CN112877235B - 一种贝莱斯芽胞杆菌zzbv-3及其应用 - Google Patents

一种贝莱斯芽胞杆菌zzbv-3及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽胞杆菌ZZBV‑3及其应用。属于植物病害防控技术领域。贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)ZZBV‑3，保藏编号为CGMCCNO.21554，其抑菌谱广，对多种植物病原菌均具有良好的抑菌效果。大棚试验结果表明，对‘红颜’和‘甜查理’两个个品种草莓的根腐病防效分别为77.96％和81.18％，生防应用前景良好。

Description

一种贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3及其应用
技术领域
本发明涉及植物病害防控技术领域，更具体的说是涉及一种贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3及其应用。
背景技术
草莓为多年生宿根性草本植物，具有较高的食用和经济价值。近年来，我国草莓产业发展迅速，但随着栽培面积的扩大及土地多年连作，导致根腐越发严重，严重时发病率可达80％以上，给草莓生产带来巨大的经济损失。尖孢镰刀菌是引起草莓根腐病的主要病原菌之一，作为世界性土传病原真菌，其寄主范围广，还会引起黄瓜枯萎病、辣椒根腐病病、棉花枯萎病等100多种植物病害发生。草莓根腐病发病初期从幼根前端或中部变成褐色或黑褐色，不定根的中间部位表皮坏死，病健交界明显，被侵染的植株长势弱，叶片变黄，分蘖减少，结果减少，严重时维管束褐变、坏死，整株植株萎蔫，最后枯死。
目前，对于草莓根腐病的防治仍以化学防治为主，然而化学药剂的长期使用，易导致农药残留及病原菌产生抗药性等问题的产生。生物防治是目前植物病害防治的发展方向之一，其中微生物拮抗菌具有对因环境友好、对人类健康安全，在防病的同时还能对作物产生促生作用等优点而备受关注。
因此，如何提供一种优质的拮抗菌，提高一种草莓根腐病的防效是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3及其应用。为获得如草莓根腐病原菌尖孢镰刀菌类致病菌的优良拮抗菌，以草莓种植基地的土壤为拮抗菌来源，通过室内测定不同菌株的抑菌活性，筛选抑菌率最高的菌株，在此基础上对所筛菌株进行分类鉴定，并评价其抑菌谱和防效。筛选出菌株ZZBV-3的抑菌作用最强，抑菌圈直径为16.2mm。经形态学及多基因(包括16srDNA和gyrB基因)比对分析，确认菌株ZZBV-3为贝莱斯芽胞杆菌。抑菌谱广，对多种植物病原菌均具有良好的抑菌效果。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ZZBV-3，保藏编号为CGMCC NO.21554。
进一步的：保藏中心为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ZZBV-3，保藏编号为CGMCC NO.21554，保藏时间为2020年12月25日。
本发明还提供了上述的贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3的发酵产物。
本发明还提供了述的贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3或其发酵产物的菌剂。
本发明还提供了述的贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3或其发酵产物的药物。
优选的：药物为对小核菌属、葡萄孢核盘菌属、镰刀菌属、炭疽菌属、青霉菌属和曲霉属均具有抑菌效果的药物。
本发明还提供了上述的贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3、其发酵产物或含有其的菌剂、药物在控制或防治植物病害中的应用。
优选的：植物为草莓。
优选的：植物病害为草莓根腐病。
本发明还提供了上述的贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3、其发酵产物或含有其的菌剂、药物在抑制尖孢镰刀菌、花生白绢病菌、草莓灰霉病菌、兰花根腐病菌、兰花炭疽病菌、柑橘青霉病菌和玉米黑曲霉病中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3及其应用，取得的技术效果为贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3抑菌谱广，对多种植物病原菌均具有良好的抑菌效果。大棚试验结果表明，对‘红颜’和‘甜查理’两个个品种草莓的根腐病防效分别为77.96％和81.18％，生防应用前景良好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的菌株ZZBV-3的抑菌实物图。
图2附图为本发明提供的菌落特征实物图。
图3附图为本发明提供的显微特征芽孢间生实物图。
图4附图为本发明提供的ZZBV-3对草莓‘红颜’根腐病的防效实验实物图，其中，A：尖孢镰刀菌菌液+无菌水(CK)；B：尖孢镰刀菌菌液+ZZBV-3发酵液；C：尖孢镰刀菌菌液+1000倍50％多菌灵。
图5附图为本发明提供的ZZBV-3对草莓‘甜查理’根腐病的防效实验实物图，其中，A：尖孢镰刀菌菌液+无菌水(CK)；C：尖孢镰刀菌菌液+ZZBV-3发酵液；D：尖孢镰刀菌菌液+1000倍50％多菌灵。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3及其应用。
供试土壤样本采集自漳州市草莓种植基地，使用五点法采样，在草莓根系周围10～15cm深处采集土样共20份，用营养琼脂(NA)培养基(蛋白胨10g、牛肉膏粉3g、氯化钠5g、琼脂17g、蒸馏水1L)分离、纯化菌株。供试的草莓根腐病原菌F.oxysporum、花生白绢病菌Sclerotium rolfsii、草莓灰霉病菌Botrytis cinerea、兰花根腐病菌F.oxysporum、多肉炭疽病菌C.destructivum、柑橘青霉病菌Penicillium italicum和玉米黑曲霉病Aspergillus niger等7株病原菌由福建省农业科学院植物保护研究所提供(对具体致病菌株无要求，满足实验目的即可)，菌株保存和活化均采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养基(马铃薯6g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1L)。供试草莓均为苗龄6个月的健康植株，采用经121℃、30min高压蒸汽灭菌泥炭土为试验栽培基质，试验期间常规肥水管理。供试对照药剂为50％多菌灵可湿性粉剂(Carbendazim，江苏蓝丰生物化工有限公司)。
病情分级标准：0级，无病斑；1级，0％<病斑面积占总面积≤5％，植株长势受损；2级，5％<病斑面积占总面积≤15％，植株根茎部出现病斑；3级，15％<病斑面积占总面积≤25％，植株根茎病部扩大，呈现黑腐状；4级，25％<病斑面积占总面积≤50％，叶片萎蔫倒伏；5级，病斑面积占总面积>50％，植株死亡。
根据病级计算病情指数:病情指数＝Σ(各级病株数×各级级数)/(调查总株数×5)×100；防治效果＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数×100％。利用DPS 7.05数据处理软件的DMRT检验法，分析比较生防菌株ZZBV-3对6种植物病原菌抑菌宽度及大棚防效的差异显著性。
实施例1
拮抗菌株的分离
采用稀释涂布法分离土壤中的细菌，土样风干后称取1g放入装有100mL无菌水的试管中混匀，依次以10倍梯度稀释得到各浓度的土壤稀释液。分别取10-3、10-4和10-5的稀释液100μL涂布于NA培养基平板，后倒置于(28±1)℃、RH(80±5)％、光周期12L：12D的HGZ-150型光照培养箱(上海慧泰仪器制造有限公司)内培养2d，挑取培养基上的单菌落进行转接纯化；将纯化后的细菌菌株接种于NA斜面培养基中继续培养2d，后置于4℃冰箱保存备用。
拮抗菌株的筛选
以草莓根腐病原菌尖孢镰刀菌为靶标菌，采用对峙法和抑菌圈法，对分离的细菌进行初筛和复筛。
初筛：用5mm打孔器在纯化好的草莓根腐病菌边缘打孔，将菌饼接入PDA平板培养基中心，用无菌接菌环在距菌饼25mm的四个方向分别接入从土壤分离到的细菌，置于与拮抗菌株分离步骤相同条件的培养箱中培养5d，从中筛选出抑菌带宽大于5mm的菌株进行复筛。
复筛：将5mm纯化好的草莓根腐病菌菌饼接入PDA平板培养基中心，置于与拮抗菌株分离步骤相同条件的培养箱中培养7～10d，加入无菌水，轻轻刮下孢子，充分振荡混匀，用无菌滤纸过滤，稀释制成约含1×107个·mL-1孢子的悬浮液。取5mL孢子悬液加入100mL45℃左右的PDA培养基中，摇匀，倒入培养皿中，制成含尖孢镰刀菌的平板。取初筛菌株，各自接种到装有50ml NB液体培养基的三角瓶中，置于(28±1)℃、220r/min的ZWY-240型旋转式摇床振荡培养2d；收集发酵种子液，于(12±1)℃、10000r/min的KDC-140HR型高速冷冻离心机中离心20min，后取上清液用0.22μm滤膜过滤除菌得到无菌发酵液；在含尖孢镰刀菌的PDA平板上用直径5mm的打孔器选择合适的间距打孔，并取50μL滤液注入小孔内，静置30min后，置于与1.2.1相同条件的培养箱中培养5d，测量抑菌圈直径并记录实验结果。每处理重复3次，计算每株初筛菌株的抑菌率。
实施例2
拮抗菌株的鉴定
将菌株接种至PDA平板培养基上，37℃培养24h，观察菌落的形态、大小、边缘、透明度等特征，并结合革兰氏染色观察菌体及芽孢形态，并对照《常见细菌系统鉴定手册》从形态特征初步鉴定菌株的属。
实验结果：通过稀释涂布法共分离到39株菌株，将分离得到的菌株与草莓根腐病菌做生长对峙试验，初筛出抑菌带宽大于5mm的菌株3株用于复筛。复筛结果显示，菌株ZZBV-3抑菌活性最好，其抑菌圈直径为16.2mm，对草莓根腐病菌的生长具有抑制作用(图1)。
形态学鉴定：菌株接种至NA培养基上，37℃培养24h后生长良好，菌落呈淡黄色、边缘不规则、表面平滑、干燥(图2)，属革兰氏阳性菌，菌体杆状，长度1.2μm～1.7μm，宽度0.5μm～0.6μm，芽孢间生(图3)，对照《常见细菌系统鉴定手册》，初步将此菌株归为芽孢杆菌属。
结合16S rDNA和gyrB基因进行分子生物学鉴定，从基因层面最终确定所筛生防菌株的种。用细菌基因组DNA提取试剂盒(OMEGA)提取细菌的基因组DNA。
采用16S rDNA基因通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’/1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)和gyrB基因简并引物(UP-1:5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’和UP-2r:5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’，其中Y＝C/T，R＝A/G，N＝A/G/C/T)，通过C1000 Thermal Cyclers型PCR仪(Bio-Rad)对细菌基因组DNA进行扩增，其PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，35个循环，最后72℃延伸5min。
使用DYCP-31DN型琼脂糖水平电泳仪(北京六一生物科技有限公司)检测测PCR扩增产物，另用试剂盒回收目的条带，再送样生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序；对所测序列进行BLAST同源性比对。
实验结果：对ZZBV-3菌株的DNA进行16S-rDNA和gyrB扩增，经测序比对，表明ZZBV-3在基于16S-rDNA和gyrB的系统发育树中均与Bacillus velezensis聚为一支，结合生防菌ZZBV-3菌株的形态特征，最终将ZZBV-3菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。
实施例3
拮抗菌株的抑菌谱
以小核菌属的花生白绢病菌、葡萄孢核盘菌属的草莓灰霉病菌、镰刀菌属的兰花根腐病菌、炭疽菌属多肉炭疽病菌、青霉菌属的柑橘青霉病菌、曲霉属的玉米黑曲霉病菌，等6个属的6种植物病原菌为靶菌，按照实施例1中初筛方法活化培养所鉴定拮抗菌和靶菌，测定所鉴定菌株对6种植物病原菌的抑菌带宽，以抑菌带宽大于5mm为抑菌指标。
实验结果：
抑菌谱测定表明，菌株ZZBV-3对6个属的6种常见植物病原菌均具有不同程度的抑制作用，其中对镰刀菌属的兰花根腐病菌抑制作用最强，抑菌带宽达18.1mm，对其他5个属的植物病原菌也有良好的抑制作用，抑菌带宽12.6～16.3mm(表1)。可见，拮抗菌ZZBV-3对多种病原菌具有良好的抑菌效果。
表1菌株ZZBV-3对6种植物病原菌的抑菌带宽
Figure GDA0003753301110000071
注：不同字母表示0.05水平差异显著，下同。
实施例4
拮抗菌株的大棚防效
试验依次设接种尖孢镰刀菌+无菌水(CK)、接种尖孢镰刀菌+拮抗菌、接种尖孢镰刀菌+1000倍50％多菌灵溶液等3个处理，每处理30株，重复3次。尖孢镰刀菌按实施例1提及培养方法培养7d后，配成107孢子/mL的菌液备用。所得菌株ZZBV-3按实施例1提及的培养方法培养7d后，配成108孢子/mL的发酵液备用。
使用‘红颜’和‘甜查理’两个品种进行试验，其中处理1每株先灌根尖孢镰刀菌菌液10mL，2d后喷施无菌水20mL；处理2每株先灌根尖孢镰刀菌菌液10mL，2d后再喷施生防菌ZZBV-3发酵液20mL；处理3每株先灌根尖孢镰刀菌菌液10mL，2d后再喷施1000倍50％多菌灵溶液20mL；接种后第14d统计病情指数，计算防效。
大棚盆栽实验结果显示(图4、5)：接种尖孢镰刀菌菌液2d后喷施无菌水的‘红颜’和‘甜查理’品种均出现了叶片萎蔫、茎秆腐烂倒伏，植株死亡等病状；接种尖孢镰刀菌菌液2d后再喷施生防菌ZZBV-3发酵液或喷施1000倍50％多菌灵溶液的处理、其发病情况明显低于只接尖孢镰刀菌菌液的处理。统计各处理病情指数、并计算防效(表2)。结果显示，接种根腐病菌14d后‘红颜’品种的病情指数达34.22、‘甜查理’则为57.11；而经过菌株ZZBV-3发酵液和1000倍50％多菌灵处理的植株，‘红颜’品种病情植株仅为7.56和6.44；‘甜查理’品种病情指数仅为10.67和9.33。从防治效果可以看出，菌株ZZBV-3发酵液在‘红颜’和‘甜查理’上防治效果达77.96％和81.18％；该结果与施用1000倍50％多菌灵的防治效果80.98％和83.54％相差不大。说明该菌株ZZBV-3对尖孢镰刀菌引起的草莓根腐病具有抑制作用。
表2菌株ZZBV-3对草莓根腐病的大棚防效
Figure GDA0003753301110000081
注:－表示为空。Note:－meannull.
综上，贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3不仅对草莓根腐病菌具有显著的拮抗效果，对其他6个属的6种常见植物病原菌也有良好的抑制作用，抑菌谱广，为进一步研究其在田间应用中的效果提供了理论基础。
同时，拮抗菌株仅在室内试验中表现出拮抗作用是不够的，只有在田间应用中依旧表现出良好抑菌防效的生防菌株，才具有生防应用潜力。菌株ZZBV-3对草莓‘红颜’和‘甜查理’品种上根腐病的大棚防效达77.96％和81.18％，不仅与施用1000倍50％多菌灵的防治效果80.98％和83.54％相差不大，说明菌株ZZBV-3对草莓根腐病的发生具有抑制作用，在实际应用中具有一定的生防潜力，在丰富草莓根腐病原菌尖孢镰刀菌的生防资源的同时推动了贝莱斯芽孢杆菌等微生物资源在植物病害生防中的应用。
实施例5
采用常规工艺进一步制备贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3的发酵产物，或含有贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3或其发酵产物的菌剂，以及含有贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3或其发酵产物的药物。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ZZBV-3，保藏编号为CGMCC NO.21554。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3的发酵产物。
3.含有权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3或其发酵产物的菌剂。
4.含有权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3或其发酵产物的药物。
5.权利要求3所述的菌剂在控制或防治植物病害中的应用。
6.权利要求4所述的药物在控制或防治植物病害中的应用。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述植物为草莓。
8.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为草莓根腐病。
9.权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3、权利要求2所述的发酵产物、权利要求3所述的菌剂、或权利要求4所述的药物在抑制尖孢镰刀菌、花生白绢病菌、草莓灰霉病菌、兰花根腐病菌、多肉炭疽病菌、柑橘青霉病菌和玉米黑曲霉病菌中的应用。
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