CN107118045A - 一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术 - Google Patents

一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术，所述复合微生物菌剂包括：甲基营养型芽孢杆菌培养物20‑30份、链霉菌培养物20‑30份、灰色链霉菌培养物20‑30份以及大中微量元素组合物10‑40份；所述复合微生物菌剂的生产工艺包括有机物固体培养基的制备、甲基营养型芽孢杆菌培养物的制备、链霉菌培养物的制备、灰色链霉菌培养物的制备、大中微量元素组合物的制备、原料混拌及干燥以及定量包装步骤，生产的菌剂适合苹果种植使用，具有营养元素丰富，植株抗病能力、抗旱能力强等优势。

Description

一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及生物肥料领域，进一步涉及一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术。
背景技术
苹果在我国是一种重要的作物，苹果（学名：Malus pumila）是水果的一种，是蔷薇科苹果亚科苹果属植物，其树为落叶乔木。苹果的果实富含矿物质和维生素，是人们经常食用的水果之一，是时间产量第二的水果，但是苹果施肥技术以及病虫害的防治技术依然有很多难点亟待解决。据不完全调查苹果病害，11种常见果树的虫害41种、病害37种，这些都是北方落叶果树生产上最常见的且对果树和果品威胁最大的病虫害，在病原生物引起的侵染性病害中，包括有真菌、细菌和病毒感染三种。我国主要的苹果病害有：苹果树腐烂病，轮纹病，斑点落叶病，病毒病等，桃小食心虫、苹果小卷叶蛾、苹果黄蚜、瘤蚜、绵蚜、金纹细蛾以及苹果全爪螨、山楂叶螨等。
目前大多采用化学药剂防治苹果病害虽然能起到一定的作用，但是长期大量施用化学药剂容易造成环境污染和苹果的药剂残留，严重影响人体健康。生物防治由于其对环境、生态和人畜的安全性而受到了国内外研究者的广泛关注，其主要是通过施用拮抗菌、有机肥或生物有机肥等措施调节土壤微生态、改善土壤微生物多样性、抑制病原菌的生长或提高植物自身抗性，从而抑制土传病害的发生。
使用微生物防治苹果病害的研究有一定的历史，但其大多数仅限于苹果单一病害防治的研究，如专利申请号200910076240.9一种防治苹果真菌病害并促增产的菌剂及其专用菌株与应用，其使用枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌对苹果轮纹病和白粉病进行拮抗，效果达到80%；专利申请号201510757062.1一种防治苹果树腐烂病的菌株，微生物菌剂及其制备方法，采用球毛壳菌对苹果腐烂病进行防治，存在菌株和效果单一的缺点；专利申请号201610928146.1一种防治苹果树腐烂病的生物杀菌剂及其制备方法，采用了中药成分对腐烂病生物进行杀灭，成本较高；以上专利除将拮抗菌进行发酵后复配来防治单一苹果病害外，并无广谱抗菌菌剂的添加，菌剂功效单一，不能达到长效广谱的抗病效果，且现有技术大多通过液体深层发酵培养拮抗菌株，再通过吸附、喷雾干燥过程实现微生物菌剂的生产，操作复杂，成本较高。本发明则能很好地解决这一问题，本发明利用多种微生物对不同种类病害的防治和拮抗作用达到对苹果病害的防治，利用固体培养代替液体培养，后续操作简单易行，具有无污染、环境友好、成本低廉、效果持久的优点。
发明内容
本发明是为了解决传统复合微生物菌剂功能性单一，抗菌效果单一的缺陷而提出的，且解决现有技术液体发酵菌剂步骤复杂的缺陷而提出的，提出了一种既有广谱抗菌活性又可以补充苹果养分的复合微生物菌剂的工艺技术。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术，所述复合微生物菌剂包括：甲基营养型芽孢杆菌培养物20-30份、链霉菌培养物20-30份、灰色链霉菌培养物20-30份以及大中微量元素组合物10-40份；所述复合微生物菌剂的生产工艺包括以下步骤：
（1）有机物固体培养基的制备：将蘑菇渣、糠醛渣、苜蓿渣、葡萄粕的一种或多种进行混拌，通过添加一定比例的草木灰调节其pH，以符合不同菌种的发酵条件，将混合后的有机物料放入卧式杀菌釜中，115℃湿热杀菌25-30分钟后自然冷却，得到有机物固体培养基。
其中蘑菇渣优选堆沤过的蘑菇渣：将蘑菇渣加水至最大持水量的70%-80%左右，堆成一堆，盖上塑料薄膜，堆沤3-4个月之后，摊开风干使用。糠醛渣也是生物质废弃物中的一种，来源于农副产品水解生产糠醛后的废弃物，含有少量氮磷钾和大量有机质，可以改善土壤结构，增加土壤团粒数量和通透性，调节土壤酸碱度，活化土壤，减少重金属离子的危害。草木灰来源于以秸秆作为原料发电的电厂，秸秆燃烧后产生大量的草木灰，含有多种矿质元素，其主要有效成分为碳酸钾。本发明中所选择使用的有机质原料苜蓿渣来源于苜蓿干草粉，在用水提取其中的苜蓿多糖等成分后获得的副产品，经过堆沤晾干得到，含有较丰富的有机质。其中的葡萄粕来源于葡萄酒厂的下脚料，经晒干后得到的产物，含有大量有机质和少量氮磷钾元素。
（2）甲基营养型芽孢杆菌培养物的制备：将斜面培养的甲基营养型芽孢杆菌接种于芽孢杆菌液体活化培养基上，活化培养基由蛋白胨 10.0g，酵母粉 5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水 1.0L，pH7.0灭菌后组成，于37℃下摇瓶培养14小时，得到甲基营养型芽孢杆菌种子液，将种子液按照2%接种量接种于经过高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水并搅拌，使菌种在好氧条件下发酵3-5天，得到甲基营养型芽孢杆菌培养物。
本发明使用的甲基营养型芽孢杆菌菌落呈乳白色，经过培养能够产生广谱抗真菌作用的环状脂肽Iturin A，对多种植物真菌病害有防治作用，是一种十分有潜力的生防菌株，经过固体发酵步骤对甲基营养型芽孢杆菌进行扩大培养，发酵产生的分解后的小分子有机物，又能为植物提供丰富的有机质。
（3）链霉菌培养物的制备：将斜面培养的链霉菌接种于链霉菌液体活化培养基上，活化培养基由可溶性淀粉 20.0g，KNO3 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水 1.0L，pH7.2～7.4灭菌后组成，于25-28℃下摇瓶培养24-30小时，得到链霉菌种子液，将种子液按照1.5%接种量接种于高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水搅拌，使菌种在好氧条件下发酵5-8天，得到链霉菌培养物。
本发明使用的链霉菌孢子呈直链状，菌落正面玻璃绿色，反面黝绿，通过固体培养能够产生抗细菌活性物质，还能产生宁南霉素以及嘧肽霉素等对病毒有拮抗作用的物质，对苹果细菌和病毒感染病害有很好的防治作用，发酵产生的小分子有机物，为苹果提供了丰富的有机质来源。
（4）灰色链霉菌培养物的制备：将斜面培养的灰色链霉菌接种于灰色链霉菌液体活化培养基上，活化培养基由马铃薯提取液 1.0L，葡萄糖 20.0g，pH自然灭菌后组成，与28℃下摇瓶培养18-20小时 ，得到灰色链霉菌种子液，将种子液按照2.5%接种量接种于高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水搅拌，使菌种在好氧条件下发酵3-5天，得到灰色链霉菌培养物。
本发明使用的灰色链霉菌为其锈色变种，其在马铃薯平皿上，菌落灰白色，干燥；有皱褶，有露珠；背面土黄色；气生菌丝扩展；孢子丝形成紧密螺旋，对土壤当中的氮磷元素有很好的转化作用，可将土壤中被固定化的氮磷元素得以释放，并且也可以产生一定的抗菌作用。
（5）大中微量元素组合物的制备：将尿素、磷酸一铵、磷酸二铵、硫酸钾、硝酸铵、硝酸钾、氯化钾、钼酸铵、硼酸、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铁中的多种，分别粉碎后进行混合，得到大中微量元素组合物。通过各种元素的搭配，使得菌剂含有的元素含量比例适合苹果的生长，苹果氮以硝态氮，忌用铵态氮；磷为水溶性磷；钾以硫酸钾，忌用氯化钾。
（6）原料混拌及干燥：将以上得到的甲基营养型芽孢杆菌培养物、链霉菌培养物、灰色链霉菌培养物进行混合后添加草木灰，调节pH至中性，进行干燥处理后粉碎过筛，再与一定比例的大中微量元素组合物进行混合后即得到复合微生物菌剂。通过混拌及干燥操作有效的降低菌剂的水分含量，有利于菌剂长时间的保存。
（7）定量包装：将得到的复合微生物菌剂进行定量后包装，即得到复合微生物菌剂成品。
优选的，步骤（1）中的固体有机物原料蘑菇渣、糠醛渣、苜蓿渣、葡萄粕使用前经过自然腐熟和暴晒步骤。
优选的，步骤（2）中的甲基营养型芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，其菌株保藏编号为CICC 24093。
优选的，步骤（3）中的链霉菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，其菌株保藏编号为CICC 41038。
优选的，步骤（4）中的灰色链霉菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，其菌株保藏编号为 23624。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：苹果菌剂是采用生物工程手段，摸索出的一种新型、高效、持效长的高新技术。通过固体培养的方式生产微生物菌剂，操作简便易行，生产的菌剂既具有广谱的防治苹果病虫害的功能，又能促进苹果生长、改善土壤理化性状、有效分解土壤中氮（N）、磷（P）、钾（K），该品不仅含有大量天然有机质、氮、磷、钾、硅、铁、镁等营养元素，还含有生物抗病因子，是生产有机绿色苹果的最佳选择。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
(1)将腐熟并暴晒之后的蘑菇渣、糠醛渣、苜蓿渣、葡萄粕按照等质量的比例进行混拌，添加一定比例的草木灰调节其pH，使其pH分别达到7.0和7.4，将混合后的有机物料放入卧式杀菌釜中，115℃湿热杀菌30分钟后自然冷却，得到有机物固体培养基。
（2）将斜面培养的甲基营养型芽孢杆菌接种于芽孢杆菌液体活化培养基上，其中活化培养基由蛋白胨 10.0g，酵母粉 5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水 1.0L，pH7.0灭菌后组成，于37℃下摇瓶培养14小时，得到甲基营养型芽孢杆菌种子液，将种子液按照2%接种量接种于经过高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水并搅拌，使菌种在好氧条件下发酵4天，得到甲基营养型芽孢杆菌培养物。
（3）将斜面培养的链霉菌接种于链霉菌液体活化培养基上，活化培养基由可溶性淀粉 20.0g，KNO3 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水 1.0L，pH7.2～7.4灭菌后组成，于28℃下摇瓶培养28小时，得到链霉菌种子液，将种子液按照1.5%接种量接种于高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水搅拌，使菌种在好氧条件下发酵7天，得到链霉菌培养物。
（4）将斜面培养的灰色链霉菌接种于灰色链霉菌液体活化培养基上，活化培养基由马铃薯提取液 1.0L，葡萄糖 20.0g，pH自然灭菌后组成，与28℃下摇瓶培养20小时 ，得到灰色链霉菌种子液，将种子液按照2.5%接种量接种于高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水搅拌，使菌种在好氧条件下发酵3天，得到灰色链霉菌培养物。
（5）将尿素、磷酸一铵、硫酸钾、硝酸铵、硝酸钾、钼酸铵、硼酸、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铁，分别粉碎后进行混合，得到大中微量元素组合物。
（6）将以上得到的甲基营养型芽孢杆菌培养物20份、链霉菌培养物20份、灰色链霉菌培养物30份进行混合后添加草木灰，调节pH至中性，进行干燥处理后粉碎过筛，再添加大中微量元素组合物30份进行混合后即得到复合微生物菌剂。
（7）将得到的复合微生物菌剂进行定量后包装，即得到复合微生物菌剂成品。
实施例2：
(1)将腐熟并暴晒之后的蘑菇渣、糠醛渣、葡萄粕按照1:1:2的比例进行混拌，添加一定比例的草木灰调节其pH，使其pH分别达到7.0和7.2，将混合后的有机物料放入卧式杀菌釜中，115℃湿热杀菌25分钟后自然冷却，得到有机物固体培养基。
（2）将斜面培养的甲基营养型芽孢杆菌接种于芽孢杆菌液体活化培养基上，其中活化培养基由蛋白胨 10.0g，酵母粉 5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水 1.0L，pH7.0灭菌后组成，于37℃下摇瓶培养14小时，得到甲基营养型芽孢杆菌种子液，将种子液按照2%接种量接种于经过高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水并搅拌，使菌种在好氧条件下发酵5天，得到甲基营养型芽孢杆菌培养物。
（3）将斜面培养的链霉菌接种于链霉菌液体活化培养基上，活化培养基由可溶性淀粉 20.0g，KNO3 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水 1.0L，pH7.2～7.4灭菌后组成，于28℃下摇瓶培养30小时，得到链霉菌种子液，将种子液按照1.5%接种量接种于高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水搅拌，使菌种在好氧条件下发酵8天，得到链霉菌培养物。
（4）将斜面培养的灰色链霉菌接种于灰色链霉菌液体活化培养基上，活化培养基由马铃薯提取液 1.0L，葡萄糖 20.0g，pH自然灭菌后组成，与28℃下摇瓶培养20小时 ，得到灰色链霉菌种子液，将种子液按照2.5%接种量接种于高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水搅拌，使菌种在好氧条件下发酵4天，得到灰色链霉菌培养物。
（5）将尿素、磷酸二铵、硫酸钾、硝酸铵、钼酸铵、硼酸、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铁，分别粉碎后进行混合，得到大中微量元素组合物。
（6）将以上得到的甲基营养型芽孢杆菌培养物30份、链霉菌培养物25份、灰色链霉菌培养物20份进行混合后添加草木灰，调节pH至中性，进行干燥处理后粉碎过筛，再添加大中微量元素组合物25份进行混合后即得到复合微生物菌剂。
（7）将得到的复合微生物菌剂进行定量后包装，即得到复合微生物菌剂成品。
实施例3：
(1)将腐熟并暴晒之后的蘑菇渣、苜蓿渣、葡萄粕按照3:2:1的比例进行混拌，添加一定比例的草木灰调节其pH，使其pH分别达到7.0和7.2，将混合后的有机物料放入卧式杀菌釜中，115℃湿热杀菌25分钟后自然冷却，得到有机物固体培养基。
(2)将斜面培养的甲基营养型芽孢杆菌接种于芽孢杆菌液体活化培养基上，其中活化培养基由蛋白胨 10.0g，酵母粉 5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水 1.0L，pH7.0灭菌后组成，于37℃下摇瓶培养14小时，得到甲基营养型芽孢杆菌种子液，将种子液按照2%接种量接种于经过高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水并搅拌，使菌种在好氧条件下发酵3天，得到甲基营养型芽孢杆菌培养物。
(3)将斜面培养的链霉菌接种于链霉菌液体活化培养基上，活化培养基由可溶性淀粉 20.0g，KNO3 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水 1.0L，pH7.2～7.4灭菌后组成，于26℃下摇瓶培养24小时，得到链霉菌种子液，将种子液按照1.5%接种量接种于高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水搅拌，使菌种在好氧条件下发酵5天，得到链霉菌培养物。
(4)将斜面培养的灰色链霉菌接种于灰色链霉菌液体活化培养基上，活化培养基由马铃薯提取液 1.0L，葡萄糖 20.0g，pH自然灭菌后组成，与28℃下摇瓶培养18小时 ，得到灰色链霉菌种子液，将种子液按照2.5%接种量接种于高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水搅拌，使菌种在好氧条件下发酵3天，得到灰色链霉菌培养物。
(5)将尿素、磷酸二铵、硫酸钾、硝酸钾、钼酸铵、硼酸、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铁，分别粉碎后进行混合，得到大中微量元素组合物。
(6)将以上得到的甲基营养型芽孢杆菌培养物25份、链霉菌培养物25份、灰色链霉菌培养物25份进行混合后添加草木灰，调节pH至中性，进行干燥处理后粉碎过筛，再添加大中微量元素组合物25份进行混合后即得到复合微生物菌剂。
(7)将得到的复合微生物菌剂进行定量后包装，即得到复合微生物菌剂成品。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术，其特征在于：所述复合微生物菌剂包括：甲基营养型芽孢杆菌培养物20-30份、链霉菌培养物20-30份、灰色链霉菌培养物20-30份以及大中微量元素组合物10-40份；所述复合微生物菌剂的生产工艺包括以下步骤：
(1)有机物固体培养基的制备：将蘑菇渣、糠醛渣、苜蓿渣、葡萄粕的一种或多种进行混拌，通过添加一定比例的草木灰调节其pH，以符合不同菌种的发酵条件，将混合后的有机物料放入卧式杀菌釜中，115℃湿热杀菌25-30分钟后自然冷却，得到有机物固体培养基；
(2)甲基营养型芽孢杆菌培养物的制备：将斜面培养的甲基营养型芽孢杆菌接种于芽孢杆菌液体活化培养基上，活化培养基由蛋白胨 10.0g，酵母粉 5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0灭菌后组成，于37℃下摇瓶培养14小时，得到甲基营养型芽孢杆菌种子液，将种子液按照2%接种量接种于经过高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水并搅拌，使菌种在好氧条件下发酵3-5天，得到甲基营养型芽孢杆菌培养物；
(3)链霉菌培养物的制备：将斜面培养的链霉菌接种于链霉菌液体活化培养基上，活化培养基由可溶性淀粉 20.0g，KNO3 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水 1.0L，pH7.2～7.4灭菌后组成，于25-28℃下摇瓶培养24-30小时，得到链霉菌种子液，将种子液按照1.5%接种量接种于高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水搅拌，使菌种在好氧条件下发酵5-8天，得到链霉菌培养物；
(4)灰色链霉菌培养物的制备：将斜面培养的灰色链霉菌接种于灰色链霉菌液体活化培养基上，活化培养基由马铃薯提取液 1.0L，葡萄糖 20.0g，pH自然灭菌后组成，与28℃下摇瓶培养18-20小时 ，得到灰色链霉菌种子液，将种子液按照2.5%接种量接种于高温灭菌后的有机物固体培养基中，进行固体发酵培养，定期进行洒水搅拌，使菌种在好氧条件下发酵3-5天，得到灰色链霉菌培养物；
(5)大中微量元素组合物的制备：将尿素、磷酸一铵、磷酸二铵、硫酸钾、硝酸铵、硝酸钾、氯化钾、钼酸铵、硼酸、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铁中的多种，分别粉碎后进行混合，得到大中微量元素组合物；
(6)原料混拌及干燥：将以上得到的甲基营养型芽孢杆菌培养物、链霉菌培养物、灰色链霉菌培养物进行混合后添加草木灰，调节pH至中性，进行干燥处理后粉碎过筛，再与一定比例的大中微量元素组合物进行混合后即得到复合微生物菌剂；
(7)定量包装：将得到的复合微生物菌剂进行定量后包装，即得到复合微生物菌剂成品。
2.根据权利要求1所述的一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术，其特征在于：所述步骤（1）中的固体有机物原料蘑菇渣、糠醛渣、苜蓿渣、葡萄粕使用前经过自然腐熟和暴晒步骤。
3.根据权利要求1所述的一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术，其特征在于：所述步骤（2）中的甲基营养型芽孢杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，其菌株保藏编号为CICC 24093。
4.根据权利要求1所述的一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术，其特征在于：所述步骤（3）中的链霉菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，其菌株保藏编号为CICC 41038。
5.根据权利要求1所述的一种苹果种植使用的复合微生物菌剂的工艺技术，其特征在于：所述步骤（4）中的灰色链霉菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，其菌株保藏编号为 23624。
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