WO2020103359A1 - 一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法 - Google Patents

一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法

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WO2020103359A1
WO2020103359A1 PCT/CN2019/078350 CN2019078350W WO2020103359A1 WO 2020103359 A1 WO2020103359 A1 WO 2020103359A1 CN 2019078350 W CN2019078350 W CN 2019078350W WO 2020103359 A1 WO2020103359 A1 WO 2020103359A1
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sequencing
primer
dna
centrifuge
pcr amplification
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辛文斌
孙子奎
丁方美
王�锋
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上海派森诺生物科技股份有限公司
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of high-throughput sequencing, and particularly relates to a method for quickly identifying human fungi based on sanger sequencing.
  • the specimens are inoculated in a specific medium, and the colonies are formed after incubation at room temperature, and the bacteria are judged by the appearance, and the colonies are smeared for microscopic examination.
  • the dideoxy chain termination method (Sanger method) sequencing was invented by Frederick Sanger in 1977. It can be mainly used for DNA sequence analysis.
  • the nucleic acid template is copied or transcribed in the presence of nucleic acid polymerase, primers, and four single deoxy bases. 4 tubes introduce 4 kinds of dideoxy bases with different fluorescence.
  • DNA polymerase can insert 4 kinds of dideoxynucleoside triphosphate raw materials into the DNA chain. Due to the lack of -OH group at the 3 'position of dideoxynucleoside triphosphate, Will not continue to extend, so you can get different lengths of DNA fragments with different fluorescence.
  • the object of the present invention is to provide a method for rapid identification of human fungi based on sanger sequencing.
  • the adopted technical solution is: a method for rapid identification of human fungi based on sanger sequencing, including the following steps:
  • DNA extraction and quality inspection steps use secretion (fungal) DNA extraction kit for DNA extraction; use NanoDrop2000 to detect the sample concentration and purity, when the sample concentration is> 10ng / uL and the purity is between 1.6 and 2.0, it is considered qualified;
  • the main parameters of the design and setting are: the length of the primer is generally 18-24bp; the theoretical annealing temperature Tm value is 55 °C -65 °C; the (G + C) content is 40% -70%; the size of the amplified fragment is ⁇ 800bp. Make a record of the designed primer information, including the primer name, sequence and product size; then perform primer synthesis;
  • PCR amplification step When the quality of the DNA template is confirmed, PCR amplification can be arranged with a reaction system of 25ul; using the genome as a template, New England Biolabs, Ltd Q5 ultra-fidelity DNA polymerase is used for PCR amplification;
  • PCR product purification step use 1.5% agarose gel electrophoresis to purify the unpurified sample after PCR amplification;
  • Sequencing step use ABI's BDT3.1 sequencing kit for pre-sequencing and put it into a sequencer for sequencing;
  • Data processing steps use splicing software DNAStar to splice and then use the blast method to process.
  • the human fungi include any one or more of Candida glabrata, Candida albicans / Candida tropicalis, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, and Aspergillus niger.
  • the primer design includes any one or more primers of Candida glabrata, Candida albicans / Candida tropicalis, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, and Aspergillus niger, as follows:
  • Figure 1 is a schematic diagram of data splicing (1)
  • Figure 2 is a schematic diagram of data stitching (2)
  • Figure 3 is a schematic diagram of data stitching (3)
  • Figure 4 is a schematic diagram of data stitching (4)
  • FIG. 5 is a schematic diagram of blast data processing (1)
  • FIG. 6 is a schematic diagram of blast data processing (2)
  • Figure 8 is a schematic diagram of the comparison results of Candida tropicalis
  • FIG. 10 is a schematic diagram of the comparison results of Aspergillus flavus
  • FIG. 11 is a schematic diagram of the comparison results of Aspergillus fumigatus
  • Figure 12 is a schematic diagram of the comparison results of Aspergillus niger.
  • the DNA recovery solution obtained by centrifugation can be used for subsequent experiments.
  • the extracted fungal DNA should not be placed at room temperature, and should be immediately stored at a temperature below -20 °C for long-term storage.
  • the DNA recovery solution obtained by centrifugation can be used for subsequent experiments.
  • the extracted fungal DNA should not be placed at room temperature, and should be immediately stored at a temperature below -20 °C for long-term storage.
  • NanoDrop2000 to detect the sample concentration and purity.
  • the detection scheme follows the standard operation procedure of NanoDrop2000.
  • the main parameters set are :
  • the length of the primer is generally 18 ⁇ 24bp;
  • the theoretical annealing temperature Tm value is 55 °C ⁇ 65 °C;
  • (G + C) content is 40% ⁇ 70%;
  • the size of the amplified fragment is ⁇ 800bp.
  • PCR amplification can be arranged, and the reaction system is 25ul.
  • Sequencing PCR reaction The selected reagent is ADT's BDT3.1 sequencing kit (BigDyeTerminator v3.1), and the sequencing reaction is carried out according to the BDT3.1 manual. Sequencing PCR reaction cycle program is: pre-denaturation at 95 °C for 2min ⁇ (95 °C 30s, 50 °C 1min, 60 °C 4min) ⁇ 25 ⁇ 4 °C.
  • SeqMan II not only can assemble thousands of sequences into contigs, but also can modify poor quality sequences and remove contaminated data from sequences in the early stage of assembly, as well as improved editing and output functions.
  • the present invention can amplify the gene sequence of a specific species through specific primers, and verify the alignment through sequencing.
  • the correspondence is one-to-one, and the accuracy rate is almost 100%.

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Abstract

一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法，包括DNA提取和质检步骤、引物设计和合成步骤、PCR扩增步骤、PCR产物纯化步骤、PCR产物纯化步骤、测序步骤、数据处理步骤。通过特异的引物把具体的物种的基因序列扩增出来，并通过测序验证比对，一一对应。

Description

一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法 技术领域
本发明属于高通量测序技术领域，具体涉及一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法。
背景技术
现如今常用的几种真菌检测方法有：
1.直接显微镜检测 取分泌物等被检材料涂于载玻片上，在镜下观察菌丝形态结构来判断到底是什么菌。
2.分离培养 标本接种于特定的培养基中，室温培养后菌落成型，通过外观判断是什么菌，同时将菌落涂片镜检。
3.药物敏感试验
由于现在很多菌的菌落形态很相似，易造成混淆，且随着物种的进化，很多菌都具有耐药性，所以常规的方法鉴定出来的菌种不一定正确可靠，具有缺陷。
双脱氧链终止法(Sanger法)测序由Frederick Sanger于1977年发明，主要可用于DNA序列分析，核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在的条件下复制或转录时，分4管引入带不同荧光4种双脱氧碱基，DNA聚合酶可以将4种不同双脱氧核苷三磷酸原料插入DNA链中，由于双脱氧核苷三磷酸的3’位缺少-OH基团，将不会继续延伸，这样可以得到带不同荧光的不同长度DNA片段。
也有人开始将这种方法用于鉴定真菌的种属，而基于此方法的进一步深入研究和发展也变得非常重要。
而Sanger测序的优势在于：
(1)精准：流程细致，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低。
(2)可进行个性化位点检测，可以任意选择单项测序，Sanger测序个性化基因检测有价格优势。由于临床测序特点是：“目标明确、结果精准、通量小”，Sanger测序非常适用于临床。
发明内容
为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种基于sanger测序 快速鉴定人体真菌的方法。
为了实现本发明的目的，所采用的技术方案是：一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法，包括如下步骤：
DNA提取和质检步骤：使用分泌物(真菌)DNA提取试剂盒进行DNA提取；使用NanoDrop2000检测样品浓度和纯度，当样品的浓度>10ng/uL和纯度在1.6～2.0之间，视为合格；
引物设计和合成步骤：根据要扩增的目的基因序列，在在NCBI网站( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)上进行设计，设置的主要参数为：引物长度一般为18～24bp；理论退火温度Tm值55℃～65℃；(G+C)含量40％～70％；扩增片段大小<800bp。将设计出来的引物信息做好记录，包括引物名称，序列以及产物的大小；然后进行引物的合成；
PCR扩增步骤：确认DNA模板质量合格的情况下，可以安排进行PCR扩增，反应体系为25ul；以基因组为模板选用New England Biolabs,Ltd Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增；
PCR产物纯化步骤：使用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增后的未纯化样品进行纯化；
测序步骤：使用ABI公司的BDT3.1测序试剂盒进行测序的前处理后放入测序仪进行测序；
数据处理步骤：使用拼接软件DNAStar进行拼接后使用blast方法进行处理。
在本发明的一个优选实施例中，所述人体真菌包括光滑念珠菌、白色念珠菌/热带念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉中的任意一种或多种。
在本发明的一个优选实施例中，所述引物的设计包括光滑念珠菌、白色念珠菌/热带念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉中的任意一种或多种的引物，具体如下：
Figure PCTCN2019078350-appb-000001
Figure PCTCN2019078350-appb-000002
本发明的有益效果在于：
可以通过特异的引物把具体的物种的基因序列扩增出来，并通过测序验证比对，一一对应，准确率几乎接近百分之百。而且只需要提取一定的菌落提取DNA后保存，避免了在培养过程中产生交叉污染，导致误判。本方法相比其他方法，方便、快捷、准确性高。
附图说明
图1为数据拼接示意图(1)；
图2为数据拼接示意图(2)；
图3为数据拼接示意图(3)；
图4为数据拼接示意图(4)；
图5为blast数据处理示意图(1)；
图6为blast数据处理示意图(2)；
图7为白念珠菌的比对结果示意图；
图8为热带念珠菌的比对结果示意图；
图9为光滑念珠菌的比对结果示意图；
图10为黄曲霉的比对结果示意图；
图11为烟曲霉的比对结果示意图；
图12为黑曲霉的比对结果示意图。
具体实施方式
参见图1-6，本发明的具体实施例为：
1、细菌或真菌染色体DNA的提取(张家港蓝苏生物工程有限公司生产)
1.1分泌物(真菌)DNA提取试剂盒
1.11如是在室温或在2-8℃保存的样本可以直接进行下一步骤；在-20℃以下冰箱中保存的样本，先放置在室温环境中使样本完全融化，然后进行下一步骤。
1.12取出全部悬浮液放入1.5ml离心管中，13000r/min离心3分钟，弃上清液。
1.13加入1ml样本清洗液震荡重悬，13000r/min离心3分钟，弃上清液。
1.14加入300μl样本处理液A将沉淀重悬。将重悬标本全部转移到含DNA固形提取物的离心管(使用前预离心令固形物集于管底)中,用强力震荡器高速漩涡震荡10分钟，瞬时离心。加入样本处理液B 200μl，混匀，13000rpm离心10分钟。取上清液(注意:如有分层，不要吸入下层液体)，转移至新的1.5ml离心管中。加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀。
1.15将离心管中全部液体转移不超过600μl至带套管的DNA离心纯化管(以下简称“纯化管”)中，13000rpm离心1分钟，弃掉套管中的离心液；重复此操作至全部液体离心完毕。
1.16纯化管重新置于套管中，加入冲洗液600μl，13000rpm离心1分钟，弃掉套管中的离心液。重复步骤该一次。
1.17纯化管重新置于套管中，13000rpm离心3分钟(此操作是为了除掉乙醇残留)；离心完毕，打开纯化管管盖晾1-2分钟使滤膜完全干燥。
1.18丢弃套管，将纯化管放入新的1.5ml离心管中，在纯化管底部滤膜上方小心滴加70℃预热的DNA洗脱液40μl，静置3分钟。
1.19 13000rpm离心2分钟(如离心需要可剪去离心管管盖，离心后的DNA回收液另取离心管保存)。
1.20离心所得DNA回收液可用于后续实验，所提取的真菌DNA不应在室温放置，应立即放在-20℃以下温度长期保存。
1.2痰液(真菌)DNA提取试剂盒
1.21如是在室温或在2-8℃保存的样本可以直接进行下一步骤；在-20℃以下冰箱中保存的样本，先放置在室温环境中使样本完全融化，然后进行下一步骤。
1.22在5ml离心管中加入2-2.5ml痰液处理液，加入1ml左右痰液，振摇液化15-30分钟(视痰液标本情况而定，可37℃温浴)。
1.23 13000r/min离心3分钟，弃上清液，加入1ml样本清洗液震荡重悬，13000r/min离心3分钟，弃上清液，加入300μl样本处理液A将沉淀重悬。
1.24将重悬标本全部转移到含DNA固形提取物的离心管(使用前预离心令固形物集于管底)中，用强力震荡器高速漩涡震荡10分钟，瞬时离心。
1.25加入样本处理液B 200μl，混匀，13000rpm离心10分钟。
1.26取上清液(注意:如果有分层，不要吸入下层的液体)，转移至新的1.5ml离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀。
1.27将离心管中全部液体转移不超过600μl至带套管的DNA离心纯化管(以下简称“纯化管”)中，13000rpm离心1分钟，弃掉套管中的离心液；重复此操作至全部液体离心完毕。
1.28纯化管重新置于套管中，加入冲洗液600μl，13000rpm离心1分钟，弃掉套管中的离心液。
1.29重复步骤(8)一次。
1.30纯化管重新置于套管中，13000rpm离心3分钟(此操作是为了除掉乙醇残留)；离心完毕，打开纯化管管盖晾1-2分钟使滤膜完全干燥。
1.31丢弃套管，将纯化管放入新的1.5ml离心管中，在纯化管底部滤膜上方小心滴加70℃预热的洗脱液40μl，静置3分钟。
1.32 13000rpm离心2分钟(如离心需要可剪去离心管管盖，离心后的DNA回收液另取离心管保存)。
1.33离心所得DNA回收液可用于后续实验，所提取的真菌DNA不应在室温放置，应立即放在-20℃以下温度长期保存。
2、DNA浓度及纯度检测
使用NanoDrop2000检测样品浓度和纯度，检测方案按NanoDrop2000标准操作流程。
3、引物设计
3.1通过物种的拉丁学名在NCBI上查找相应的基因组序列，数据库中下面大批量该物种序列，然后通过Clustalx分析找到同源保守区域。
3.2根据需要扩增的目的序列，在NCBI网站( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)上进行设计，设置的主要参数为：引物长度一般为18～24bp；理论退火温度Tm值55℃～65℃；(G+C)含量40％～70％；扩增片段大小<800bp。将设计出来的引物信息做好记录，包括引物名称，序列以及产物的大小。
记录参见表1:
表1
Figure PCTCN2019078350-appb-000003
Figure PCTCN2019078350-appb-000004
4、引物合成
由上海派森诺生物科技股份有限公司合成，使用Dr.Oligo 192机器合成，采用是固相亚磷酰胺三酯法。降DNA固定在固相载体上由3’→5’完成DNA链的合成，相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。通过碱性高温处理，将连接在载体上的引物切下来，通用PAGE纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐沉淀，沉淀后的引物用水悬浮，测定OD 260定量。
5、PCR扩增
引物设计合成以后，确认DNA模板质量合格的情况下，可以安排进行PCR扩增，反应体系为25ul。
以基因组为模板选用New England Biolabs,Ltd Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系：
Figure PCTCN2019078350-appb-000005
反应参数参见表2：
表2
Figure PCTCN2019078350-appb-000006
6、纯化
(1)1.5％琼脂糖凝胶电泳：取25uL PCR未纯化样品，加入Loading Buffer,混匀后加至1.5％琼脂糖纯化胶的孔中，于120V电泳约30min结束。
(2)DNA凝胶回收：
电泳结束后，于紫外灯下参照DNA Marker根据片段大小割取相应条带放入2mL离心管中。
向离心管中加入400ul Buffer DE-A，混匀后于75℃水浴加热直至凝胶块完全熔化。
向离心管中加入200ul Buffer DE-B，混合均匀。
将混合液全部转移至吸附柱上静置5min，3600r/min离心1min，弃废液。
将吸附柱置回2mL离心管，加500ul Buffer W1，静置3min后3600r/min离心1min，弃废液。
将吸附柱置回2mL离心管，加700ul Buffer W2，静置3min后3600r/min离心1min，弃废液。重复该步骤一次。
空管离心12000r/min，离心2min，弃废液。
转移吸附柱至新的1.5mL离心管中，空气自然干燥8-10min。
加30ul ddH2O(70℃预热)至吸附柱滤膜中央，静置5min，12000r/min离心1min。丢弃吸附柱。
取2ul回收后的DNA与1ul Loading Buffer混匀后加至1％琼脂糖凝胶电泳5min左右，于紫外灯下观察是否有条带及条带亮度。
判断不合格的样品，调整体系，进行第二次PCR扩增。
7、测序
(1)测序PCR反应。选用的试剂为ABI公司的BDT3.1测序试剂盒(BigDyeTerminator v3.1)，测序反应均按照BDT3.1使用手册进行。测序PCR反应循环程序为：95℃预变性2min→(95℃30s，50℃1min，60℃4min)×25→4℃。
(2)测序PCR产物的纯化。采用BDT3.1使用手册中的乙醇沉淀方法，干燥后4℃避光保存，只要密封严密保存时间可以长达一个月。
(3)要求：①扩增结束后点胶查看，去掉不理想的。②过柱纯化(不低于300uL的Binding)；也可以使用96孔板式柱子纯化。③洗脱后二次点胶查看PCR产物回收情况。④纯度：OD 260/OD 280＝1.6-2.0，用量30ng。
(4)PCR产物测序反应体系参见表3：
表3
Figure PCTCN2019078350-appb-000007
(5)扩增程序：
Figure PCTCN2019078350-appb-000008
(6)纯化：
1)向每孔加入4ulEDTA，45ul 95％乙醇。震荡混匀后离心4500rpm，25min。
2)去上清，在无尘吸水纸上轻微倒扣几下，然后垫无尘吸水纸，将96孔板倒扣快速离心至600rpm，尽可能去除残留的溶液。
3)再向96孔板中加入100ul冰浴后的75％乙醇，轻微震荡混匀后4500rpm，离心5min。
4)去上清，在无尘吸水纸上轻微倒扣几下，然后垫无尘吸水纸，将96孔板倒扣快速离心至600rpm，尽可能去除残留的溶液。
5)放置37℃烘箱，20min后取出。
6)向96孔板中加入10ulFormamide Deionized，震荡1-2min后，快速离心至2000rpm。
7)变性：上PCR仪95℃4min，快速放入冰水中4min。
8)甩干后放入测序仪中，进行测序。
8、数据处理
(1)拼接：
使用拼接软件进行拼接：DNAStar
SeqMan II不仅仅能够将成千上万个序列装配成contigs，而且在前期装配可以修整质量差的序列以及从序列中清除污染数据，还能改善的编辑和输出功能。
去除矛盾碱基和缺口：选中不可信的区域delete。
查看覆盖面和构建结果：
文件保存与序列输出：序列修改后，点击最上面的序列，点击Ctrl A+Ctrl C复制全序列，把序列放置于对应的txt文本中。
(2)blast：
打开NCBI官网，在网站右侧找打BLAST选项并点击进入，在Basic Blast内找到核酸blast并点击进入，在输入查询的对话框中打入目标序列，点击Blast进行比对。
参见图7-12，本发明可以通过特异的引物把具体的物种的基因序列扩增出来，并通过测序验证比对，一一对应，准确率几乎接近百分之百。

Claims (3)

  1. 一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
    DNA提取和质检步骤：使用分泌物(真菌)DNA提取试剂盒进行DNA提取；使用NanoDrop2000检测样品浓度和纯度，当样品的浓度>10ng/uL和纯度在1.6～2.0之间，视为合格；
    引物设计和合成步骤：根据要扩增的目的基因序列，在在NCBI网站( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)上进行设计，设置的主要参数为：引物长度一般为18～24bp；理论退火温度Tm值55℃～65℃；(G+C)含量40％～70％；扩增片段大小<800bp；将设计出来的引物信息做好记录，包括引物名称，序列以及产物的大小；然后进行引物的合成；
    PCR扩增步骤：确认DNA模板质量合格的情况下，可以安排进行PCR扩增，反应体系为25ul；以基因组为模板选用New England Biolabs,Ltd Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增；
    PCR产物纯化步骤：使用1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增后的未纯化样品进行纯化；
    测序步骤：使用ABI公司的BDT3.1测序试剂盒进行测序的前处理后放入测序仪进行测序；
    数据处理步骤：使用拼接软件DNAStar进行拼接后使用blast方法进行处理。
  2. 如权利要求1所述的一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法，其特征在于，所述人体真菌包括光滑念珠菌、白色念珠菌/热带念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉中的任意一种或多种。
  3. 如权利要求1所述的一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法，其特征在于，所述引物的设计包括光滑念珠菌、白色念珠菌/热带念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉中的任意一种或多种的引物，具体如下：
    Figure PCTCN2019078350-appb-100001
PCT/CN2019/078350 2018-11-20 2019-03-15 一种基于sanger测序快速鉴定人体真菌的方法 WO2020103359A1 (zh)

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