CN108795780A - 一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法 - Google Patents

一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，包括黄曲霉孢子悬液的配制、拮抗菌的初筛、拮抗菌的复筛得到拮抗菌；通过形态学特征、生理生化特征、16SrDNA及gyrB基因序列分析对其进行鉴，筛选出一种对黄曲霉菌有明显抑制的菌株B10，经鉴定确认B10菌株为解淀粉芽孢杆菌。为防控黄曲霉毒素B1真菌毒素中毒提供新的方法和理论依据，该发明具有重要的生产实践意义。

Description

一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法
技术领域
本发明菌株筛选鉴定技术领域，具体涉及一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法。
背景技术
黄曲霉属于曲霉属，其污染多种重要的植物及植物产品，对人畜的健康造成了威胁。黄曲霉可以导致人类曲霉病，其危害率仅次于烟曲霉菌。Adekoya等从被霉菌毒素污染的玉米酒中发现黄曲霉发病率最高，为26％。由黄曲霉感染而导致的曲霉病越来越常见，其主要感染患者的肺部、指甲、脊髓等器官，导致神经麻痹。黄曲霉菌产生的次级代谢产物被称为黄曲霉毒素。黄曲霉毒素在人类中显示出急性和慢性毒性。黄曲霉毒素是一组对人类和动物有健康危害的有毒，致突变，致癌和致畸的次级代谢物。黄曲霉毒素AFB1是目前所知天然化合物中毒性最大的，根据其毒性对人类产生的致癌性和威胁，国际癌症研究机构(IARC)将其归类为一类毒素。
常见的物理法和化学法对黄曲霉菌的抑制及其毒素的去除有很大的作用，但是会引发很多问题，比如化学残留问题，这些问题导致越来越受到人们关注。近些年来，生物防治因为其专一性、环境友好、处理条件温和、易于产业化等原因受到越来越多的专家关注。Hua通过试验发现酵母菌可以抑制黄曲霉菌的生长。在喷洒了酵母菌株的植株上接种黄曲霉，能有效抑制黄曲霉在果实上定殖，其孢子数量比对照降低60％-90％不等。郭春兰把玉米圆斑病菌经枯草芽胞杆菌发酵液处理后，发现玉米圆斑病菌孢子萌发率降低，菌丝和孢子产生畸形，不能正常发育。王小兵等从花生植株茎秆中分离出的解淀粉芽抱杆菌对花生青枯病的致病菌有显著的拮抗作用，田间试验表明对花生青枯病的抑制率为62.4％。张盼从纳豆中筛选出一株芽孢杆菌，发现其菌株发酵上清液对黄曲霉毒素的的降解率高达85.73％。其抗菌活性物质粗提物对黄曲霉毒素的降解率达91.4％。宫小明等筛选的枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌可以明显的抑制黄曲霉孢子的萌发，并且也抑制了菌丝的生长，其培养液对黄曲霉毒素的产生分别降低了99.06％和99.30％。
发明内容
本发明的目的是分离鉴定出能够抑制黄曲霉生长及产黄曲霉毒素B1的益生菌株，为防控黄曲霉毒素B1真菌毒素中毒提供新的方法和理论依据，该发明具有重要的生产实践意义。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，包括以下步骤：
(1)黄曲霉孢子悬液的配制
将黄曲霉产毒菌株接种到高盐查氏斜面试管培养基上，于恒温培养基37℃培养72-96h，等待其孢子充分形成，加入4mL灭菌水，将试管内的黄曲霉孢子刮下，倒入装有灭菌水的三角瓶，并放入摇床振荡使孢子分散，将分散的孢子液用纱布过滤，制成黄曲霉孢子悬液，用血球计数板计数，把黄曲霉孢子悬液浓度调至107cfu/mL，黄曲霉孢子悬液做到现配现用；
(2)拮抗菌的初筛
将配好的黄曲霉孢子悬液迅速倒入冷却至45℃左右还未凝固装有的PDA培养基的三角瓶之中，摇匀使黄曲霉孢子悬液与PDA培养基混匀，再迅速将其倒入灭菌的平皿中，待其凝固，用接种环挑取待试菌落在制好的平板上用十字划线法划十字，并做一空白对照组，在恒温培养箱28℃下培养，72h后观察结果，选出具有拮抗作用的初筛的菌株；
(3)拮抗菌的复筛
将初筛的待试菌落在GAM液体培养基增菌24h，将菌液采用离心机离心两遍再用0.22μm无菌滤器滤掉菌体，把无菌上清液装在新的离心管中，用倾注平板法把1mL的无菌上清液迅速倒入未凝固的PDA培养基平板中，混匀，等其凝固用灭菌的2mm打孔器在平板中间打孔，将配好的黄曲霉孢子悬液用移液管向孔内注入25μL，以无菌空白培养基代替上清液做对照于恒温箱28℃培养72h左右，观察结果，选出有明显拮抗效果的菌株；黄曲霉的直径使用游标卡尺十字交叉法测量，抑菌率表示拮抗菌无菌上清液的抗菌效果，每个处理重复3次，取平均值作为测定结果，抑菌率按照以下公式计算：抑菌率％＝100×(对照组直径-试验组直径)/对照组直径；
(4)拮抗菌的鉴定
常规鉴定：接种新鲜的菌株于LB平板上培养24h，观察菌落形态特征，若菌株菌落单一、形态正常，则立即取样进行革兰氏染色，并且于高倍显微镜下观察菌体形态；
生化鉴定：测定芽孢菌中常见的细菌生理生化指标；
分子鉴定：采用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’进行菌株16S rDNA的PCR扩增，由上海生工生物公司合成的引物UP-1S：5’-ATTGGTGACACCGATCAAACA3-’和UP-2SR：5’-TCATACGTATGGATGTTATTC3-’3进行菌株gyrB基因的PCR扩增；PCR反应体系以黄曲霉拮抗菌株基因组DNA作为PCR扩增的模板，终浓度为50μL，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行序列测定，再使用BLAST程序对16S rDNA和gyrB基因序列GenBank数据库中的gyrB基因进行比较，应用DNAstar以及mega7软件进行同源性分析以及发育树的建立。
具体地，上述步骤(1)中，高盐察氏培养基由七水合硫酸镁1g、硝酸钠2g、氯化钾0.5g、磷酸二氢钾1g、硫酸亚铁0.01g、氯化钠60g、蔗糖30g、蒸馏水1000mL制成，121℃灭菌20min。
具体地，上述步骤(2)中，PDA培养基由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL制成，经过121℃灭菌20min。
具体地，上述步骤(4)中，PCR反应体系为Taq PCR Master Mix PCR 25μL，TemPlate DNA 4μL，PrimerF 2μL，PrimerR 2μL，DDH20 17μL。
具体地，上述步骤(4)中，PCR反应的过程是94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环次数为33次，72℃再延伸10min，4℃保存30min。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，可以从多种供试菌株中准确有效的筛选出拮抗黄曲霉菌的菌株，并且能鉴定其种类，为黄曲霉菌的抑制及其毒素的去除提供了新的途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为黄曲霉拮抗菌株的初筛结果。
图2为黄曲霉拮抗菌的复筛结果。
图3为菌株B10的16S rDNA和gyrB基因扩增电泳图。
图4为基于16SrDNA构建的菌株B10系统发育树。
图5为基于gyrB基因序列构建的菌株B10系统发育树。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例
一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，包括以下步骤：
(1)黄曲霉孢子悬液的配制
将黄曲霉产毒菌株接种到高盐查氏斜面试管培养基上，于恒温培养基37℃培养72-96h，等待其孢子充分形成，加入4mL灭菌水，将试管内的黄曲霉孢子刮下，倒入装有灭菌水的三角瓶，并放入摇床振荡使孢子分散，将分散的孢子液用纱布过滤，制成黄曲霉孢子悬液，用血球计数板计数，把黄曲霉孢子悬液浓度调至107cfu/mL，黄曲霉孢子悬液做到现配现用；
(2)拮抗菌的初筛
将配好的黄曲霉孢子悬液迅速倒入冷却至45℃左右还未凝固装有的PDA培养基的三角瓶之中，摇匀使黄曲霉孢子悬液与PDA培养基混匀，再迅速将其倒入灭菌的平皿中，待其凝固，用接种环挑取实验室保存的74种待试菌落在制好的平板上用十字划线法划十字，并做一空白对照组，在恒温培养箱28℃下培养，72h后观察结果，选出5组具有拮抗作用的初筛的菌株，试验结果如附图1所示；
(3)拮抗菌的复筛
将初筛得到的5种待试菌落在GAM液体培养基增菌24h，将菌液采用离心机离心两遍再用0.22μm无菌滤器滤掉菌体，其中离心机的转速设置为12000r/min，离心时间为10min，把无菌上清液装在新的离心管中，用倾注平板法把1mL的无菌上清液迅速倒入未凝固的PDA培养基平板中，混匀，等其凝固用灭菌的2mm打孔器在平板中间打孔，将配好的黄曲霉孢子悬液用移液管向孔内注入25μL，以无菌空白培养基代替上清液做对照于恒温箱28℃培养72h左右，观察结果，选出有明显拮抗效果的菌株；黄曲霉的直径使用游标卡尺十字交叉法测量，抑菌率表示拮抗菌无菌上清液的抗菌效果，每个处理重复3次，取平均值作为测定结果，抑菌率按照以下公式计算：抑菌率％＝100×(对照组直径-试验组直径)/对照组直径；72h后发现一株对黄曲霉有明显拮抗效果的菌株，编号为B10，如附图2所示，拮抗细菌培养上清液对黄曲霉生长抑菌直径为3.152cm，对照组黄曲霉直径5.214cm，根据公式计算抑菌率达到39.54％，因此，可以说明菌株B10能产生具有抑制黄曲霉生长的物质。
(4)拮抗菌的鉴定
常规鉴定：接种新鲜的菌株于LB平板上培养24h，观察菌落形态特征，若菌株菌落单一、形态正常，则立即取样进行革兰氏染色，并且于高倍显微镜下观察菌体形态；
生化鉴定：测定芽孢菌中常见的细菌生理生化指标；
观察其菌落呈白色，稍微隆起，表面粗糙有褶皱菌落，单菌落为圆形，直径3-4mm，革兰氏染色为阳性，两端钝圆，呈杆状，根据表1所示，与《常见细菌鉴定手册》和《伯式细菌鉴定手册》中的芽孢杆菌生化反应特征初步确定其生化特性接近芽孢杆菌属。
表1菌株B10生理生化鉴定结果
注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性
分子鉴定：采用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’进行菌株16S rDNA的PCR扩增，由上海生工生物公司合成的引物UP-1S：5’-ATTGGTGACACCGATCAAACA3-’和UP-2SR：5’-TCATACGTATGGATGTTATTC3-’3进行菌株gyrB基因的PCR扩增；PCR反应体系以黄曲霉拮抗菌株基因组DNA作为PCR扩增的模板，终浓度为50μL，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行序列测定，再使用BLAST程序对16S rDNA和gyrB基因序列GenBank数据库中的gyrB基因进行比较，应用DNAstar以及mega7软件进行同源性分析以及发育树的建立；
以通用引物进行PCR扩增，获得了1条大小为1500bp左右的特异条带，如附图3所示，测序结果表明菌株B10的16SrDNA序列大小为1462bp，通过Blast程序与GenBank核酸序列库中的序列进行比对，根据BLAST的结果做成系统发育树如附图4所示，发现待测菌B10与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain)GD4a的同源性在98.8％。在附图5中发现gyrB基因扩增后的片段大约是1000bp左右，获得的特异片段经纯化和测序后，通过Blast程序与GenBank核酸序列库中的序列进行比对，发现待测菌B10与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens strain)JXO14631.1在同一分支上，同源性在99.8％，结合生理生化、革兰氏染色镜检等鉴定菌株B10为解淀粉芽孢杆菌。
具体地，上述步骤(1)中，高盐察氏培养基由七水合硫酸镁1g、硝酸钠2g、氯化钾0.5g、磷酸二氢钾1g、硫酸亚铁0.01g、氯化钠60g、蔗糖30g、蒸馏水1000mL制成，121℃灭菌20min。
具体地，上述步骤(2)中，PDA培养基由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL制成，经过121℃灭菌20min。
具体地，上述步骤(4)中，PCR反应体系为Taq PCR Master Mix PCR 25μL，Tem P]ate DNA 4μL，PrimerF 2μL，PrimerR 2μL，DDH2O 17μL。
具体地，上述步骤(4)中，PCR反应的过程是94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环次数为33次，72℃再延伸10min，4℃保存30min。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)黄曲霉孢子悬液的配制
将黄曲霉产毒菌株接种到高盐查氏斜面试管培养基上，于恒温培养基37℃培养72-96h，等待其孢子充分形成，加入4mL灭菌水，将试管内的黄曲霉孢子刮下，倒入装有灭菌水的三角瓶，并放入摇床振荡使孢子分散，将分散的孢子液用纱布过滤，制成黄曲霉孢子悬液，用血球计数板计数，把黄曲霉孢子悬液浓度调至107cfu/mL；
(2)拮抗菌的初筛
将配好的黄曲霉孢子悬液迅速倒入冷却至45℃左右还未凝固装有的PDA培养基的三角瓶之中，摇匀使黄曲霉孢子悬液与PDA培养基混匀，再迅速将其倒入灭菌的平皿中，待其凝固，用接种环挑取待试菌落在制好的平板上用十字划线法划十字，并做一空白对照组，在恒温培养箱28℃下培养，72h后观察结果，选出具有拮抗作用的初筛的菌株；
(3)拮抗菌的复筛
将初筛的待试菌落在GAM液体培养基增菌24h，将菌液采用离心机离心两遍再用0.22μm无菌滤器滤掉菌体，把无菌上清液装在新的离心管中，用倾注平板法把1mL的无菌上清液迅速倒入未凝固的PDA培养基平板中，混匀，等其凝固用灭菌的2mm打孔器在平板中间打孔，将配好的黄曲霉孢子悬液用移液管向孔内注入25μL，以无菌空白培养基代替上清液做对照于恒温箱28℃培养72h左右，观察结果，选出有明显拮抗效果的菌株；
(4)拮抗菌的鉴定
常规鉴定：接种新鲜的菌株于LB平板上培养24h，观察菌落形态特征，若菌株菌落单一、形态正常，则立即取样进行革兰氏染色，并且于高倍显微镜下观察菌体形态；
生化鉴定：测定芽孢菌中常见的细菌生理生化指标；
分子鉴定：采用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’进行菌株16S rDNA的PCR扩增，由上海生工生物公司合成的引物UP-1S：5’-ATTGGTGACACCGATCAAACA3-’和UP-2SR：5’-TCATACGTATGGATGTTATTC3-’3进行菌株gyrB基因的PCR扩增；PCR反应体系以黄曲霉拮抗菌株基因组DNA作为PCR扩增的模板，终浓度为50μL，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行序列测定，再使用BLAST程序对16S rDNA和gyrB基因序列GenBank数据库中的gyrB基因进行比较，应用DNAstar以及mega7软件进行同源性分析以及发育树的建立。
2.根据权利要求1所述的一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，上述步骤(1)中，高盐察氏培养基由七水合硫酸镁1g、硝酸钠2g、氯化钾0.5g、磷酸二氢钾1g、硫酸亚铁0.01g、氯化钠60g、蔗糖30g、蒸馏水1000mL制成，121℃灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，上述步骤(2)中，PDA培养基由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL制成，经过121℃灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，上述步骤(4)中，PCR反应体系为Taq PCR Master Mix PCR 25μL，Tem Plate DNA 4μL，PrimerF2μL，PrimerR 2μL，DDH2O 17μL。
5.根据权利要求1所述的一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，上述步骤(4)中，PCR反应的过程是94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环次数为33次，72℃再延伸10min，4℃保存30min。
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