNA，配置好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳测其纯度，扩增产物经检测后，进行测序，观察与拍摄结果；
3)选取代表性菌株序列作进一步的分析，先采用Clustal X 1.8将序列对齐，利用MEGA6.0软件进行系统发育分析，并以自展法进行检测，共循环1000次，Neighbor-Joining法构建邻接树，根据系统发育树中组群关系对菌株进行分类，并结合菌株的形态观察结果确定菌株的分类地位。
8.根据权利要求7所述的分离筛选出菌种的鉴定方法，其特征在于，所述PCR仪的反应程序为94℃5min；94℃30s，55℃50s，72℃1min，共32个循环；72℃10min；4℃保存。
9.根据权利要求7所述的分离筛选出菌种的鉴定方法，其特征在于，所述肠道真菌菌株ITS rDNA区域扩增采用通用引物ITS1(forward):5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4(reverse):5'-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3'。
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