CN116716190B - 一种螺卷毛壳菌201及其应用 - Google Patents

一种螺卷毛壳菌201及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种螺卷毛壳菌201及其应用，属于生物防治技术领域，所述螺卷毛壳菌201保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：63186；所述螺卷毛壳菌是从光叶苕子根内分离筛选获得的；对香蕉枯萎病菌的抑菌率达74.39％±0.99；能够抑制香蕉枯萎病菌TR4菌丝生长并导致菌丝畸形，交联变形，且孢子数聚集增多；盆栽试验表明，螺卷毛壳菌201对TR4的侵染起到了抑制作用；并且螺卷毛壳菌201未对香蕉叶片产生致病作用，不是香蕉的潜在致病菌；本发明为后期香蕉枯萎病的防治提供新的菌类资源。

Description

一种螺卷毛壳菌201及其应用
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，尤其涉及一种螺卷毛壳菌201及其应用。
背景技术
香蕉是世界重要的热带和亚热带水果。如今，香蕉已成为发展中国家继水稻、小麦、玉米后的第四大粮食作物。香蕉病虫害是香蕉生产上的重要制约因素，可造成香蕉产量和品质的损失，甚至造成区域性和全局性的香蕉产业波动。其中香蕉枯萎病是香蕉产区发生最为严重、最难防治的一种毁灭性病害。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的一种土传维管束病害。香蕉枯萎病小种的划分主要依据是病原菌在不同类型香蕉品系甚至不同属种上的危害情况，香蕉枯萎病菌有4个生理小种，其中4号生理小种又分为亚热带型(subtropical race 4,STR4)和热带型(tropicalrace 4,TR4)。但尖孢镰刀菌4号生理小种热带型(Fusarium oxysporum f.sp.cubensetropical race 4,Foc TR4)寄主广，危害大，为香蕉枯萎病的强致病菌，对香蕉生产造成的危险性和毁灭性最大。据不完全统计，Foc TR4在世界各香蕉主产区均已发现，并在世界范围内逐渐由发病区向非病区扩展，已成为世界香蕉产业发展的一个重要限制因素。香蕉枯萎病作为一种土传病害，带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤都可以作为病原菌的传染源。就目前而言，防治措施主要有化学药剂防治、无病组培苗及抗病品种、农业改良防治、生物防治等措施。Foc TR4在没有香蕉作为宿主的情况下其生存的能力是有限的，因此可以通过不同农作物之间的轮作和改善田园卫生等农艺实践措施来降低其发病风险。除此之外，使用化学药剂防治也可以达到对香蕉枯萎病的抑制，例如杀菌剂和土壤熏蒸剂的利用。化学防治是目前利用最广泛的一种方式，但反复大量的使用易导致环境污染等问题。另一种方法是选育抗性育种，在对Foc TR1的抗性育种取得了一些研究进展(Arinaitwe I K,Teo C H,Kayat F,et al.Evaluation of banana germplasm and genetic analysis of an F1population for resistance to Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 1[J].Euphytica,2019,215(10):175.)，但迄今为止，还没有选育出抗Foc TR4的品种。在这些措施当中，无病组培苗虽然有一定的效果，但是费用成本相对较高，再加上栽培香蕉是一种三倍体，难以进行抗病品种选育，更加制约了该措施的推广。而化学防治和农业改良措施，由于土传病害的一些特有因素，也难以取得理想效果。生物防控是香蕉枯萎病防治的一条绿色出路，即探索拮抗和促生的生防菌，因其具有显著的促进植物生长或防控土传病害的能力以及环境友好、安全无毒的特点，在农业生产上得到越来越广泛的应用。
目前内生真菌已经在不同作物土壤传播病原体的生物防治中得到证明，且内生真菌也是生防菌的一个重要来源，在防治植物病害和促生方面应用广泛。Damodaran等发现里氏木霉菌株CSR-T-3能地控制了香蕉尖孢镰刀菌引起的枯萎病，防效抑制率高达85.19％(Damodaran T,Rajan S,Muthukumar M,et al.Biological management of bananaFusarium wilt caused by Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4usingantagonistic fungal isolate CSR-T-3(Trichoderma reesei)[J].Frontiers inMicrobiology,2020,11:595845.)；植物内生细菌可以通过拮抗、竞争定殖作用和诱导植物产生抗病性等作用生物防治植物病害，也有些植物内生菌能够通过固氮作用，促进植物生长，增强植物抗性，间接对植物病害产生生物防治作用。部分拮抗菌可在根际和根内定植，不仅可以抑制病原体，还可以诱导寄主植物产生抗病性；Yu和Teng等发现了一株尖孢镰刀菌的拮抗细菌假单胞菌BAF.1，其通过产生的铁载体抑制尖孢镰刀菌，最大抑制率为95.24％(Yu S M,Teng C Y,Liang J S,et al.Characterization of siderophoreproduced by Pseudomonas syringae BAF.1and its inhibitory effects on sporegermination and mycelium morphology of Fusarium oxysporum[J].Journalofmicrobiology(Seoul,Korea),2017,55(11):877-884.)。目前，尚没有发现能够拮抗香蕉枯萎病的内生真菌。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种螺卷毛壳菌201及其应用，本发明以香蕉枯萎病的病原菌为靶标菌，从光叶苕子根内分离筛选得到对香蕉枯萎病菌具有拮抗促生作用的真菌菌株，并对其进行鉴定，初步评价其对香蕉枯萎病的促生拮抗效果和作用机制，对后期香蕉枯萎病的防治提供新的菌类资源。
本发明提供了一种内生真菌螺卷毛壳菌(Chaetomium cochliodes)201，所述螺卷毛壳菌201保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63186。
本发明提供了所述的螺卷毛壳菌201在防治香蕉枯萎病中的应用。
优选的，所述香蕉枯萎病的致病菌为尖孢镰刀菌4号生理小种。
优选的，用所述螺卷毛壳菌201的发酵液对香蕉进行灌根处理。
优选的，所述发酵液的孢子浓度为107～109cfu/mL。
优选的，所述灌根处理的次数为1～4次，相邻两次灌根处理的间隔时间为6～8d。
本发明还提供了所述的螺卷毛壳菌201在促进香蕉植株生长中的应用。
优选的，所述螺卷毛壳菌201通过减轻尖孢镰刀菌4号生理小种对香蕉植株的抑制作用来促进香蕉植株生长。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明以香蕉枯萎病的病原菌为靶标菌，从光叶苕子根内分离筛选得到对香蕉枯萎病菌具有拮抗促生作用的真菌菌株螺卷毛壳菌201，对香蕉枯萎病菌的抑菌率达74.39％±0.99；螺卷毛壳菌201与TR4经平板对峙7天后，能够抑制TR4菌丝生长并导致菌丝畸形，交联变形，且孢子数聚集增多；与单培养TR4菌丝形态相比，螺卷毛壳菌201诱导TR4菌丝明显肿胀，节间缩短，分枝增多，菌丝粗糙，菌丝尖端扩张，呈泡状，菌丝在中间扩张。衣原体孢子形成，数目增多，孢子表面粗糙。
盆栽试验表明，接种TR4+螺卷毛壳菌201处理组中的大部分叶片保持健康，植株生长良好，无明显的感病症状，植株生长状态与对照组的香蕉幼苗无显著差异，说明螺卷毛壳菌201对TR4的侵染起到了抑制作用；并且螺卷毛壳菌201处理组香蕉幼苗无发病情况，说明螺卷毛壳菌201处理组未对香蕉叶片产生致病作用，不是香蕉的一种潜在致病菌。本发明为后期香蕉枯萎病的防治提供新的菌类资源。
生物保藏说明
螺卷毛壳菌(Chaetomium cochliodes)201保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63186；保藏日期为2023年2月22日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所。
附图说明
图1为双培养试验拮抗真菌接种位置及取样示意图；
图2为不同拮抗菌株对香蕉枯萎病菌的抑菌效果图；
图3为菌株201对香蕉枯萎病菌的抑菌效果；其中A为菌株201与TR4双培养下TR4直径；B为拮抗菌对TR4的抑制率；不同小写字母的数据表明在0.05水平上存在显著差异；
图4为菌株201对尖孢镰刀菌的拮抗效果；
图5为菌株201对尖孢镰刀菌的扫描电镜拮抗效果，其中a，b为菌株201抑制状态下香蕉枯萎病原菌TR4菌丝扫描电镜结构，c，d为对照香蕉枯萎病原菌TR4菌丝正常生长扫描电镜结构；
图6为菌株201的形态及显微结构；
图7为基于菌株201的r DNA-ITS基因序列的遗传发育树(A)和真菌ITS-PCR电泳图(B)；
图8为接种拮抗菌菌株201对香蕉叶片的生防效果及对香蕉的促生作用，其中A为TR4；B为CK；C为201+TR4；D为201；
图9为接种拮抗菌对后对香蕉球茎的影响，其中A为TR4；B为CK；C为201+TR4；D为201。
具体实施方式
本发明提供了一种内生真菌螺卷毛壳菌(Chaetomium cochliodes)201，所述螺卷毛壳菌201保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63186；以下简称菌株201。
在本发明中，所述菌株201分离自光叶苕子根部样品，经过分离、纯化后进行保藏。将菌株201在PDA培养基进行生长培养，观察该菌株菌落形态，并利用扫描电子显微镜菌株进行显微形态观察。菌株201培养14d后菌落直径为42mm，肉眼观察菌落形态，呈绒毛状或绵絮状，表面有一些呈黑绿色颗粒状物质；菌丝体呈现淡黄色、白色，反面有少数可溶性色素，呈淡褐色，菌落生长较快，显微结构发现菌株201菌丝少数分枝、细长，长21～35μm，基部宽1.6～3μm，端部变窄，菌丝呈团状发散生长，宽1～2.5μm。菌丝生长到一定程度时，会从菌丝分离出一些类似螺壳的物质，密集附着在部分菌丝表面，大小约0.1～2μm。
提取菌株201的基因组DNA作为模板，利用通用引物ITS1及ITS4对菌株201的基因组DNA进行PCR扩增后测序，所得序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中进行BLAST分析并与其它真菌进行序列同源性比较，确定菌株201的种属分类地位。发现菌株201与Chaetomium cochliodes同源性最高，达100％。在GenBank中对下载相似度较高的序列，使用MEGA 7.0软件利用最大似然法构建系统发育树，以此在分子层面对菌株201进行鉴定，可以确定菌株201与螺卷毛壳菌聚为一支，支持率为96％，同时结合菌落形态及显微特征观察，将菌株201鉴定为螺卷毛壳菌(Chaetomium cochliodes)。
本发明提供了所述的螺卷毛壳菌201在防治香蕉枯萎病中的应用。
在本发明中，所述香蕉枯萎病的致病菌优选为尖孢镰刀菌4号生理小种。在本发明具体实施过程中，优选的用所述螺卷毛壳菌201的发酵液对香蕉进行灌根处理；所述发酵液的孢子浓度优选为107～109cfu/mL，进一步优选为1～9×108cfu/mL；所述发酵液优选的通过将所述螺卷毛壳菌201在PDB液体培养基中培养获得。在本发明中，所述灌根处理的次数优选为1～4次，进一步优选为2～3次；相邻两次灌根处理的间隔时间优选为6～8d，进一步优选为7d。
本发明还提供了所述的螺卷毛壳菌201在促进香蕉植株生长中的应用。
在本发明中，所述螺卷毛壳菌201优选的通过减轻尖孢镰刀菌4号生理小种对香蕉植株的抑制作用来促进香蕉植株生长。在本发明中，在促进香蕉植株生长中的应用的具体操作与上述防治香蕉枯萎病中的应用的操作一致，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
试验材料
供试光叶苕子根部样品于2021年11月取样，采用五点取样法在云南省昆明市嵩明县绿肥长期定位实验基地进行(102°41‘E和25°28’N)。该地区的年平均气温和年平均降水量分别为11～22℃和899.8mm，无种植香蕉和无香蕉枯萎病症状。光叶苕子根部样品连同根际土装入事先准备好的干净保鲜袋中，带回实验室4℃保存待用。
供试香蕉枯萎病是尖孢镰刀菌4号生理小种热带型(Fusariumoxysporumf.sp.cubense tropical race 4,Foc TR4)，由云南农业科学院农业环境与资源研究所香蕉研究团队从西双版纳种植田中的巴西香蕉品种分离、鉴定和保存。
扫描电子显微镜(蔡司Sigma 300，柏林，德国)；供试培养基为马铃薯琼脂培养基(PDA，每1L含有200.0g马铃薯，20.0g葡萄糖，20.0g琼脂，不加琼脂为PDB培养基)、孟加拉红培养基(每1L含有3.0g蔗糖，3.0g硝酸钠，0.3g磷酸二氢钾，0.7g磷酸氢二钾，0.5g七水合硫酸镁，0.5g氯化钾，10.0g氯化钠，20.0g琼脂粉，50.0mg氯霉素)、Pikovskava无机磷固体培养基(卯婷婷,莫维弟,赵玳琳,等.解磷拮抗真菌分离鉴定及其对猕猴桃软腐病的生防评价[J].南方农业学报,2019,50(8):1748-1755.)、Ashby无氮培养基和CAS双层培养基(陈阳.水稻内生固氮菌的分离鉴定及菌株BV6抑真菌机制研究[D].南京:南京农业大学,2019)。
试验方法
拮抗真菌菌株的分离、纯化、保藏
采集光叶苕子根部，将其表面用无菌水清洗干净，室内晾干后，无菌条件下，称取l0 g洗净的植物根系，用75％的乙醇进行表面消毒，用无菌刀片切成2～3cm的小断，用75％的乙醇浸泡3min，后用无菌水冲洗2次。再用0.1％升汞浸泡1min，无菌水冲洗3次，放入装有9mL无菌水的灭菌研钵中，加入少许灭菌的石英砂研磨均匀，静置15min取1mL稀释至10-3、10-4、10-5、10-6浓度梯度，从各浓度梯度悬浮液中取0.1mL用无菌涂布棒涂于PDA和孟加拉红培养基平板上于28℃倒置培养，以最后1次洗过样品的无菌水为对照。
连续观察1～2天，对单个菌落计数，并继续观察。待固体培养基表面长出菌落时，分别挑取形态、大小各异的菌落接种到新的固体培养基上进行培养，分离出单一形态的菌种，待新的固体培养基上长出菌落时，再纯化2次，即分离到多个单菌株。纯化后的单菌株用接种针挑取菌落接种至PDA固体斜面培养基上，4℃冰箱临时保存。
拮抗真菌菌株初筛
初步筛选采用平板对峙法(Fan H,Li S,Zeng L,et al.Biological control ofFusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4using nativelyisolatedBacillus spp.YN0904 and YN1419[J].Journal ofFungi,2021,7(10):795.)，制备PDA培养基后倒板备用，用无菌打孔器打取直径2mm的香蕉枯萎病菌饼接种在PDA培养基中央，并轻轻按压，防止掉落。在相隔菌饼2.5cm处接种筛选得到的真菌菌株置于同一平板上，用密封条封好，以没有接种待筛选拮抗真菌菌株的平板作为对照，重复3次，置于培养箱，28℃条件培养72h，初步筛选有抑菌效果的真菌菌株。
拮抗真菌菌株复筛
为了筛选对Foc TR4具有抗真菌活性的拮抗真菌，参考改良Li(Li S,He P,Fan H,et al.A Real-Time Fluorescent Reverse Transcription Quantitative PCR Assayfor Rapid Detection of Genetic Markers,Expression Associated with FusariumWilt of Banana Biocontrol Activities inBacillus[J].Journal ofFungi,2021,7(5):353.)的平板对峙法方。将香蕉枯萎病病原菌菌饼接种在新制备的PDA培养基平板十字线中央，用接种针挑取具有抑菌效果的真菌菌丝接种在TR4菌饼延2.5cm处(如图1所示)，以不接种拮抗真菌菌株为对照，28℃下培养7天，3次重复。测量病原菌生长距离，计算平均抑菌效果。
抑制率(％)＝[(对照组病原菌生长直径-处理组病原菌生长直径)/(对照组病原菌生长直径-接种菌饼直径)]×100％。
拮抗真菌菌株的分子生物学鉴定
使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)提取拮抗菌株的DNA。通用引物ITS1/ITS4扩增该菌株的ITS序列。PCR反应体系(50μL)为：1×TSE101金牌mix45μL，ITS1(10P)2μL，ITS4(10P)2μL，DNA模板1μL。PCR的热循环条件：98℃预变性2min，98℃下变性10s，56℃退火10s，72℃下延伸10s，35个循环，72℃温浴5min，4℃下保存备用。将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μL样品+6μL溴酚蓝)，300V电压下12min，获取鉴定胶图。将准备好PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序(测序引物为ITS1/ITS4)。随后进行系统发育分析，在NCBI上将真菌的ITS基因序列进行BLAST序列同源性比对，获得同源性序列，采用MEGA7.0邻接法构建系统发育树。
拮抗真菌对香蕉枯萎病盆栽防效及对香蕉植株的促生作用测定
盆栽前处理
温室盆栽试验于2022年8月至11月进行。将巴西蕉组培苗转入砂基质中进行驯化30天。选择5～6片叶片的香蕉植株进行盆栽实验，评价TR4的生物防治和促生长效果。
拮抗菌株发酵原液制备
使用无菌接种针挑取内生真菌菌饼落接种到PDB液体培养基中，在28℃和180r/min条件下振荡培养72h后，得到发酵液，使用血球计数板调节孢子浓度为1×108cfu/mL。
TR4尖孢镰刀菌孢子液发酵液制备
将活化的TR4病原菌菌丝接种于PDB液体培养基中，在28℃和180r/min下振荡培养72h后，用四层无菌纱布过滤菌丝，得到TR4孢子悬液。用无菌水稀释至1×106cfu/mL的TR4孢子溶液中，4℃下储存待用。
盆栽试验设计
选择5～6片叶片的香蕉植株进行盆栽实验，每盆香蕉苗灌根前进行伤根处理。阳性对照组1(TR4)：用浓度为1×106cfu/mL尖孢镰刀菌孢子发酵液悬液进行灌根处理(50mL)；阴性对照组2(CK)：PDB液体培养基(50mL)；处理组1(TR4+拮抗真菌)：用浓度为1×106cfu/mL尖孢镰刀菌孢子发酵液悬液(50mL)+拮抗菌株发酵溶液(50mL)；处理组2(拮抗真菌)：拮抗菌株发酵溶液(50mL)。7d后再次向处理组1和处理2灌根等量的拮抗真菌发酵原液(50mL)。所有处理3次重复。
TR4生物防治效果及对香蕉促生效果的评价
接种45d后，参考Fan的方法(Fan H,Li S,Zeng L,et al.Biological controlofFusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4using natively isolatedBacillus spp.YN0904 and YN1419[J].Journal of Fungi,2021,7(10):795.)；按0～4的5个等级调查香蕉植株叶片和球茎的发病程度。叶片病害分级：0级：无症状；1级：真叶和子叶黄萎面积不超过总面积的50％；2级：真叶和子叶黄萎面积超过总面积的50％；3级：叶片枯萎或死亡，只有生长点存活；4级：整株植物严重枯萎或死亡。球茎病害分级：0级：球茎无病变；1级：球茎病变面积为1～10％；2级：球茎病变面积为11～30％；3级：球茎病变面积为31～50％；4级：球茎病变面积分别大于50％。测量并记录每个处理后各香蕉的株高、茎粗、叶片数、叶长、叶宽、地上部鲜重和地下部鲜重。
发病指数(％)＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高病级数值)×100
防治效果(％)＝(对照组病情指数-处理病情指数)/对照组病情指数×100
数据分析
采用Excel 2010和SPSS22.0软件进行数据的处理与分析。采用0rigin 2021软件进行分析作图。
结果与分析
拮抗真菌菌株的筛选
对光叶苕子根部分离纯化后的不同真菌菌株，采用平板对峙方法将其与香蕉枯萎病病原菌进行对峙培养试验，进行初步筛选，初筛获得拮抗效果较明显的真菌菌株共2株，分别为201和302菌株。将得到的2株拮抗真菌进行抑菌率复筛试验。201、菌株抑菌作用最高，由图2，3可知，201菌株抑菌率达74.39％±0.99，且抑制效果稳定并显著优于302菌株，因此选用菌株201作为研究对象。
利用扫描电子显微镜观察TR4菌丝及分生孢子。菌株201对香蕉枯萎病抑菌效果见图4，图5，TR4对照香蕉枯萎病原菌菌丝正常生长，气生菌丝明显呈白色絮丝状，菌丝颜色为乳白色，光滑、均匀，孢子形态完整，数目正常(图5中的c、d)。拮抗真菌与TR4经平板对峙7天后，拮抗菌株抑制TR4菌丝生长并导致菌丝畸形，交联变形，且孢子数聚集增多；与单培养TR4菌丝形态相比，拮抗菌株201诱导TR4菌丝明显肿胀，节间缩短，分枝增多，菌丝粗糙(图5中的a、b，箭头1)。菌丝尖端扩张，呈泡状(图5中的a，箭头2)，菌丝在中间扩张(图5中的a、b，箭头3)。衣原体孢子形成，数目增多，孢子表面粗糙(图5中的b，箭头4)。
真菌鉴定
形态学鉴定
将分离获得的菌株201在PDA培养基上于28℃进行生长培养，观察该菌株菌落形态(图6)，并利用扫描电子显微镜对菌株201进行显微形态观察(图6)。菌株201培养14d后菌落直径为42mm，肉眼观察菌落形态，菌落呈绒毛状或绵絮状，表面有一些呈黑绿色颗粒状物质；菌丝体呈现淡黄色、白色，反面有少数可溶性色素，呈淡褐色，菌落生长较快，显微结构发现菌株201菌丝少数分枝、细长，长21～35μm，基部宽1.6～3μm，端部变窄，菌丝呈团状发散生长，宽1～2.5μm。菌丝生长到一定程度时，会从菌丝分离出一些类似螺壳的物质，密集附着在部分菌丝表面，大小约0.1～2μm。
分子生物学鉴定
提取菌株201的基因组DNA作为模板，利用通用引物ITS1及ITS4对其进行PCR扩增，采用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，在成像系统中进行拍照，观察得到一条清晰明亮的电泳条带见图7中的B，电泳时采用的Marker为5000bp，201扩增所得基因片段大小为500～750bp之间。
委托北京擎科生物科技有限公司进行测序，所得序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中进行BLAST分析并与其它真菌进行序列同源性比较，确定各菌株的种属分类地位。发现菌株201与Chaetomium cochliodes同源性最高，达100％；在GenBank中对下载相似度较高的序列，使用MEGA 7.0软件利用最大似然法构建系统发育树见图7中的A，以此在分子层面对201拮抗真菌菌株进行鉴定，可以得到201拮抗真菌与螺卷毛壳菌聚为一支，支持率为96％，同时结合菌落形态及显微特征观察，将菌株201鉴定为螺卷毛壳菌(Chaetomium cochliodes)。
拮抗真菌对香蕉枯萎病盆栽防效
接种45d后，单独接种TR4发酵液的香蕉(TR4，图8中的A)叶片变黄，植株发育不良，下部叶枯死脱落，发病程度较高；而处理组1(201+TR4中的大部分叶片保持健康(图8中的C)，植株生长良好，无明显的感病症状，植株生长状态与对照组(CK，图8中的B)的香蕉幼苗无显著差异，说明201拮抗真菌明显对TR4的侵染起到了一定的抑制作用。而处理组2(拮抗真菌201发酵溶液，图8中的D)无发病情况，说明拮抗真菌201未对香蕉叶片产生致病作用，不是香蕉的一种潜在致病菌。
此外，对香蕉球茎进一步观察，单独接种TR4发酵液(TR4，图9中的A)的香蕉球茎与对照植株(CK，图9中的B)相比，接种TR4后的球茎出现明显症状，球茎颜色出现呈棕黑色感染区，球茎纵剖面褐变明显，基部腐烂，处理组1(201+TR4)中的球茎存在不同的发病情况(图9中的C)，201+TR4处理组中香蕉球茎纵剖面存在部分发病区，但控制在1～5％左右。而处理组2(拮抗真菌201发酵溶液，图9中的D)香蕉球茎无发病情况，与空白对照相比球茎纵剖面相似，无发病区。
综上所述，拮抗真菌201可以一定程度抑制TR4对香蕉的侵染，降低香蕉枯萎病的发病情况，单独处理未对香蕉产生致病作用，对香蕉没有致病性。
通过盆栽试验调查表明，拮抗真菌201对TR4病原菌有显著的抑制作用(表1)，球茎的防治效果为90.625％，病情指数显著低于单独施用TR4处理。
表1拮抗真菌201对盆栽实验中TR4的生物防治作用
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
拮抗真菌对香蕉的促生作用
对拮抗真菌201进行香蕉幼苗促生长试验，结果(表2、图8、图9)表明，与空白对照相比，单独接种拮抗真菌201发酵液对香蕉植株的生长无显著影响，但201处理增加了植株叶长；与单独接种TR4发酵液处理相比，接种201和TR4发酵液处理可显著促进香蕉幼苗的生长，分别提高香蕉株高(54.1％)、茎围(19.3％)、叶片数(49.0％)、叶长(28.5％)以及增加地上部(95.2％、)和地下部(168.5％)鲜重，表明拮抗真菌201能在一定范围内减少TR4对香蕉生长的抑制作用，从而促进香蕉的生长，且接种拮抗菌和TR4发酵液的处理组与单独接种拮抗真菌处理相比差异不显著，更能说明拮抗真菌减少TR4对香蕉生长的抑制作用，可作为高效的抗病促生菌株资源。
表2拮抗真菌201对香蕉促生的影响
注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由上述实施例可知，本发明提供的螺卷毛壳菌201，对香蕉枯萎病菌的抑菌率达74.39％±0.99；能够抑制TR4菌丝生长并导致菌丝畸形，交联变形，且孢子数聚集增多；盆栽试验表明，螺卷毛壳菌201对TR4的侵染起到了抑制作用；并且螺卷毛壳菌201处理组香蕉幼苗无发病情况，说明螺卷毛壳菌201不是香蕉的潜在致病菌，能够广泛应用，不会带来负面影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种螺卷毛壳菌（Chaetomium cochliodes）201，其特征在于，所述螺卷毛壳菌201保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63186。
2.权利要求1所述的螺卷毛壳菌201在防治香蕉枯萎病中的应用，其特征在于，所述香蕉枯萎病的致病菌为尖孢镰刀菌4号生理小种热带型。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用所述螺卷毛壳菌201的发酵液对香蕉进行灌根处理，所述发酵液的孢子浓度为107 ~109cfu/mL。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述灌根处理的次数为1~4次，相邻两次灌根处理的间隔时间为6~8d。
5.权利要求1所述的螺卷毛壳菌201在促进香蕉植株生长中的应用，其特征在于，所述螺卷毛壳菌201通过减轻尖孢镰刀菌4号生理小种热带型对香蕉植株的抑制作用来促进香蕉植株生长。
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