CN111304135B - 一种芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用 - Google Patents

一种芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用，属于微生物技术领域，所述芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.19003。本发明所述芽孢杆菌能够有效抑制黄瓜枯萎病病原菌繁殖生长；所述芽孢杆菌还能够应用于番茄青枯病、甜瓜根腐病和西瓜枯萎病的防治，所述芽孢杆菌应用范围广，防治效果好。

Description

一种芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)属葫芦科，是全球重要的、目前设施栽培最大、经济效益最高的蔬菜作物之一。黄瓜枯萎病是黄瓜生产中三大病害之一，是由尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum引起的一种土传病害，在我国黄瓜生产区发生严重，黄瓜的连作给土壤环境带来了一系列的负面影响，从而导致土壤微生物生态平衡失调，有益微生物受到抑制，有害微生物迅速繁殖成为优势菌群，这为该病害的发展提供了适宜的环境，通常在重茬3～5年后会影响作物的品质和产量，严重时造成减产甚至绝收。该病是由病原菌侵入黄瓜的根茎部并且寄生于维管束内，阻止水和养分的吸收，导致黄瓜植株发生系统性病害。黄瓜枯萎病是黄瓜生产的毁灭性土传病害，其病菌可以在土壤中生存数年，新种群可以通过不断变异而产生，很难预防与消除。
芽孢杆菌Bacillus spp.是自然界广泛分布的生防细菌，因具有庞大的种群，较强的繁殖力，稳定的理化性质，以及广泛的抑菌谱，在生产中应用较多。作为微生态环境中的优势种群，芽孢杆菌具有较高的防病能力和较强的抗逆能力，主要作用于各类植物的根部等病害的防治，能够促进植物生长、提高营养利用率，增强植物抗逆性广泛应用于农业生产研究中。目前用于生防的芽孢杆菌防治病害的类型单一、防治效果不理想。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种能够有效抑制黄瓜枯萎病病原菌繁殖生长的芽孢杆菌；所述芽孢杆菌还能够应用于番茄青枯病、甜瓜根腐病和西瓜枯萎病的防治。
本发明提供了一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)15，所述芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.19003。
本发明提供了一种芽孢杆菌菌剂，所述芽孢杆菌菌剂包括所述的芽孢杆菌。
优选的，所述芽孢杆菌菌剂为液体制剂或固体制剂。
优选的，所述芽孢杆菌菌剂中芽孢杆菌的活菌数为106～109cfu/mL。
本发明提供了所述芽孢杆菌或所述的芽孢杆菌菌剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。
本发明提供了所述芽孢杆菌或所述的芽孢杆菌菌剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。
本发明提供了所述芽孢杆菌或所述的芽孢杆菌菌剂在防治番茄青枯病中的应用。
本发明提供了所述芽孢杆菌或所述的芽孢杆菌菌剂在防治甜瓜根腐病中的应用。
本发明提供了所述芽孢杆菌或所述的芽孢杆菌菌剂在防治西瓜枯萎病中的应用。
优选的，所述芽孢杆菌或芽孢杆菌菌剂施用浓度为106～109cfu/mL，所述芽孢杆菌或芽孢杆菌菌剂的施用量为25～35mL/株。
优选的，所述芽孢杆菌或芽孢杆菌菌剂的施用方法为灌根。
有益效果：本发明提供的芽孢杆菌能够有效抑制黄瓜枯萎病病原菌繁殖生长；所述芽孢杆菌还能够应用于番茄青枯病、甜瓜根腐病和西瓜枯萎病的防治。田间试验表明，使用所述芽孢杆菌对黄瓜枯萎病的防治效果最高达到54.7％；对番茄青枯病、甜瓜根腐病房、西瓜枯萎病的防治效果最高分别达到54.2％、42.3％、41.2％。
生物保藏说明
本发明提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)15，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19003，保藏日期为2019年11月25日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为芽孢杆菌(Bacillus sp.)15的菌落形态；
图2为芽孢杆菌(Bacillus sp.)15对黄瓜枯萎病病原菌的平板拮抗作用；
图3为芽孢杆菌(Bacillus sp.)15对甜瓜根腐病病原菌的平板拮抗作用；
图4为芽孢杆菌(Bacillus sp.)15对西瓜枯萎病病原菌的平板拮抗作用；
图5为芽孢杆菌(Bacillus sp.)15对番茄青枯病病原菌的平板拮抗作用。
具体实施方式
本发明提供了一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)15，所述芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.19003。在本发明中，所述芽孢杆菌从黄瓜枯萎病发病严重的健康根际土壤中分离筛选获得，对黄瓜枯萎病病原菌具有显著的拮抗作用。
本发明还提供了一种芽孢杆菌菌剂，所述芽孢杆菌菌剂包括所述的芽孢杆菌。在本发明中，所述芽孢杆菌菌剂中芽孢杆菌的活菌数优选为106～109cfu/mL。在本发明中，所述芽孢杆菌菌剂优选为液体制剂或固体制剂。本发明对所述芽孢杆菌菌剂的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规的制备方法即可。将所述芽孢杆菌活化后，进行发酵培养。在本发明中，所述活化的温度优选为28℃，所述活化的时间优选为1～3d。本发明对所述发酵培养的步骤没有特殊限定，采用本领域常规的发酵培养的方法即可。
本发明提供了所述芽孢杆菌或所述的芽孢杆菌菌剂在防治黄瓜枯萎病、番茄青枯病、甜瓜根腐病和西瓜枯萎病中的应用。在本发明中，所述芽孢杆菌能够拮抗黄瓜枯萎病病原菌、番茄青枯病的病原菌、甜瓜根腐病的病原菌和西瓜枯萎病的病原菌。
在本发明中，所述芽孢杆菌或芽孢杆菌菌剂施用浓度优选为106～109cfu/mL，所述芽孢杆菌或芽孢杆菌菌剂的施用量优选为25～35mL/株，更优选为30mL/株。在本发明中，所述芽孢杆菌或芽孢杆菌菌剂的施用方法优选为灌根。在本发明中，在黄瓜、番茄、甜瓜和西瓜的苗期进行灌根；所述灌根的次数优选为2～4次，每次灌根的体积优选为8～12mL，更优选为10mL；相邻两次灌根的时间间隔优选为6～8d，更优选为7d。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
芽孢杆菌菌株15的筛选与分离
1、土样采集自黄瓜枯萎病发病严重田块的健康植株根际土，将健康植株连根拔起，轻轻抖动，待大部分土抖落后，剩余紧贴根的土壤连同部分须根一起收集，用封口袋装好，放入4℃冰箱保存备用。
2、将10g黄瓜健康根际土加入装入90ml无菌水的250ml三角瓶中，室温下170rpm振荡30min，然后吸取土壤悬浮液进行系列稀释，取浓度为10-5～10-8的稀释液各0.1ml涂布LB平板，每个稀释度3次重复。将平板放置30℃培养箱中培养48h后，选择菌落形态不一致菌株经纯化后4℃保存备用。
3、将黄瓜枯萎病病原菌活化，黄瓜枯萎病病原菌株为由本实验室筛选鉴定保存的1株尖孢镰刀菌-黄瓜转化型。然后用打孔器打取直径6mm的菌苔置于平板中央，28℃培养2d后，将分离到的细菌菌落点接于病原菌菌片周围，以单独接种病原菌菌苔的平板作为对照，28℃恒温培养3d，观察病原菌生长情况及有无抑菌圈出现。挑取拮抗效果好的菌株进行纯化，将纯化后的菌株连续多次进行平板对峙试验，看其抑菌效果。
选择抑菌效果最好的菌株，即为本发明所述中芽孢杆菌(Bacillus sp.)15，将菌株15接种于牛肉膏蛋白胨改良培养基上，30℃培养48h，以细菌基因组DNA提取试剂盒提取拮抗菌株的基因组DNA，采用细菌16S rRNA引物进行扩增。
引物F:
5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.1)；
引物R:
5’-TACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.2)。
反应体系为：Mg2+2.5μl，10×buffer 2.5μl，dNTP(10mmol·L-1)2μl，上下游引物(10mmol·L-1)各lμl，模板DNA 1μl，Taq酶(5U·μl-1)0.3μl，ddH2O 14.7μl，总体系为25μl。所用试剂均购自大连宝生物工程有限公司。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火l min，72℃延伸2min，72℃保持10min，共循环30次。PCR产物用1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压90V，15min，EB染色30min，找到目标条带。PCR扩增产物的纯化采用Axygen公司的凝胶纯化试剂盒，具体操作见说明书。纯化的PCR产物于-20℃保存备用。
选用Takara公司的T载体与扩增的16S rRNA基因片段酶连，反应体系为l0μl：DNA片段5μl，pMD19-T载体0.3μl，Solution I溶液4.7μl，16℃过夜。将连接有目的片段的质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，进行蓝白斑筛选，将阳性克隆送往上海美吉生物医药科技有限公司测序鉴定。
根据16S rRNA基因的测序结果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在线查询分析，利用Blast软件在GenBank中与其它菌株的16S rRNA基因序列进行同源性比较，选择相近的序列和测序菌株的序列用MEGA 5.0软件构建16S rRNA基因系统进化树。另外，对菌株15的gyrB保守基因和菌落形态以及生理生化特征(全细胞脂肪酸和API 50CH)进行了分析，综合上述结果，菌株15被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。
实施例2
菌株15对黄瓜枯萎病病原菌的拮抗作用
将黄瓜枯萎病病原菌活化，然后用打孔器打取直径6mm的菌苔置于平板中央，28℃培养2d后，将分离到的细菌菌落点接于病原菌菌片周围，以单独接种病原菌菌苔的平板作为对照，28℃恒温培养3d，观察病原菌生长情况及有无抑菌圈出现。挑取拮抗效果好的菌株进行纯化，将纯化后的菌株连续多次进行平板对峙试验，看抑菌效果，由图2可见菌株15对黄瓜枯萎病病原菌抑制作用较强。
实施例3
菌株15对其他植物病原菌的拮抗作用
采用平板对峙法，测试菌株15对番茄青枯病(Ralstonia solanacearum)，甜瓜根萎病及西瓜枯萎病(Fusarium oxysporum)这三种病害的病原菌的拮抗作用。对番茄青枯病拮抗作用的试验方法为：用无菌牙签将菌株15点接于NA平板中央，30℃培养12h，用1.0×108cfu/ml的青枯病原菌液喷液，48h后测定抑菌圈直径；对甜瓜根腐病和西瓜枯萎病病原菌的拮抗作用试验方法见实施例1。结果如图3～5所示，菌株15对番茄青枯病，甜瓜根萎病及西瓜枯萎病这三种病害的病原菌具有拮抗作用。
实施例4菌株15发酵液对黄瓜枯萎病的田间防治作用
田间试验在宁波市鄞州区宁波市农业科学研究院横溪基地内进行，试验材料为菌株15发酵液，试验设置1.0×106cfu/ml、1.0×107cfu/ml、1.0×108cfu/ml、1.0×109cfu/ml4个浓度梯度，于黄瓜苗移栽50天后开始施用菌株的发酵液，每隔7d施用1次，共计3次。每株黄瓜苗浇灌10ml，每处理3次重复，以施用等量清水为对照。
病情调查：每次灌菌后调查并记录各处理黄瓜植株的发病情况，统计各处理的病情指数和防治效果。根据植株叶片萎焉程度，将发病级别分5剂：0表示植株正常；1表示植株叶片萎焉≤25％；2表示26％≤植株叶片萎焉≤50％；3表示51％≤植株叶片萎焉≤75％；4表示76％≤植株叶片萎焉或死亡。
病情指数＝Σ(病级数×该病级植株株数)/(最大病级数×总株数)×100
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
表1菌株15发酵液对黄瓜枯萎病的田间防治效果
Figure BDA0002445048500000061
由表1可知，随着菌株15发酵液浓度的增加，菌株15对黄瓜枯萎病的防治效果越高，随着灌根次数的增多，防治效果也越好，1次灌根和2次灌根后各处理间的防治效果无显著差异，灌根3次后，1.0×107cfu/ml及以上浓度的处理与1.0×106cfu/ml有显著差异，因此推荐浓度推荐浓度为1.0×107～1.0×109cfu/ml，其3次灌菌后的防治效果为39.9％～54.7％。
实施例5菌株15发酵液对番茄青枯病的田间防治作用
田间试验在宁波市鄞州区宁波市农业科学研究院横溪基地内进行，试验材料为菌株15发酵液，试验设置1.0×106cfu/ml、1.0×107cfu/ml、1.0×108cfu/ml、1.0×109cfu/ml4个浓度梯度，于番茄苗移栽1个月后开始施用拮抗菌株的发酵液，每隔7d施用1次，共计3次。每株番茄苗浇灌10ml，每处理3次重复，以施用等量清水为对照。
病情调查：每次浇灌菌后7d调查并记录各处理番茄植株的发病情况，统计各处理的病情指数和防治效果。根据植株叶片萎蔫程度，将发病级数分为5级：0级，植株正常；1级，植株叶片萎蔫≤25％；2级，26％≤植株叶片萎蔫≤50％；3级，51％≤植株叶片萎蔫≤75％；4级，76％≤植株叶片萎蔫或死亡。
病情指数＝Σ(病级数×该病级植株株数)/(最大病级数×总株数)×100
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
表2菌株15对番茄青枯病的田间防治效果
Figure BDA0002445048500000071
由表2可知，随着菌株15发酵液浓度的增加，菌株15对番茄青枯病的防治效果越高，随着灌根次数的增多，其防治效果也越好。灌根3次后，1.0×106cfu/ml浓度的处理防治效果最差，与1.0×109cfu/ml有显著差异，1.0×107～1.0×109cfu/ml 3个处理间无显著差异，因此推荐浓度推荐浓度为1.0×107～1.0×109cfu/ml，其3次灌菌后的防治效果为44.2％～54.2％。
实施例6菌株15发酵液对西瓜枯萎病的田间防治作用
田间试验在宁波市鄞州区宁波市农业科学研究院东钱湖基地内进行，试验材料为菌株15发酵液，试验设置1.0×106cfu/ml、1.0×107cfu/ml、1.0×108cfu/ml、1.0×109cfu/ml 4个浓度梯度，于西瓜出苗后10天开始施用拮抗菌株的发酵液，每隔7d施用1次，共计3次。每株西瓜苗浇灌10ml，每处理3次重复，以施用等量清水为对照。
病情调查：西瓜枯萎病发病程度分为5个级别：0级：植株正常生长；1及：叶片或茎蔓萎焉。萎焉面积由下而上占全株的1/4或不到1/4；2级：叶片或茎蔓萎焉，萎焉面积由下而上占全株的1/2，茎蔓上有树脂状琥珀色黏液；3级：叶片或茎蔓萎焉，萎焉面积由下而上占全株的3/4，茎蔓上有树脂状琥珀色黏液；4级：全株萎焉死亡。
病情指数＝Σ(病级数×该病级植株株数)/(最大病级数×总株数)×100
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
表3菌株15对西瓜枯萎病的田间防治效果
Figure BDA0002445048500000072
Figure BDA0002445048500000081
由表3可知，随着菌株15发酵液浓度的增加，菌株15对西瓜枯萎病的防治效果越高，随着灌根次数的增多，其防治效果也越好。灌根3次后，1.0×109cfu/ml浓度的处理防治效果最好，与1.0×108cfu/ml无显著差异，与1.0×106～1.0×107cfu/ml有显著差异，因此推荐浓度为1.0×108～1.0×109cfu/ml，其3次灌菌后的防治效果为35.8％～42.3％。
实施例7菌株15发酵液对甜瓜根腐病的田间防治作用
田间试验在宁波市鄞州区宁波市农业科学研究院东钱湖基地内进行，试验材料为菌株15发酵液，试验设置1.0×106cfu/ml、1.0×107cfu/ml、1.0×108cfu/ml、1.0×109cfu/ml 4个浓度梯度，于甜瓜移栽后50天开始施用菌株15的发酵液，每隔7d施用1次，共计3次。每株甜瓜浇灌10ml，每处理3次重复，以施用等量清水为对照。
病情调查：甜瓜根腐病病情指数考查参考甜瓜枯萎病，分为5个级别：0级：全株无病，外部无症状；1级：全株叶片总数的1/4以下叶片发病，或茎内维管束1/4以下变褐色；2级：全株叶片总数的1/4～1/2叶片发病，或茎内维管束1/4～1/2变褐色；3级：全株叶片总数的1/2以上叶片发病，或茎内维管束3/4以上变褐色；4级：整株因病枯死。
病情指数＝Σ(病级数×该病级植株株数)/(最大病级数×总株数)×100
防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100
表4菌株15对甜瓜根腐病的田间防治效果
Figure BDA0002445048500000082
Figure BDA0002445048500000091
由表4可知，随着菌株15发酵液浓度的增加，菌株15对甜瓜根腐病的防治效果越高，随着灌根次数的增多，其防治效果也越好。灌根3次后，1.0×109cfu/ml浓度的处理防治效果最好，与1.0×107cfu/ml～1.0×108cfu/ml无显著差异，与1.0×106cfu/ml有显著差异，因此推荐浓度为1.0×107～1.0×109cfu/ml，其3次灌菌后的防治效果为32.3％～41.2％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波市农业科学研究院
<120> 一种芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
taccttgtta cgactt 16

Claims (10)

1.一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)15，其特征在于，所述芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNo.19003。
2.一种芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌菌剂包括权利要求1中所述的芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌菌剂为液体制剂或固体制剂。
4.根据权利要求2所述的芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌菌剂中芽孢杆菌的活菌数为106～109CFU/mL。
5.权利要求1所述芽孢杆菌或权利要求2所述的芽孢杆菌菌剂在防治番茄青枯病中的应用。
6.权利要求1所述芽孢杆菌或权利要求2所述的芽孢杆菌菌剂在防治甜瓜根腐病中的应用。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌还能应用于防治黄瓜枯萎病。
8.权利要求1所述芽孢杆菌或权利要求2所述的芽孢杆菌菌剂在防治西瓜枯萎病中的应用。
9.根据权利要求5～8任意一项所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌或芽孢杆菌菌剂施用浓度为106～109CFU/mL，所述芽孢杆菌或芽孢杆菌菌剂的施用量为25～35mL/株。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述芽孢杆菌或芽孢杆菌菌剂的施用方法为灌根。
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