CN105062920B

CN105062920B - 一种多产色链霉菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN105062920B
Application number: CN201510481103.9A
Authority: CN
Inventors: 井涛; 周登博; 王必尊; 何应对; 刘永霞
Original assignee: Haikou Experimental Station of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Haikou Experimental Station of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2015-08-07
Filing date: 2015-08-07
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2035-08-07
Also published as: CN105062920A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种多产色链霉菌菌株及其应用。所述的多产色链霉菌菌株从临高县美台镇的健康土壤样品中分离筛选得到，命名为多产色链霉菌(Streptomyces polychromogene)G59，于2015年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCC NO:M 2015323。该菌株对防治香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病等病原菌均有抑制作用；将所述的多产色链霉菌G59与甲基营养性芽孢杆菌4‑L‑16和枯草芽孢杆菌混合发酵制得的混合菌株发酵液对香蕉枯萎病具有显著的防治效果。

Description

一种多产色链霉菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种多产色链霉菌菌株及其应用。

背景技术

香蕉是世界贸易的大宗水果，在鲜果贸易中排名第一。我国是香蕉生产大国，也是消费大国，消费量在全球排名第一。据农业部南亚办统计数据显示，2013年我国香蕉种植面积39.71万公顷，产量1211.5万吨。香蕉枯萎病最早于1896年在巴拿马发生，1935～1939年在南美洲几个国家大面积爆发，导致90％以上的优质大蜜哈香蕉发病，约有43万hm²遭毁，并通过出口传播到全世界。我国从20世纪70年代开始发现香蕉枯萎病，目前已扩展到我国所有的产蕉区。近年来，我国香蕉产业的科学家不断摸索枯萎病防控的新方法、新思路，研究表明，采用抗病品种、生物菌肥和大量施用有机肥的综合防控技术手段，可以降低枯萎病大田发病率10％-30％。

发明内容

本发明提出一种多产色链霉菌菌株及其应用，对香蕉枯萎病具有拮抗作用，抑菌效果显著。

本发明的第一个方面提供一种多产色链霉菌，命名为多产色链霉菌(Streptomyces polychromogene)G59，于2015年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCC NO：M2015323。

所述多产色链霉菌G59的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的多产色链霉菌G59在制备防治香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病菌制剂中的应用。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方法所述的多产色链霉菌G59在制备抑制香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病菌菌丝生长制剂上的应用。

本发明的地四个方面是提供本发明第一个方法所述的多产色链霉菌G59在制备抑制香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病菌孢子萌发制剂上的应用。

本发明的第五个方面是提供一种用于防控香蕉枯萎病的发酵液，所述的发酵液中含有多产色链霉菌G59。

进一步，所述的发酵液包含以下菌株：多产色链霉菌G59，甲基营养性芽孢杆菌4-L-16和枯草芽孢杆菌。

本发明的第六个方面是提供本发明第三个方面所述的一种用于防控香蕉枯萎病的发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)分别培养多产色链霉菌G59、甲基营养性芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，得到3种种子液；

(2)将上述3种种子液分别接种于发酵培养基中，发酵，即得所述的发酵液。

进一步，所述步骤(1)中，多产色链霉菌G59种子液的制备方法为：先在平板培养基上培养出多产色链霉菌G59菌株，然后将菌株接种于液体培养基中，培养即得多产色链霉菌G59种子液；甲基营养性芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种子液的制备方法为：取上述菌株，分别置于LB液体培养基内培养，分别得到上述两种菌株的种子液；所述平板培养基组成，以重量份数计，包括：可溶性淀粉15-20份、氯化钠0.3-0.5份、硝酸钾1-2份、三水合磷酸氢二钾0.3-0.5份、七水合硫酸镁0.3-0.5份、七水合硫酸亚铁0.01-0.03份、琼脂15-20份、水1000份，调节PH7.2-7.4，平板培养条件为温度28℃条件下培养5天；所述平板培养基去掉琼脂粉即为液体培养基，液体培养基中培养条件为，温度28℃、180rpm震荡培养3-5天；所述LB液体培养基组成，以重量份数计，包括：胰蛋白胨8-10份，酵母粉3-5份，氯化钠8-10份，水1000份，培养条件为，28℃、180rpm震荡培养3天。

进一步，所述步骤(2)中，G59菌株以10％的接种量接种于发酵培养基中，甲基营养性芽孢杆菌4-L-16和枯草芽孢杆菌均采用5％接种量，接种于发酵培养基中；发酵培养基配方，以重量份数计，包括：大豆粉40-50份、玉米粉8-10份、可溶性淀粉8-10份、红糖150-200份、水1000份，发酵条件为温度为28-30℃，通气量为50％，PH7.0-7.2，搅拌速度为150-180rpm，发酵7天。

本发明所述的多产色链霉菌，经多项鉴定，确定为多产色链霉菌(Streptomycespolychromogene)G59，并于2015年5月25日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了菌种保藏，并证明存活，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCC NO：M2015323。

本发明的有益效果：

本发明所述的多产色链霉菌G59，对防治香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病菌均有较好的拮抗作用，对上述9种病原菌的菌丝生长和孢子萌发均有抑制作用。以本发明所述的多产色链霉菌G59与甲基营养性芽孢杆菌4-L-16、以及枯草芽孢杆菌混合发酵制得的发酵液，对香蕉枯萎病具有显著的防控效果，盆栽试验防效为72.2％，大田防效为44.2％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为基于16S rDNA序列构建的菌株G59与相关菌株的系统发育树；

图2为菌株G59孢子及孢子丝形态；

图3为多产色链霉菌G59对香蕉枯萎病4号生理小种的抑菌作用；

图中，a为多产色链霉菌G59；b为香蕉枯萎病4号生理小种；

图4为多产色链霉菌G59对为香蕉枯萎病4号生理小种孢子萌发抑制作用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、菌株的筛选

分别于海南省临高县南宝镇新营农场、临高县美台镇美梅村、临高县南宝镇皇桐村。每个地点分健康和病土(香蕉枯萎病发病区土壤)分别取样。取样方法为每个田块采用五点随机取样混合为一个样品，采集香蕉植株根围土壤10cm～30cm土层。3个取样点，共采集样品6份，从田间采集的新鲜样品放入塑料样品采集袋中，并置于冰盒中，带回实验室置于4℃冰箱中保存备用。

采用梯度稀释法将上述土壤样品制成10^-2～10^-4浓度梯度系列悬浮液，放线菌的分离，采用高氏一号培养基，使用前要加入3％重铬酸钾抑制细菌、真菌的生长；细菌的分离，采用LB培养基和10^-4～10^-6稀释度。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液0.1mL，滴加于培养基平板上，用L型玻棒涂布均匀，稍晾干，培养皿倒置，于25～28℃温箱中培养2～5d，根据平板上长出的菌落的颜色、形态、大小的细菌、和放线菌的单菌落挑出到新的培养基上进行纯化培养、菌株编号、保存并记录不同样品分离到的菌株数目。如表1所示。

表1微生物分离与筛选结果

注：NB为南宝病土，NJ为南宝健康土；MB为美台病土，MJ为美台健康土；HB为皇桐病土，HJ为皇桐健康土。

采用平板对峙培养法，检测上述分离到的各种微生物(细菌、放线菌)菌株(以下称“待测菌株”)对尖孢镰刀菌4号生理小种(以下称“靶标菌株”)的抑菌活性，用直径6mm的打孔器在提前3d活化并培养好靶标菌株菌落边缘切取菌丝块，并转接在另一个PDA平板中央，再将活化后的待测菌株接种在距靶标菌株菌丝块2-3cm处，每平板接种四个待测菌株，以不接任何待测菌株的靶标菌株为对照，每个菌株三次重复。25-28℃恒温培养一段时间后，测量待测菌株与靶标菌株之间的抑菌带宽度(cm)，作为拮抗(抑菌)作用强弱的指标。共得到11株具有拮抗作用放线菌。对上述11株菌株采用平板对峙法进行复筛，结果如表2所示。

表2不同拮抗菌株的抑菌效果比较

注：表中不同的小写字母表示处理间差异显著(p﹤0.05)

由表2可知，G59(分离自美台健康土)抑菌带宽度虽然低于T1-G2-05菌株和A2-G-24菌株，但是在多次的继代培养中发现其稳定性较高，具有稳定的抑菌作用。

二、菌株的鉴定

1.菌株G59的形态特征

采用平皿插片法，将菌株接种于高氏一号固体培养基上，28℃培养14d，取插片用台式扫描电镜进行菌株形态观察，其孢子及孢子丝形态如图2所示。将菌株分别接种于酵母膏麦芽膏琼脂培养基、燕麦片琼脂培养基、无机盐淀粉琼脂培养基、葡萄糖-天冬素琼脂培养基、胨-酵母膏铁琼脂培养基、酪氨酸琼脂培养基、高氏一号培养基等7种培养基中，28℃下培养7-10d，观察菌丝体的颜色及可溶性色素情况。其结果如表3所示。

表3菌株G59的培养特征

2.生理生化鉴定

菌株G59的生理生化特征如表4所示，经盐度和pH检验，表明其不能生长在NaCl含量大于3％的培养基上，pH最适范围为5.0-8.0；能使硝酸盐还原、能产生H₂S、黑色素，牛奶胨化与凝固，但不能使明胶液化，不能水解淀粉，不能产生酪氨酸酶；碳源利用方面见表4，菌株G59可以利用，α-乳糖、纤维二糖、D-果糖半乳糖、D-葡萄糖、木聚糖、蔗糖、可溶性淀粉等大多数碳源，但不能利用鼠李糖、棉籽糖、肌醇、甘露醇；氮源利用方面，菌株G59可以利用甘氨酸、羟基脯氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、组氨酸、丝氨酸作为唯一氮源，不能利用草酸铵、硫酸铵、蛋氨酸、硝酸铵、乙酸铵。

表4菌株G59的部分生理生化特征

“+”：结果为阳性；“－”：结果为阴性。

3.菌株G59分子生物学鉴定

将所获得的G59菌株的16SrDNA序列通过EzTaxon与GenBank上登陆的序列进行基因序列相似性比对，得到20株与菌株G59菌株同源性最高、且已定名的模式菌的序列信息，MEGA5.0软件构建系统发育树如图1所示，G59菌株与Streptomyces polychromogenes NBRC13072T(AB184292)、Streptomyces racemochromogenes NRRL B-5430T(DQ026656)两菌株的同源性最高，分别达到99.931％和99.865％，且均处于同一分支。结合生理生化特征比对，鉴定G59菌株为：多产色链霉菌Streptomyces polychromogene，并于2015年5月25日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了菌种保藏，并证明存活，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCC NO：M 2015323。

三、多产色链霉菌G59抑菌活性检测

多产色链霉菌G59菌株，采用平板对峙培养法，具体操作与菌株筛选操作相同，检测其对9种植物病原菌的抑菌效果。抑菌带宽度如表5和图3所示。

表5多产色链霉菌G59对9种植物病原菌的抑菌效果比较

注：表中不同的小写字母表示处理间差异显著(p﹤0.05)

由表3可以看出，多产色链霉菌G59菌株对9种植物病原菌均有一定的拮抗作用，对香蕉炭疽菌拮抗效果最佳，抑菌带宽度达1.09cm，显著高于其他处理，而对香蕉枯萎病菌(如图3)、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌的抑菌带宽度也分别达到0.80cm、0.83cm、0.93cm和1.01cm。

四、多产色链霉菌G59对病原菌菌丝生长的抑制作用

采用含药介质菌丝生长速率测定法。将多产色链霉菌G59菌株用LB液体培养基(细菌)/大豆粉液体培养基(放线菌)震荡培养2-5天，温度为37℃，转速170rpm，菌悬液经0.22μm的无菌细菌过滤器过滤，获得培养滤液。按体积比1:10与40-50℃的PDA培养基充分混合(边加培养滤液边摇匀，以免培养基凝固)，趁热倒平板，培养基凝固后，在平板中央接上靶标菌株菌丝块(直径6mm)，并以接种大肠杆菌的处理为对照，每处理3个重复，放入25-28℃的恒温培养室中培养。待对照培养皿上的菌落几乎长满整个培养皿时，测量各处理菌落的直径大小(cm)(保留1位小数点)，按照以下公式计算抑菌率。其结果如表6所示。抑制率＝(对照菌落平均直径-处理菌落平均直径)/对照菌落平均直径×100％

表6多产色链霉菌G59培养滤液对菌丝生长的抑制作用

注：表中不同的小写字母表示处理间差异显著(p﹤0.05)

由表4可见多产色链霉菌G59对9种病原菌菌丝生长均有抑制作用。其中，对香蕉枯萎病菌和香蕉炭疽病菌菌丝生长的抑制率分别达86.43％和85.23％，显著高于其他病原菌处理，对粉蕉枯萎病菌的抑菌效果也达80.43％，表现出良好的生防应用潜力。

五、多产色链霉菌G59对病原菌孢子萌发的抑制作用

将上述9种病原菌的分生孢子配成孢子悬浮液，浓度为1×10⁵CFU/mL，将多产色链霉菌G59菌株用LB液体培养基(细菌)/大豆粉液体培养基(放线菌)震荡培养2-5天，温度为37℃，转速170rpm，菌悬液经0.22μm的无菌细菌过滤器过滤，获得培养滤液。将所得的培养滤液分别与病原菌孢子悬浮液等体积混合，以LB液体培养基(细菌)/大豆粉液体培养基(放线菌)与孢子悬浮液的混合液为对照，每处理三次重复，28℃光照培养12h-24h。200倍光学显微镜，每个重复随机三个视野，以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发，孢子萌发率抑制率(％)＝[(对照萌发率－处理萌发率)/对照萌发率]×100％。其结果如表7所示。

表7多产色链霉菌G59培养滤液对孢子萌发的抑制作用

注：表中不同的小写字母表示处理间差异显著(p﹤0.05)

由表5可以看出，多产色链霉菌G59菌株培养滤液对9种植物病原菌的孢子萌发均有一定的抑制作用，对香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌抑制率在70％以上，对香蕉枯萎病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌抑制效果如图4所示，抑制率最高达81％和80％，显著高于对其他病原菌孢子萌发的抑制作用。可见多产色链霉菌G59菌株培养滤液对病原菌孢子萌发具有广谱的抑制作用。

六、混合菌株发酵液的制备方法

将多产色链霉菌G59菌株在接种至平板培养基上，温度28℃条件下培养5天，然后将菌株接种于液体培养基中，温度28℃、180rpm震荡培养3-5天得到多产色链霉菌G59菌株的种子液。所用的平板培养基组成为：可溶性淀粉15-20.0g、氯化钠(NaCl)0.3-0.5g、硝酸钾(KNO₃)1-1.0g、三水合磷酸氢二钾K₂HPO ₄·3H₂O 0.3-0.5g、七水合硫酸镁(MgSO ₄·7H₂O)0.3-0.5g、七水合硫酸亚铁(FeSO ₄·7H₂O)0.01-0.03g、琼脂15-20g、水1000mL，调节PH7.2-7.4。平板培养基去掉琼脂粉即为液体培养基。

分别将甲基营养性芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，在LB液体培养基中培养，培养基配方为：胰蛋白胨8-10g，酵母粉3-5g，氯化钠8-10g，水1000ml，培养条件为28℃、180rpm震荡培养3天，分别得到甲基营养性芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的种子液。

分别将上述得到的三种菌株的种子液接种于发酵培养基中，多产色链霉菌G59菌株以10％的接种量，细菌菌株采用5％接种量，发酵培养基配方为：大豆粉40-50g、玉米粉8-10g、可溶性淀粉8-10g、红糖150-200g、水1000ml。培养条件为，温度为28-30℃，通气量为50％，PH7.0-7.2，搅拌速度为150-180rpm，发酵7天。即可获得混合菌株的发酵液。

七、混合菌株发酵液对香蕉枯萎病的拮抗效果

盆栽试验设置三个处理，一是CK，施用清水；二是混合菌株发酵液处理，三是两种细菌混合发酵处理，施用甲基营养型芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合发酵液处理，施用本发明所述的混合菌株发酵液；每个处理重复30株香蕉苗，移栽1天后，发酵液处理分别施入稀释50倍的菌株发酵液，施用量200mL/钵，CK施入等量清水；每隔7天再重复施入各处理液，共计7次。试验期间，各处理其他管理措施一致。温室的条件控制为温度28℃-30℃，湿度为70％，自然光照。分别调查每个处理的病情指数，计算相对防效。其中甲基营养型芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合发酵处理液的制备方法为将两种细菌的种子液以10％的接种量，接种到上述发酵培养基中，发酵条件保持不变。

大田试验选择同一个枯萎病病区进行，设3个处理：一是CK处理，施用清水；二是混合菌株发酵液处理，施用本发明所述的混合菌株发酵液；三是两种细菌混合发酵处理，施用甲基营养型芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌混合发酵液，每个处理设置3个重复，各重复小区面积为333m²，80株/重复，蕉苗移栽前翻耕试验地。发酵液施用方法，从幼苗期(7-8片叶)起，每隔15d灌根施入稀释50倍的拮抗菌发酵液，每株香蕉1000mL，连续施用10次后，分别调查每个处理的病情指数，计算相对防效。其结果如表8所示。

病情指数＝Σ(病害的级别×该级别的植株数)/供试植株

相对防效＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照的病情指数*100％

病情分级：0级为无症状；1级为整株叶片只有最下部1片叶片发黄轻度萎蔫；2级为1-2片叶片变黄萎蔫；3级为全株1/3-1/2叶片变黄萎蔫；4级为全株1/2-3/4叶片变黄萎蔫；5级为全株3/4以上叶片变黄萎蔫或整株死亡。

表8菌株发酵液对香蕉枯萎病的防治效果

由表7可以看出，将本发明所述的混合菌株发酵液用于枯萎病防控中，盆栽试验中防效可以达到72.2％，大田试验中防效为44.2％，而两种新菌混合发酵处理的组，对香蕉枯萎病的防治效果明显降低。说明本发明所述的混合菌株发酵液对香蕉枯萎病均有较好的防治效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种多产色链霉菌，其特征在于，命名为多产色链霉菌(Streptomycespolychromogene)G59，于2015年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCC NO：M 2015323。

2.如权利要求1所述的一种多产色链霉菌G59在制备防治香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病菌制剂中的应用。

3.如权利要求1所述的一种多产色链霉菌G59在制备抑制香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病菌菌丝生长制剂上的应用。

4.如权利要求1所述的一种多产色链霉菌G59在制备抑制香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病菌孢子萌发制剂上的应用。

5.一种用于防控香蕉枯萎病的菌株发酵液，其特征在于：所述的发酵液中含有多产色链霉菌G59，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015323。

6.如权利要求5所述的一种用于防控香蕉枯萎病的菌株发酵液，其特征在于，所述的发酵液包含以下菌株：多产色链霉菌G59，甲基营养型芽孢杆菌4-L-16和枯草芽孢杆菌。

7.如权利要求5或6所述的一种用于防控香蕉枯萎病的发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别培养多产色链霉菌G59、甲基营养型芽孢杆菌4-L-16和枯草芽孢杆菌，得到3种种子液；

8.如权利要求7所述的一种用于防控香蕉枯萎病的发酵液的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，多产色链霉菌G59种子液的制备方法为：先在平板培养基上培养出多产色链霉菌G59菌株，然后将菌株接种于液体培养基中培养，即得多产色链霉菌G59种子液；甲基营养型芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种子液的制备方法为：取上述菌株，分别置于LB液体培养基内培养，分别得到上述两种菌株的种子液；所述平板培养基组成，以重量份数计，包括：可溶性淀粉15-20份、氯化钠0.3-0.5份、硝酸钾1-2份、三水合磷酸氢二钾0.3-0.5份、七水合硫酸镁0.3-0.5份、七水合硫酸亚铁0.01-0.03份、琼脂15-20份、水1000份，调节PH7.2-7.4，平板培养条件为温度28℃条件下培养5天；所述平板培养基去掉琼脂粉即为液体培养基，液体培养基中培养条件为，温度28℃、180rpm震荡培养3-5天；所述LB液体培养基组成，以重量份数计，包括：胰蛋白胨8-10份，酵母粉3-5份，氯化钠8-10份，水1000份，培养条件为，28℃、180rpm震荡培养3天。

9.如权利要求8所述的一种用于防控香蕉枯萎病的发酵液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，G59菌株以10％的接种量接种于发酵培养基中，甲基营养型芽孢杆菌4-L-16和枯草芽孢杆菌均采用5％接种量，接种于发酵培养基中；发酵培养基配方，以重量份数计，包括：大豆粉40-50份、玉米粉8-10份、可溶性淀粉8-10份、红糖150-200份、水1000份，发酵条件为温度为28-30℃，通气量为50％，PH7.0-7.2，搅拌速度为150-180rpm，发酵7天。